方法論記事

LEXYおよびLINuSオプトジェネティクスツールと自動画像解析を使用して、生細胞の核細胞質輸送ダイナミクスを定量化します

DOI：

10.3791/68585

⸱

2025年7月22日

 , 
1Institut de Génétique Humaine (IGH), Université de Montpellier, CNRS, UMR9002

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルでは、オプトジェネティクスツールによる核細胞質輸送の追跡から得られた生細胞イメージングデータの自動解析を効率的にセットアップし、実行する方法について説明します。

要約

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核細胞質輸送(NCT)は、細胞の恒常性を維持するために不可欠であり、その破壊は神経変性疾患や筋萎縮性側索硬化症など、さまざまな疾患に関与しています。このことから、NCTをモニタリングし、定量化するためのツールを開発する必要性が浮き彫りになっています。これらのツールの中で、高速で可逆的なオプトジェネティクスプローブであるLEXY(光誘導性核エクスポートシステム)とLINuS(光誘導性核局在化シグナル)は、生細胞におけるNCTダイナミクスの測定を可能にします。

オリジナルの論文では、生細胞イメージングにおけるLEXYおよびLINuSコンストラクトのトランスフェクション時に、核および細胞質ゾルの蛍光プローブシグナルの手動セグメンテーションおよび定量について説明しています。しかし、トランスフェクションと手動セグメンテーションはどちらも、解析可能な細胞の数を制限し、ユーザーに依存する可能性のあるエラーのために不正確になる可能性があります。オプトジェネティクスが提供する高速性と可逆性は、原則として、NCTダイナミクスの変化を検出する際に高い感度を可能にするはずですが、それは十分な数の細胞の取得パラメータと分析に依存します。

そこで、安定な細胞株を作製するためのLEXYおよびLINuSを発現するレンチウイルスベクターを作製し、ライブイメージングマーカーと制御条件の試験を行い、数百の細胞を解析できる半自動画像解析パイプラインを実装しました。この解析方法は、オープンアクセスソフトウェアであるFIJIを使用し、バイオインフォマティクスの初心者でも利用でき、高度なコンピュータ設定は必要ありません。ここでは、サンプルの調製から生細胞イメージングの取得、自動解析まで、核外輸送をモニタリングするためのこれらの光遺伝学的ツールの例としてLEXYを設定するためのステップバイステップのプロトコルを提供するとともに、任意のラボで他の条件、コントロール、またはモデルにプロトコルを適応させる方法を示します。このプロトコールで使用されるすべてのプラスミドと細胞株は、科学界に公開されるため、このメソッドのアクセシビリティがさらに向上します。

概要

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核細胞質輸送(NCT)が主要な細胞経路を調節し、細胞の恒常性を維持するための重要性は、ここ数年でよく研究されてきました1。その結果、NCTのダイナミクスを研究するためのいくつかのツールが生成されました2,3,4。これらのツールの中で、2014年と2016年にそれぞれ発表されたLINuS5およびLEXY6光遺伝学的プローブは、生細胞中のNCTをモニタリングする強力な方法を提供します。これらのツールは、蛍光レポーターの誘導性エクスポート(LEXY)またはインポート(LINuS)のいずれかを追跡するように設計されており、ブルーライトへの曝露によって誘導され、可逆的です。

簡単に言うと、これら2つの小さなプローブは、植物 Avena sativa7のタンパク質フォトトロピン-1由来のLOV2ドメインの特性を利用しています。青色光がない場合、LOV2ドメインからのJαヘリックスは光ケージに入れられ、タンパク質コアに埋め込まれます。Jαヘリックスは光刺激に応答するため、青色光による照射によりコンフォメーション変化が起こり、それに続いてJαヘリックがLOV2ドメインから切り離されます。LEXYとLINuSの著者は、この光感度を使用して、それぞれLINuSとLEXYについて、核局在化信号(NLS)または核エクスポート信号(NES)をJαヘリックスに融合させました(図1)。その結果、ブルーライト照射時に核(LINuS)またはサイトゾル(LEXY)に移行するプローブが得られます。

蛍光イメージングでプローブを追跡するために、mCherry蛍光レポーターもコンストラクトに追加しました。最後に、弱いNES(LINuS用)またはNLS(LEXY用)をシステムに追加して、プローブが青色光照射前に最終的な局在化にならないようにしました。これにより、核と細胞質との間のLEXYまたはLINuSの転座が観察されるのを防ぐことができます。

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図1:LEXYプローブとLINuSプローブの図。 どちらのプローブも、光感受性LOV2ドメインに融合したmCherryタンパク質で構成されています。この2つのツールの違いは、Jαヘリックスによって隠されたシグナル伝達シーケンス、つまりLEXYのNESとLINuSのNLSにあります。また、どちらのプローブも、初期局在を制御するための弱いシグナル配列(LEXYには弱いNLS、LINuSには弱いNES)を持っています。したがって、ブルーライト照明によるシステムの活性化により、LEXYへのエクスポートまたはLINuSへのインポートが誘導され、ユーザーは核の輸出または輸入を監視できるようになります。略語:LEXY =光誘導性核輸出システム;LINuS = 光誘導性核局在化シグナル;NLS = 核局在化信号;NES = 核輸出信号。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

mCherry蛍光の局在は、核とサイトゾルの間のLEXYプローブとLINuSプローブのシャトルを報告するため、生細胞イメージングで追跡でき、ユーザーはNCTをモニターできます。LEXYおよびLINuSは、単純なプローブとして使用するだけでなく、in vitro 5,6,8,9またはin vivo10,11で目的のタンパク質の局在を制御し、研究するように操作することもできます。

