方法論記事

海馬の p-CREB および c-fos 発現を評価するためのセボフルラン麻酔を使用した若年ラットの学習と記憶の研究方法論

DOI：

10.3791/68591

⸱

2025年9月19日

 ,  , 
1Department of Anesthesiology and SICU, Xinhua Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究では、セボフルランが若年ラットのNMDAR/p-CREB/c-fos経路を介して海馬ニューロンにおける記憶保持を損ない、p-CREBおよびc-fos発現をどのように低下させるかを調査します。結果は、セボフルランが短期記憶障害を引き起こし、シナプス可塑性マーカーをダウンレギュレートし、投与頻度に関係なく、効果が 3 日後に可逆的であることを示しています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脳発達中の認知障害の研究は、神経発達の動的な性質、方法論的制約、文脈上の障壁により課題に直面しています。この研究では、若年ラットのNMDAR/p-CREB/c-fosシグナル伝達経路を介して、海馬ニューロンにおける記憶とp-CREBおよびc-fos発現に基づいて、セボフルランによって引き起こされる発達中の脳の認知障害を研究するための統合的方法論的アプローチを調査しました。21日齢のSD雄ラット64匹(体重<80g)を5群に分けた:正常(n=8)、60%O2 (n=16)、偽トレーニング(n=8)、セボフルラン単回投与(n=16)、セボフルラン複数回投与(n=16)。2 つのセボフルラン グループは、トレーニング後 1 日 (グループ sev1a および sev1b) と 30 日後 (グループ sev30a および sev30b) の犠牲にサブグループ化されました (n=8/サブグループ)。他のすべてのラットは、トレーニングの1時間後に犠牲にされました。Y 迷路テストを使用して、学習と記憶保持を評価しました。免疫組織化学を使用して、海馬標本中の p-CREB 陽性および c-fos 陽性ニューロンの数を決定しました。60%O2 群(記憶保持率86.33%±17.52%)と比較して、sev1a群とsev1b群のラットの記憶力は有意な減少を示しました(sev1a:44.29%±11.26%;sev1b:62.42%±7.27%;すべてP<0.05)、sev1bおよびsev30b群は有意差を示さなかった(sev30a:84.41%±14.15%;sev30b:85.21%±11.61%;すべてP>0.05)。60%O2 群(c-fos:92.83 ± 7.88、p-CREB:72.22 ± 8.89)と比較して、海馬ニューロンにおけるp-CREBおよびc-fosの発現は、sev1a群(c-fos:23.13 ± 3.28、p-CREB:22.88 ± 5.18)およびsev30群(c-fos:23.22 ± 3.13、p-CREB:25.58 ± 2.26)(いずれもP<0.05)で減少したが、sev30a群とsev30b群では有意差が見られなかった(いずれもP>0.05)。セボフルランは、投与頻度に基づく影響なしに、若年ラットの記憶維持能力に短期的なマイナスの刺激効果をもたらします。セボフルランは若年ラットの海馬ニューロンにおけるp-CREBとc-fosの発現を減少させる

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脳発達中の認知障害の研究は、神経発達の動的な性質、方法論的制約、および状況上の障壁により、重大な課題に直面しています。脳の発達には急速な非線形変化が伴い、重要なウィンドウ 1,2 での障害の特定が複雑になります。リソースが少ない環境では、介護者のリテラシー、言語の多様性、特殊なツール (MRI など) へのアクセスの制限などの障壁が早期スクリーニングを妨げます1.脳の成熟における個人差により、病理学的逸脱を典型的な発達と区別することが困難になります2,3。ダウン症のような症状は皮質の発達の変化を示しますが、サンプルサイズが小さく、組織学的データが不足しているため、メカニズムの洞察が制限されます4.神経発達障害 (ASD、ADHD など) は不安やうつ病と併発することが多く、認知評価を混乱させます5.一部の集団では重度のコミュニケーション障害があるため、標準化されたテストの使用が制限されています6.これらの機能は、いくつかの研究設計上の問題につながります。実際、ほとんどの研究は断面デザインを使用しており、時間の経過に伴う個人内の変化をモデル化することができません。西洋の教育を受けた人口(「WEIRD」サンプル)に過度に依存しています7。ダウン症の研究は、死後の脳サンプルが少なく、年齢が一致した対照が不十分であることに悩まされています4.生態学的瞬間評価ツールは、日々の認知能力に影響を与える文脈変数を説明するのに苦労しています5.