LEXYおよびLINuSの出版物で提案されている定量法は、プローブの相対的な核強度を示しています。推奨される分析は手動で行われ、核とサイトゾルの関心領域(ROI)の測定に依存しています。この方法は、プローブの信号を経時的に適切に表現できますが、特に実験や条件が繰り返される場合は、非常に長くて面倒です。重要なことは、この方法は、設計されたコンパートメントのごく一部しか表されないため、精度にも欠けていることです。

ここでは、LEXYおよびLINuS蛍光シグナル定量のための新しいプロトコルを提案します。私たちは自動化技術を導入し、分析を容易にし、より高い精度を提供します。これにより、これらのツールの新規ユーザーのプロセスが容易になり、スループットが向上します。当社の定量化プロトコルは、FIJIのオープンソースのTrackMate12 プラグインという1つのインターフェースのみを使用します。特に、定量の信頼性を向上させるために、ライブイメージング対応の遠赤外DNAマーカーを使用して、訓練された畳み込みニューラルネットワークであるStarDist13で全核セグメンテーションを行い、TrackMate12でプローブの蛍光シグナルを追跡および測定しました。

取得したデータは、すぐに使用できるスプレッドシート(補足表S1)に簡単にエクスポートして、同定された各核の相対核強度を取得できます。このプロトコルでは、YooとMitchison14 のように、得られた時間経過曲線を単指数モデルに当てはめて、得られた値をグラフにプールする方法や、テストしたさまざまな条件の輸送速度を計算する方法についても説明しています。このプロトコルと解析用のスプレッドシートを使用すれば、バイオインフォマティクスのスキルが限られている場合でも、ユーザーは生細胞イメージングデータを簡単に定量化することができます。

プロトコル

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注:次のプロトコルは、LEXYのプローブで核の輸出を監視するためのものです。LINuSの調整設定の詳細については、セクション5を示します。

1. 細胞培養

注:このセクションの手順は、組織培養グレードのフードで実行する必要があります。以下に説明するステップは、DMEM(または必要に応じてフェノールレッドフリーDMEM)を使用し、培地として10%ウシ胎児血清と1%ペニシリン-ストレプトマイシンを添加して、NIH/3T3マウス線維芽細胞15 細胞株用に最適化されています( 材料の表を参照)。ただし、ユーザーはこの手順を他の細胞タイプに適応させることができます。このプロトコールは、トランスフェクションされた細胞または安定した細胞株に適しています。ただし、ディスカッションセクションで述べたように、安定した細胞株を作成することをお勧めします。

  1. 23 μg/mL のコラーゲンと 2 μg/mL のフィブロネクチンを滅菌 1x PBS でコーティング溶液を調製します。各ライブイメージングディッシュ( 材料表を参照)にコーティング溶液800 μLを加え、インキュベーターに90分間保管します。
  2. コーティングミックスを滅菌済みの1x PBSで洗浄し、培地中のライブイメージングディッシュに60,000個の細胞を播種し、翌日に取得します。
  3. 必要に応じて、使用する細胞タイプに最も適したトランスフェクション方法に従って、LEXYプラスミドで細胞をトランスフェクションします。このプロトコルに従うには、プローブと空のベクターの同時トランスフェクションを行い、LEXY:空のベクターに対して1:5の比率で効率を高めます。暗い箱またはアルミホイルで細胞を光から保護し、1日成長させます。
  4. 取得する前に、生細胞イメージングに適合する遠赤色DNAマーカーでフェノールレッドフリー培地で細胞を染色し、取得まで光から完全に保護されていることを確認してください。
    注:私たちの場合、SiR-DNA16 を1 μMで使用し、取得前に少なくとも1時間インキュベートします。
  5. 輸出を制御するには、核外輸送阻害剤であるレプトマイシンB17 を0.5 nM(軽度の輸出阻害)および1 nM(強力な輸出阻害)で使用し、取得の1時間前に細胞に適用します。

2. イメージング

注:取得は、選択した取得のパターンを作成する能力と脈動性458nmレーザー照明を備えたライブイメージング対応共焦点顕微鏡で行うことができます。イメージングは、レゾナントスキャンを備えた共焦点顕微鏡の37°Cチャンバー(5%CO2)で暗闇で行いました。セットアップは20倍対物レンズで最適化されているため、同じ視野で複数の細胞を同時にイメージングできます。イメージングシーケンスは、 図2のように3つのフェーズで構成されています。

  1. 安定相
    1. mCherry(LEXY、561 nmレーザー)および遠赤色(SiR-DNA、633 nmレーザー)シグナルを15秒ごとに1回取得し、これを10回繰り返して合計150秒の時間再生します。この時点で、LEXYの漂白やサイトゾルへの転座が観察されないことを確認してください。
      注意:この段階でシステムを青色光で照らすと、LEXYが活性化され、すぐにサイトゾルへの放出が誘導されます。
  2. イルミネーションフェーズ
    注:このフェーズは、15回繰り返される3つのステップで構成されています。
    1. 青色光 (458 nm レーザー) で、36 ms パルスを 150 回繰り返し、合計 ~5 秒間、拍動照明を行います。
    2. mCherry(LEXY、561 nmレーザー)および遠赤(SiR-DNA、633 nmレーザー)蛍光シグナルを1回取得します。
    3. 15秒間一時停止します。
  3. 回復フェーズ
    1. mCherry(LEXY、561 nmレーザー)および遠赤色(SiR-DNA、633 nmレーザー)シグナルを15秒ごとに1回取得し、25回繰り返して合計375秒。
      注:この手順はオプションであり、ユーザーがプローブのエクスポートのみを観察し、回復を観察したくない場合は削除できます。

figure-protocol-1
図2:LEXYの3つのフェーズの構成。 LEXYで核の輸出を監視するには、顕微鏡ソフトウェアで3つのフェーズを設定する必要があります。上部は、LEXYのライブセルイメージング取得に使用する構成を示しています。この構成は、シグナルが核内で安定であることを確認するための安定相、核から細胞質へのLEXYの転座を誘導する照明相、およびLEXYが核に戻るのを観察する回復相で構成されています。図の下部は、ライブセルイメージングで期待される結果を示しています。赤のmCherryは、LEXYのローカリゼーションを示しています。灰色では、SiR-DNAが細胞の核を染色します。スケールバー = 10 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. LEXYの解析

注:セグメンテーションとトラッキング分析全体は、FIJIとオープンソースのフィジープラグインであるTrackMate12を使用して行われます(必要なバージョンは 資料の表に詳しく説明されています)。