動物と人間の脳の最も重要な機能には、人間の発達と生活全般の中心となる学習と記憶が含まれます8。乳児の脳は発達段階にあり、薬物や麻酔などの外的要因に対して脆弱です 9,10。麻酔薬による乳児の記憶機能への損傷は重要な臨床研究テーマであり、麻酔を実行できないため、小児患者に対する最適な治療を遅らせる可能性さえあります11。麻酔関連の認知機能障害 (または術後認知機能障害、POCD) は、乳児に長期的な影響を与える可能性があります12.セボフルランの吸入は乳児の記憶機能に影響を与える可能性があります13,14、しかし、従来の麻酔学では、乳児の脳損傷は主に麻酔中、特に全身麻酔における脳の低酸素症によって引き起こされると考えられています10。したがって、脳に短期または長期の低酸素症がない限り、乳児の中枢神経系損傷のリスクを減らす必要があります11。それでも、POCD の理解は依然として最適ではありません。手術が必要な乳児には麻酔が必要であり、関与する経路についての知識を深めることは、POCD のリスクを最小限に抑える麻酔戦略の設計に役立つ可能性があります。

心臓以外の手術を受けた高齢患者を対象とした研究では、患者の25%近くが手術後1週間以内にPOCDを経験し、その割合は3か月後に10%未満に減少したのに対し、対照群ではPOCD率が3.4%と2.8%であることが明らかになりました15。この研究では、ほとんどのPOCD症例が可逆的であり、長期または永続的なPOCDを経験した患者はごくわずかであることも示されました15。中枢神経系では、グルタミン酸は最も一般的な興奮性アミノ酸です16。N-メチル-D-アスパラギン酸受容体(NMDAR)は、長期増強(LTP)および長期抑制(LTD)の誘導と維持に不可欠です17。マウスでの研究では、興奮性シナプス可塑性が脳機能の発達に直接影響し18、NMDARの活性化とカルシウムの流入が特に重要であることが示されました19,20。NMDAR活性の強化は、シナプスの成長と可塑性の誘導に重要な意味を持ちます19,20。したがって、NMDAR拮抗薬(セボフルランなど)によるNMDAR遮断の程度が高いと、学習能力と記憶能力が低下するはずです21。成人の脳の学習と記憶に対するセボフルランの効果は明確な結論に達していませんが22,23、セボフルランは小児外科の麻酔に一般的に使用されています14。NMDARの非競合的アンタゴニストとして、セボフルランは脳の学習および記憶機能に大きな影響を与える可能性があります11,13,14,23,24。それにもかかわらず、NMDAR以外にも、他の経路とタンパク質が学習と記憶に関与しており、リン酸化cAMP応答要素結合タンパク質(p-CREB)と即時初期遺伝子c-fosが関与する記憶調節のメカニズムはより明らかになりつつあります25,26,27が、乳児と小児における最適な麻酔送達のためには、まだより良い理解が必要です。

これらの理論的枠組みに基づいて、本研究では、記憶に基づいて、記憶に基づいて、セボフルランによって引き起こされる発達中の脳の認知障害を、NMDAR/p-CREB/c-fos シグナル伝達経路を介して海馬ニューロンにおける p-CREB および c-fos 発現に基づいて研究するために使用できる統合方法論的アプローチを調査しました。この結果は、全身麻酔後の POCD と記憶障害についての理解を深めるのに役立つ可能性があります。この研究では、離乳したばかりで、ヒトの思春期初期に対応する非常に均一な体重と生理学的状態を持っていた21日齢のラットを使用しました。この重要な発達期に神経可塑性と脆弱性が高まっているため、未熟な脳の手術や麻酔によって引き起こされる認知障害を効率的にモデル化できます28,29。このため、小児手術に関連する神経認知リスクを研究し、潜在的な介入戦略を探るのに特に適しています。Y 迷路は、学習と記憶を評価するために一般的に使用される方法です30。免疫組織化学は、ニューロンやさまざまなニューロンタンパク質を研究するために一般的に使用されます。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究のすべてのプロトコルは、上海交通大学医学部新華病院の倫理委員会によって審査され、承認されました (承認番号。XHEC-C-2016-023-2)。