  1. FIJIをインストールしてから、StarDist13 とTrackMateプラグインをダウンロードします。プラグインをインストールするには、[ ヘルプ] |アップデート ... |更新サイトを管理し 、 CSBDeep、 StarDist、 およびTrackmate-StarDistにチェックを入れて、 変更の適用をクリックします。フィジーを再起動します。
  2. 顕微鏡の中には、各取得フェーズ(安定照明-回復)をまとめて取得できるものもあれば、参照された共焦点顕微鏡など)で別々に保存できるものもあります。したがって、この設定を使用する場合は、フェーズを連結する追加の手順があります:3つのシーケンスの画像を開き、 concatenate 関数を実行して3つのタイムラプスフェーズを1つのファイルにコンパイルします: Image |スタック |ツール |連結...。
  3. 安定フェーズを Image1 として、照明フェーズを Image2 として、回復フェーズを Image3 として選択します。得られた画像は、mCherry(チャネル1)チャネルとSiR-DNA(チャネル2)チャネルをマージした3つのフェーズのタイムラプス用の1つの画像です。
  4. 取得した画像を後のセグメンテーションステップのために保持し、保存します: [ファイル]|名前を付けて保存 |ティフ...。
  5. 次の分析のためにmCherryチャネルを単独で分割します: 画像|カラー |チャンネルを分割 して保存する: [ファイル] |名前を付けて保存 |ティフ...。
  6. 取得中に最終的な漂白を確認するには、mCherryチャネルで Z軸プロファイルのプロット コマンドを実行します。 スタック |Z 軸プロファイルをプロットします。生成されたテーブルで、[ データ | 1番目の データセットをコピーし 、このプロトコルに付属のすぐに使用できるスプレッドシート(補足表S1)のZ軸プロファイルセルの下に貼り付けます。
  7. 原子核の平均サイズの円形の関心領域(ROI)を描画して保存します: Analyze |ツール |ROIマネージャー....ROIを追加して保存する: [その他] |セーブ。。。
    注:分析されたすべての条件の背景を測定するには、同じROIを使用する必要があります。
  8. タイムラプス全体を通して、保存したROIをセルのない領域に配置し、ROIインターフェース機能を使用してこのROI内の平均強度を測定します。まず、平均グレー値にチェックマークが付いていることを確認するために、 Analyze |測定値を設定します。次に、[ その他] |マルチメジャー。 50スライスすべて と スライスごとに1つの生を測定し、 OKをクリックします。
  9. 提供されたスプレッドシート(補足表S1)に表示されているすべての値をコピーして、「ROI背景」セルの下に貼り付けます。
  10. フィジーでは、mCherryチャネルのみの画像を閉じ、mCherryチャネルとSiR-DNAチャネルがマージされた以前に保存した画像を選択します。
  11. TrackMateプラグインを開きます: プラグイン|トラッキング |トラックメイト。
  12. タイムポイントの数が正しいことを確認し(提案されたフェーズに従った場合は0 〜 49 )、[ 次へ]をクリックします。
  13. StarDist検出器を選択し、[次へ]をクリックします。
  14. チャネル2(SiR-DNA)を選択して核をセグメント化し、Nextをクリックします。セグメンテーションプロセスが終了するまで数秒待ちます。取得したセグメンテーションが核の境界に対応していることを目視で確認し、[Next]をクリックします(図3)。セグメンテーションが不正確な場合は、対応する核識別子(SpotID)をメモして、ステップ3.26以降の分析から除外します。
  15. デフォルトのパラメータをそのままにして、初期しきい値設定ウィンドウで[次へ]をクリックします。このウィンドウは、50の時点のうちのセグメント化されたスポット(原子核)の数を示します。
  16. スポットにフィルターを設定する: フィルターを作成して設定します。
    1. 解析を歪める可能性のある、強度が強すぎる、または信号が弱すぎる原子核を除去するためのパラメーターとして、 平均強度 ch1 をパラメーターとする 2 つのフィルターを作成します: 1 つのフィルターは定義されたしきい値を超える値を選択し、もう 1 つはしきい値を下回る値を選択します。非常に低い信号または飽和した信号のみを削除する値を定義します。
      注:これらのフィルターは、安定した細胞株を使用する場合、必要ない場合があります。これらの値は、すべての条件に対して再適用する必要があるため、注意してください。
    2. 2つのフィルターを作成 分析から不要なオブジェクト(破片、死にかけている細胞、または分裂している細胞)を削除する 領域 :1つは定義されたしきい値を超える値を選択するフィルター、もう1つはしきい値を下回る値を選択するフィルターです。 [次へ]をクリックします。
      注: すべての条件に対してこれらの値を再適用します。
  17. トラッカーの選択: Simple LAPトラッカー を選択し、 Nextをクリックします。
  18. トラッキングのパラメータを選択します。 リンクの最大距離 (ここでは 30μm)-フレーム間でオブジェクトにリンクできる最大距離を調整します。 [Gap-closing max distance ] (ここでは 15 μm) と [Gap closing max frame gap ] (ここでは 3) を使用して、この同じトラックを除外せずに 1 つのトラックを省略できるスポットの数を定義します。 [Next](次へ )をクリックします(図3)。
    注:これらの提案されたパラメータは、試行錯誤のアプローチを使用してセットアップとセルラーモデルに最適化されており、実験的に調整する必要があるかもしれません。
    リンクの最大距離は、特に細胞が大きく動く場合は、ある核から別の核へのミストラッキングを防ぐために調整する必要があります。
  19. 計算後、[ 次へ ]をクリックして、トラックにフィルターを設定します。全時間経過(提案されたシーケンスの50時点)で追跡された原子核のみを選択するには、トラック内のスポットの最大数を選択します(提案されたシーケンスの 49を超える 位置にカーソルを置きます)。 [次へ]をクリックします。
    注:これにより分析が容易になりますが、十分な原子核が全時間にわたって追跡されている場合にのみ可能です。
  20. 表示オプション:スポット 名を表示する にチェックを入れると、さらなる分析で各核を遡ることができます。ユーザーの好みに応じて表示される機能をカスタマイズします。
  21. ページの下部にある[ トラック]|CSVにエクスポート して、すべての測定値を含むテーブルを保存します。テーブルを閉じて、[ 次へ]をクリックします。
  22. 必要に応じて、 T (時間) を X 軸 、 ch1 の平均強度 を Y 軸として、トラックの特徴をプロットします。 プロット特徴量をクリックします。グラフを閉じて、[ 次へ]をクリックします。
    注:これにより、ユーザーはエクスポートの一般的な傾向を把握できます。この時点では、背景と初期強度に正規化されていません。
  23. 「Capture overlay as action」をクリックし、「Execute |わかりました。生成された画像は、定量化された核を特定するために使用されます。保存:ファイルに移動|名前を付けて保存 |ティフ...。
  24. スプレッドシート ファイルで、TrackMate で取得した CSV ファイルをインポートします: [データ ] タブの [データの取得と変換] グループで、[ テキスト/CSV から ] をクリックして [インポート] をクリックします。
  25. 対応する文字をクリックして次の4つの列全体を選択し、提供されたスプレッドシート(補足表S1)の上部、列AからDにコピーして貼り付けます: スポットID(B)、トラックID(C)、フレーム(I)、平均強度ch1(M)。
    注: 貼り付けたメジャーの先頭が 、補足表 S1 の 6 行目から始まることを確認します。そうでない場合は、測定値が 1 つ以上のセルからシフトされるため、正しくない可能性があります。 補足表 S2 のスプレッドシートを参照して、予想される処置の例を確認してください。
  26. セル B5 の矢印をクリックして TrackID (個々の核) で結果をアルファベット順に並べ替え、セル C5 の矢印をクリックしてフレーム (時点) で並べ替えます。
  27. バックグラウンドノイズを除去するには、ステップ3.8で取得した値を、平均強度ch1で取得した各値から減算します(付属のスプレッドシートで事前に計算されており、 補足表S1を参照)。
  28. LEXYのシグナルを正規化するには、安定位相(フレーム0〜9)におけるmCherry蛍光シグナルの平均強度を計算します。次に、平均強度ch1で得られたすべての結果を安定相の平均強度で割ります(付属のスプレッドシートで事前に計算されており、 補足表S1を参照)。
    注:得られた数値は、LEXYの平均核蛍光強度です。すべての測定値は、列Lから核ごとにすでに表示されており、グラフにプロットできます。

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図3:FIJIを使用したTrackMate解析。 上はTrackMate分析の概略図、下はFIJI分析から取得した画像です。左の最初の図は、核のマーカーであるセグメント化されていないSiR-DNA染色を灰色で示しています。2番目のパネルは、StardistがSiR-DNAチャネルを使用して行った自動セグメンテーションを示しています。核は、mCherryチャネルの強度に応じて色分けされ、視覚化と最終ステップを容易にします。3番目のパネルは、全ライブセルイメージングシーケンスの時点におけるSiR-DNA染色を追跡することによって得られたトラックを示しています。右側の最後のパネルは、セグメンテーションによって定義された領域内のLEXYの蛍光シグナルを赤で示し、各時点で測定されます。スケールバー= 50 μm この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. 輸送速度、統計、数値