1. 動物とグループ化の実験概要

  1. 21日齢の雄SDラット(体重80g未満)を64匹取得する。
  2. ラットを5つのグループに分けます:正常群(n = 8)、60%O2 群(n = 16)、偽トレーニング群(n = 8)、単回投与セボフルラン群(n = 16)、および複数回投与セボフルラン群(n = 16)( 表1を参照)。
  3. ラットは、湿度50%〜60%、自然光が当たる20〜24°Cの動物施設に収容します。
  4. 十分な食料と水を提供します。
  5. すべてのプロトコルが倫理委員会によってレビューされ、承認されていることを確認します。
  6. 吸入チャンバーを準備します(セクション2.1で詳述されている 補足図S1を参照)。
  7. ノーマルグループ
    1. ラットを60%の空気に2時間さらします(セクション2.2で詳しく説明)。
    2. 露光の1日後にY迷路テストを実行します(セクション4で詳しく説明)。
    3. 行動テスト後に組織を収集します(セクション5で詳しく説明)。
  8. 60%O2 グループ
    1. ラットを60%の空気に2時間さらします(セクション2.2で詳しく説明)。
    2. 被ばくから30日後にY迷路テストを実行します(セクション4で詳しく説明)。
    3. 行動テスト後に組織を収集します(セクション5で詳しく説明)。
  9. 偽トレーニンググループ
    1. ラットを60%の空気に2時間さらします(セクション2.2で詳しく説明)。
    2. 学習と記憶に対する光と電気刺激の影響を制御するために使用されます (セクション 4 で詳しく説明します)。
    3. 行動テスト後に組織を収集します(セクション5で詳しく説明)。
  10. セボフルラン単回投与群(sev1a群)
    1. ラットを60%の空気+ 3%のセボフルランに2時間さらします(セクション2.2で詳しく説明)。
    2. 露光の1日後にY迷路テストを実行します(セクション4で詳しく説明)。
    3. 行動テスト後に組織を収集します(セクション5で詳しく説明)。
  11. セボフルラン単回投与群(sev30a群)
    1. ラットを60%の空気+ 3%のセボフルランに2時間さらします(セクション2.2で詳しく説明)。
    2. 被ばくから30日後にY迷路テストを実行します(セクション4で詳しく説明)。
    3. 行動テスト後に組織を収集します(セクション5で詳しく説明)。
  12. セボフルラン反復投与群(sev1b群)
    1. ラットを60%空気+ 3%セボフルランに1日2時間、連続7日間さらします(セクション2.2で詳述)。
    2. 露光の1日後にY迷路テストを実行します(セクション4で詳しく説明)。
    3. 行動テスト後に組織を収集します(セクション5で詳しく説明)。
  13. セボフルラン反復投与群(sev30b群)
    1. ラットを60%空気+ 3%セボフルランに1日2時間、連続7日間さらします(セクション2.2で詳述)。
    2. 被ばくから30日後にY迷路テストを実行します(セクション4で詳しく説明)。
    3. 行動テスト後に組織を収集します(セクション5で詳しく説明)。

2.セボフルラン吸入

  1. チャンバーの準備( 補足図S1を参照)
    1. ボックスの左側にある穴を60%O2 / 40%N2に接続します。
    2. 酸素供給をセボフルラン気化器に接続します。
    3. 箱の右側にある穴を麻酔器のガス分析装置に接続します。
    4. チャンバー上部の穴をガス廃棄物に接続します。
    5. チャンバーの底にあるメッシュの下に石灰を置き、脱脂綿を加えます。
    6. セットアップをヒュームフードに入れます。
    7. チャンバーの下に加熱パッドを置きます。
  2. 吸入
    1. 酸素供給とセボフルラン気化器をオンにします。
    2. 酸素流量を2 L / minに調整します。
    3. セボフルラン濃度が3.0%に達したら、チャンバー内の雰囲気を安定させるために30分間流量を維持します。
    4. チャンバーの綿側にネズミを置きます。
    5. グループ化に従ってラットをそこに置いてください(ステップ1.2を参照)。
    6. 肌の色、呼吸数、心拍数、パルスオキシメトリーを監視します。
    7. ネズミを取り除きます。
    8. ネズミを自然に目覚めさせます。
    9. ネズミをケージに戻します。