  1. 相対核強度グラフをプロットします。
    1. GraphPadPrismを開き、シートを作成します:新しいテーブルにデータを入力またはインポートをクリックし、オプションでXの経過時間とYのサイドバイサイドサブカラムの複製値のセグメント化された核の最大数を選択します。[作成]をクリックして、取得したデータをテーブルに貼り付けます。
    2. X値(時間)については、取得のパラメータが提案どおりに保持されている場合は、提供されたスプレッドシートの「時間」の下の列をコピーして貼り付けます。それ以外の場合は、使用するパラメータに従って値を調整します。
    3. 相対核強度のグラフを作成するには、[グラフ]セクションに移動します。グラフ ファミリとして XY を選択し、グラフ タイプとしてポイントとエラー バー付き接続線を選択します。
    4. プロットセクションで、平均値、誤差、およびSEMを選択し、OKをクリックしてグラフを表示します。選択したパラメータに応じてスケールとビジュアルを変更します。
  2. 相対核強度を単指数モデルに当てはめます。
    1. [データ テーブル] セクションで、[新しいデータ テーブル] をクリックします。
      1. 「X 値を X として入力」を選択し、各ポイントに対して 1 つの Y 値を Y として入力してプロットし、「作成」をクリックします。
      2. [X] 列には、安定フェーズと照明フェーズの時間のみを小数で報告します。取得の推奨パラメータが保持されている場合は、提供されたスプレッドシートの補足表S1の「10進数」の下の列をコピーして貼り付けます。
      3. 相対核強度として得られた値を、安定相と照明相のみの表に貼り付けます。
      4. [結果]セクションで、次の解析を選択します。 XY 解析 |指数関数 |非線形回帰(カーブフィット)をクリックし、OKをクリックします。
      5. パラメータで、モデルとしてプラトーとそれに続く1つの位相減衰を選択し、制約パラメータで、X0(照明の開始時間)として2.25に等しい定数、Y0(照明開始時の相対核強度)として1に等しい定数、プラトーに等しい定数(相対核強度が傾くべき値)を選択します。 また、K (エクスポートレート) が 0 より大きくする必要があることを示します。他のパラメータはデフォルトのままにします。[OK]をクリックします。
      6. [Results] セクションの [K] 行は、試験条件の核のすべてのエクスポート率を示します。
      7. 必要に応じて、他の条件についても 手順 4.2.1 から 4.2.1.5 を繰り返します。
  3. エクスポート率グラフを作成します。
    1. 新しいテーブルを作成する: [X 値を X として入力] を選択し、各ポイントの 1 つの Y 値を Y として入力してプロットし、[作成] をクリックします。
    2. 各条件 (列) について、前の手順で取得した K 値を貼り付けて転置します。
    3. エクスポートレートのグラフを作成するには、グラフセクションに移動し、グラフファミリとして列を選択し、ボックスとバイオリンセクションで、グラフタイプとしてバイオリンプロットを選択し、バイオリンプロットを使用します。すべての点をプロットとして表示します。[OK]をクリックしてグラフを表示します。必要に応じて、データの表現方法をカスタマイズします。
    4. エクスポート率の統計的検定を実行するには、Yoo と Mitchison14 で説明されているように、次の手順に従って両側ウェルチの t 検定を実行します。
      1. すべての条件のエクスポートレートを含むテーブルで、 Analyze |グループ比較 |T検定(およびノンパラメトリック検定)で、検定する条件を選択し、 OKをクリックします。Tick Unpaired、Yesはパラメトリック検定を使用し、 Unpaired t test with Welch's correctionを使用します。SDが等しいと想定せず、[ OK]をクリックします。
    5. [結果] セクションのテーブルで分析結果を確認し、必要に応じてエクスポート率グラフでレポートします。

5. LINuSへの適応

注:上記のプロトコルは、以下の変更を適用することにより、LINuSによる核輸入のモニタリングに容易に適合させることができます。

  1. 細胞培養
    1. ステップ1.5のレプトマイシンBの代わりに、核阻害剤としてインポータゾール18 を使用し、取得前に10μMの濃度で1時間過ごします。
  2. イメージング
    1. システムを最適にインポートするには、ステップ 2.2.1 の 458 nm レーザーによる 36 ms パルスの 150 回の繰り返しを、合計 ~9 秒で 250 回の繰り返しに置き換えます。
      注:配列のタイミングは細胞タイプに依存することができ、システムは細胞タイプ特異的であるNLSおよびNESの認識に依存するため、両方のプローブのパラメータを最適に調整する必要があるかもしれない19,20。
  3. 輸送速度、統計、および数値
    1. ステップ 4.2.1.5 で Plateau に続いて 1 つの位相減衰に曲線を適合させる代わりに、 Plateau に続いて 1 つの位相の関連付け 解析を選択します。
    2. X0 を 2.25 に、Y0 を 1 に、K (LINuS の場合のインポート レート) を 0 より大きい値に制約します。
      注:TrackMateを使用したLINuSの分析は、LEXYの分析と同じです。相対核強度は依然として測定および分析された値ですが、プローブの輸出による減少を観察する代わりに、青色光照射後の原子核内の蛍光シグナルの濃縮を観察する必要があります。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

上記のプロトコルにより、ユーザーは、生細胞イメージングにおける取得中にプローブの局在化および転座を視覚化できるはずです。LEXYで核の輸出を視覚化するために取得される予定の画像の例を 図4に示します。核からのシグナルの急速な減少とサイトゾルの濃縮は、ブルーライト照明を数回行った後に観察されるべきです。プローブの信号の漸進的な回復は、照明サイクルを停止した後に見ることができます。このシステムを制御するために、輸出阻害剤であるレプトマイシンBは、青色光照射時にLEXYが輸出されるのを防ぐため、分析によって輸出の変化を可視化できることを証明しています(図4)。

figure-results-1
図4:LEXYのシグナルの経時的な視覚化。 生細胞イメージングで取得した、安定期、照明期、および回復期の代表的な時点のキャプチャ。メタノール条件は制御条件を表します。脈動性の青色光が赤色で照射されると、LEXYの位置を示すレポーターであるmCherry蛍光シグナルが核から細胞質に移されます。照明を停止した後、信号は原子核内で回復します。輸出阻害剤であるレプトマイシンBを1 nMまたは0.5 nMで投与すると、輸出がブロックされた場合、LEXYの輸出が存在しないか減少することが示されています。スケールバー = 30 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

解析に関しては、安定期の相対核強度曲線の値は1程度であるべきですが、青色光の活性化後は、照明期の終わりにプラトーに達するまでゆっくりと減少するはずです(図5A)。減少が速すぎるか遅すぎる場合は、取得パラメータを最適化できます(説明を参照)。十分な濃度でのレプトマイシンB処理は、分析と技術が核の輸出が完全にブロックされ、実験全体で相対的な核強度値が約1で安定していることを示すのに十分な感度であることも確認できます。ただし、中程度のレプトマイシンB濃度は、軽度の核外輸送を示すはずです(図5A)。これらの目視観察は、輸出率の取得とともに定量的に確認する必要があります(図5B)。

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図5:LEXYの予想相対核強度と輸送速度(A)グラフは、LEXYの蛍光シグナルの経時的な相対核強度を表しており、安定相のmCherry平均強度に正規化されています。メタノール(コントロール、赤)条件の相対核強度は、輸出阻害剤レプトマイシンBで処理された細胞とは対照的に、0.5nM(水色)または1nM(濃色)の濃度で、照明後に半分に減少します。エラーバー:SEM.(B)曲線を単指数モデルに適合させることによって得られた、コントロールおよびレプトマイシンB条件のエクスポート率。レプトマイシンBによって輸出がブロックされたときに得られる値は、制御条件よりも大幅に低くなっています。N=メタノール(赤)は18細胞、レプトマイシンBは19細胞0.5nM(水色)、レプトマイシンB1nM(紺色)は15細胞です。P値は、両側ウェルチのt検定によって計算されました。: P < 1×10−4, ****: P < 1×10−5.この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足表 S1: 事前定義された計算を含むスプレッドシート。 このスプレッドシートは、分析を容易にするために提供されています。TrackMateで取得した強度値は、直接コピーしてスプレッドシートに貼り付けて、正規化された相対核強度値を取得できます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S2:LEXYの分析の制御条件で期待される結果の例。 このスプレッドシートは、LEXYの安定細胞株の制御条件で得られた値の例を示しています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

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プロトコルに記載されているように、安定した細胞株の作成により、分析の品質が大幅に向上します。まず、プローブを発現する細胞が100%あると、追跡および分析される核の数が増加し、分析の堅牢性が強化されます。次に、プローブの過剰発現と使用されるトランスフェクション試薬の毒性によって引き起こされる細胞死を減少させます。そして最後に、細胞間の蛍光シグナルの強い不均一性を低減します。飽和した信号では、照明後の強度の変化を適切に検出できないため、このパラメーターは重要です。弱いシグナルについても同じ結論が当てはまり、漂白したり、差の定量化ができなかったりする可能性があります。したがって、まずトランスフェクションでプローブを試験して適切に機能することを確認し、取り込みパラメータを設定してから、安定した細胞株を迅速に作製することをお勧めします。LEXYプローブとLINuSプローブの両方に対応するレンチウイルスベクターを作成し、ご要望に応じて共有できるようにしています。また、これらのレンチウイルスを使用して作成したNIH/3T3 LEXYまたはLINuS安定株も作成しています。

実験の成功を保証するための重要なパラメータは、細胞を暗闇に保つことです。プローブが青色光に反応するため、ユーザーは、取得前に少なくとも30分間、暗闇での細胞の輸送を確保する必要があります。小さな閉じた箱、または皿を覆うためにアルミニウムを使用するだけで十分です。同様に、顕微鏡で細胞を検索するためにmCherry光のみを使用することには、青色光による照明が細胞を活性化するため、非常に注意する必要があります。最終的に顕微鏡下で照明が発生する場合は、取得のために別の離れたフィールドを探します。ステップ3.6でZ軸プロファイルをプロットすると、細胞が照明の影響を受けたかどうか、曲線がプラトーではなく減少しているかどうかを知るのに役立ちます。

イメージングシーケンスは、3つのフェーズで構成されるように設定されています。まず、安定期は、潜在的な漂白を評価するだけでなく、LEXYの局在が活性化せずに安定していることを確認するためのものです(1)。次に、核から細胞質へのLEXYの転座を誘導するための、脈動性青色光照射のラウンドからなる活性化フェーズです(2)。最後に、オプションの回復フェーズでは、信号が徐々に核内の初期位置に戻ります(3)。

取得について記載された配列は、細胞型特異的であり得る19,20。最初の実験では、レーザー出力とタイミングをテストおよび変更して、システムが核と細胞質の間を徐々に移動することを確認する必要があります。重要なことは、レーザー出力が強すぎると、一時停止が短すぎると、進行性の転座が見られず、代わりに照明後のmCherry強度の残酷な低下/濃縮(使用するプローブによって異なります)が見られることです。

配列の最適化で問題が解決されない場合は、NESおよび/またはNLSが使用される細胞タイプに適していない可能性があります。ユーザーは、プローブを設計および変更するために、LINuS法の記事8 を参照できます。また、落射蛍光顕微鏡によるLINuSのイメージングについては、こちらの記事も参考にしてください。

核のセグメンテーションは、解析の重要なステップです。頑健で信頼性の高い核マーカーは、プローブのライブセルイメージングに使用する必要があります。青色光による照明はプローブの転座を活性化し、プローブはmCherry蛍光タンパク質でモニタリングされるため、このマーカーは遠赤スペクトルまたは近傍で見える必要があります。私たちの場合、インキュベーションの1〜~24時間で細胞を染色するSiR-DNAを使用しますが、SPY-DNA 650を使用することもできます(参照については、材料の表を参照)。

最後に、StarDistによるセグメンテーションとTrackMateのフィルタリングされたトラッキングの組み合わせがその効率を証明した場合、ユーザーは常にセグメンテーションと定量化の結果を視覚的に確認する必要があることに注意することが重要です。分裂中または死にかけている細胞は定量に含めることができますが、そうすべきではありません。このような事象の分析のリスクを軽減するために、提供されたExcelシートには、相対的な核強度(青=低い値、赤=高い値)に色分けが付けられています。GraphPad Prismで値をプロットする前に色を調べることで、ユーザーは異常な値に気付くことができるはずです。例えば、LEXYの相対核強度は、安定期の高(赤く、原子核内のプローブの量が強い)から、照明期の終わりに低い(青、原子核内のプローブの量が減少)まで変化し、回復期( 補足表S2を参照)で高い値(赤)に戻る必要があります。

このプロトコルは、以前に提案された方法5,6に比べてさまざまな利点を提供します。この半自動パイプラインは、LEXYおよびLINuSの核細胞質輸送の解析を容易にし、以前に提案されていた手動定量よりも高い精度を提供します5,6。当社のプロトコルを使用すると、この分野の初心者が効率的な分析を行うことができるだけでなく、核細胞質輸送の半自動分析を行うために1つのオープンアクセスインターフェースのみを必要とする経験豊富なユーザーにも新しいツールが提供されます。

この方法は、NIH3T3細胞株における全球核細胞質輸送速度の研究よりも、さらなる応用に使用することができます。実際、いくつかの最適化ステップを踏むことで、さまざまな細胞タイプや生きた動物におけるプローブの輸送速度の研究に適合させることができます8。さらに、目的のタンパク質をLEXYまたはLINuSに融合させることで、その輸送速度や、光による核内外への転座の下流への影響を研究することも可能です。例えば、LEXYを用いて細胞質内のタンパク質を隔離したり、LINuS 5,6,21,22,23を用いてその核内への局在化を強制することが可能です。最後に、記載されている解析は、LEXYやLINuSよりも多くのアプリケーションに拡張して、セグメント化可能な細胞内コンパートメント間を移動するシグナルを追跡することもできます。

開示事項

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著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

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フランス国立研究機関(ANR-24-INBS-0005 FBI BIOGEN)の支援を受けた国家インフラFrance-BioImaging(https://ror.org/01y7vt929)のメンバーである画像施設MRI、特に顕微鏡の設定とFIJI分析に協力してくれたMarie-Pierre Blanchard氏、Julio Mateos-Langerak氏、Baptiste Monterroso氏に感謝します。私たちは、Boumendil研究室のメンバーの皆さんのアドバイスと実りある議論に感謝しています。特に、プロジェクトの開始に際してくださったParisa Nobari氏に感謝しています。原稿の校正をしてくれたJoey Dufourdに感謝します。

CBグループでの研究は、国立科学研究センター(CNRS)、国立がん研究所(フランス国立がん研究所)/Canceropole Grand Sud-Ouest(Grant Emergence 2023 E07)、国立科学研究センター(ANR-23-TERC-0015-01およびANR-21-CE12-0039)、国立がん研究所(Grant INCa PLBIO23-207-2023-180)、モンペリエ大学(プログラムI-SITE、 France 2030, project NAChO, project ChOICe)。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
コラーゲンシグマ・アルドリッチ08-115
共焦点顕微鏡ライカSP8
DMEMのギブコ31966021
秀でるマイクロソフト
FBSのシグマ・アルドリッチF7524
フィブロネクチンシグマ・アルドリッチF1141
FIJIソフトウェアフィジーイメージJ 2.16.0/1,54p;Java1.8.0_322
フッ素ディッシュダッチャーFD3510-100代替:Attofluorチャンバー(Invitrogen #A7816)
GraphPad プリズム 10.4.1GraphPad ソフトウェア株式会社
インポートタゾールシグマ・アルドリッチSML0341
レプトマイシンBシグマ・アルドリッチL2913
LEXYプラスミドアドジーン72655pDN122
LINuSプラスミドアドジーン61347pDN77
ペンシリン-ストレプトマイシンギブコ15140-122
フェノールレッドフリーDMEMギブコ21063-029
SiR-DNAスピロクロムSC007代替品:SPY-DNA650(スピロクロム #SC501)
Stardist 2DプラグインスターディストStarDist_0.3.0
TrackMateプラグイントラックメイトトラックメイト-7.14.0

参考文献

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  1. Wing, C. E., Fung, H. Y. J., Chook, Y. M. Karyopherin-mediated nucleocytoplasmic transport. Nat Rev Mol Cell Biol. 23, 307-328 (2022).
  2. Kelley, J. B., Paschal, B. M. Fluorescence-based quantification of nucleocytoplasmic transport. Methods. 157, 106-114 (2019).
  3. Crefcoeur, R. P., Yin, R., Ulm, R., Halazonetis, T. D. Ultraviolet-B-mediated induction of protein-protein interactions in mammalian cells. Nat Commun. 4 (2), 1779(2013).
  4. Beyer, H. M., et al. Red light-regulated reversible nuclear localization of proteins in mammalian cells and zebrafish. ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).
  5. Niopek, D., et al. Engineering light-inducible nuclear localization signals for precise spatiotemporal control of protein dynamics in living cells. Nat Commun. 5, 4404(2014).
  6. Niopek, D., Wehler, P., Roensch, J., Eils, R., Di Ventura, B. Optogenetic control of nuclear protein export. Nat Commun. 7, 10624(2016).
  7. Zayner, J. P., Antoniou, C., Sosnick, T. R. The amino terminal helix modulates light activated conformational changes in AsLOV2. J Mol Biol. 419 (1-2), 61-74 (2012).
  8. Wehler, P., Niopek, D., Eils, R., Di Ventura, B. Optogenetic control of nuclear protein import in living cells using light-inducible nuclear localization signals (LINuS). Curr Protoc Chem Biol. 8 (2), 131-145 (2016).
  9. Lataster, L., et al. Cell cycle control by optogenetically regulated cell cycle inhibitor protein p21. Biology. 12 (9), 1194(2023).
  10. Forlani, G., et al. Analysis of slow-cycling variants of the light-inducible nuclear protein export system LEXY in mammalian cells. ACS Synth Biol. 11 (10), 3529-3533 (2022).
  11. Inutsuka, A., Kimizuka, N., Takanohashi, N., Yakabu, H., Onaka, T. Visualization of a blue light transmission area in living animals using light-induced nuclear translocation of fluorescent proteins. Biochem Biophys Res Commun. 522 (1), 138-143 (2020).
  12. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  13. Schmidt, U., Weigert, M., Broaddus, C., Myers, G. Cell detection with star-convex polygons. Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention - MICCAI 2018. Frangi, A. F., Schnabel, J. A., Davatzikos, A. F., Alberola-López, C., Fichtinger, G. , Springer International Publishing. Cham. 265-273 (2018).
  14. Yoo, T. Y., Mitchison, T. J. O-GlcNAc modification of nuclear pore complexes accelerates bidirectional transport. J Cell Biol. 220 (7), e202010141(2021).
  15. Jainchill, J. L., Aaronson, S. A., Todaro, G. J. Murine sarcoma and leukemia viruses: assay using clonal lines of contact-inhibited mouse cells. J Virol. 4 (5), 549-553 (1969).
  16. Lukinavičius, G., et al. SiR-Hoechst is a far-red DNA stain for live-cell nanoscopy. Nat Commun. 6, 8497(2015).
  17. Kudo, N., et al. Leptomycin B inactivates CRM1/exportin 1 by covalent modification at a cysteine residue in the central conserved region. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (16), 9112-9117 (1999).
  18. Soderholm, J. F., et al. Importazole, a small molecule inhibitor of the transport receptor importin-β. ACS Chem Biol. 6 (7), 700-708 (2011).
  19. Henderson, B. R., Eleftheriou, A. A comparison of the activity, sequence specificity, and CRM1-dependence of different nuclear export signals. Exp Cell Res. 256 (1), 213-224 (2000).
  20. Lu, J., et al. Types of nuclear localization signals and mechanisms of protein import into the nucleus. Cell Commun Signaling. 19 (1), 60(2021).
  21. Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), dev175067(2019).
  22. Kögler, A. C., et al. Extremely rapid and reversible optogenetic perturbation of nuclear proteins in living embryos. Dev Cell. 56 (16), 2348-2363 (2021).
  23. Zhang, W., et al. Hitchhiking of Cas9 with nucleus-localized proteins impairs its controllability and leads to efficient genome editing of NLS-free Cas9. Mol Ther. 32 (4), 920-934 (2024).

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