3. 実験試薬および機器

  1. 試薬調製
    1. 麻酔投与用に市販のセボフルラン 250 mL を調製します。
    2. ストック抗体を1:350で希釈して、p-CREB抗体作業溶液を調製します。
    3. ストック抗体を1:200に希釈して、c-fos抗体作業溶液を調製します。
    4. 免疫組織化学染色用のキットを組み立てます。
    5. 4%パラホルムアルデヒドを調製します。
      1. 40 gの可溶性パラホルムアルデヒド(PFA)を500 mLの高純度水を入れたガラス容器に溶解し、乳白色の懸濁液を形成するまで60〜65°Cまで磁気的に加熱および攪拌します。
      2. 溶液が透明になるまで1.0 mol / L NaOHを滴下します(pH = 7.0)。
      3. 約500 mLのPBSを加え、氷浴または冷水浴で十分に混合します。
      4. pHを再度確認し、ろ過し、最大1000mLの容量にします。
      5. 将来の使用のために4°Cで保管してください。
  2. 機器のセットアップ
    1. Y迷路を行動テストエリアに配置します( 補足図S2を参照)。
    2. 組織学的分析のための統合イメージングシステムで顕微鏡を校正します。
  3. 組織切片用の新しいブレードでミクロトームを取り付けます。
  4. 標準的な組織処理プロトコルを使用して脱水機をプログラムします。
  5. 機械メーカーの指示に従って、シーケンシャル染色槽を備えた染色機を準備します。
  6. 灌流装置をセットアップします。
    1. プラスチック包装の生理食塩水ボトルを2本使用し、下部の開口部から生理食塩水を排出し、PBSと4%パラホルムアルデヒド固定剤で満たします。
    2. ボトルを吊るし、輸液セットに接続し、輸液セットの太い針の端に三方活栓を取り付けます。

4. Y迷路と学習/記憶テスト

  1. Y迷路を組み立てる
    1. I、II、およびIIIとラベル付けされた3つの長方形のアームでY迷路をセットアップし、三角形の接合部で接続します( 補足図S2を参照)。
    2. 迷路の底に1cm間隔の電気グリッドを配置します。
    3. 迷路の壁に2cmの薄い銅ストリップを取り付けて、危険なエリアをシミュレートし、刺激信号灯を設置します。
  2. 危険なエリアと安全なエリアを定義する
    1. 領域I、II、およびIIIを16,000 V / mで通電して、危険な領域を示します(通電すると信号灯が点灯します)。
    2. 安全なエリアを示すために、帯電していない領域を赤いライトでマークします。
    3. 腕間の接合部を、ラットが感電を受ける可能性のある安全でない領域として定義します。
  3. トレーニング手順
    1. 実験の開始時に、ラットがいるエリアを安全なエリアと見なします。
    2. 2〜4分後、安全地帯に電気を流し、ラットが安全地帯に向かって移動するように促します。
    3. ネズミが安全地帯から危険区域に移動すると、感電して安全地帯に戻り、受動的な回避反応を示します。
  4. 積極的な回避反応の開発
    1. 複数回のトレーニングセッションの後、電気ショックを加えずに安全な場所のライトをオンにしてください。
    2. 照らされた安全エリアに向かうラットの動きを観察し、明暗識別条件反射(能動的回避反応)を形成します。
  5. Y迷路は、外部の気を散らすものを最小限に抑えるために、薄暗くて静かな場所に配置します。
  6. 毎日午前9:00〜11:00から午後2:00〜4:00の間にトレーニングを実施します。
  7. 実験前にラットが迷路環境に適応できるように、実験前に5分間迷路内を自由に動かします。
  8. 刺激パラメータの調整
    1. テスト中に刺激電圧(16,000 V / m)を調整して、ラットが感電後10秒以内に逃げるようにします。
    2. 安全エリア信号灯を15秒間点灯したままにしてから、オフにします。
    3. 45秒間隔で次の衝撃実験を開始します。
  9. 信号灯のシーケンスと正しい応答
    1. I、II、III、I→I→として信号灯が点灯する順序→サイクルで設定します。
    2. ラットが感電を受けた後、10秒以内に開始エリアから照らされた安全地帯に直接逃げることとして、正しい応答を定義します。
  10. ラットが10回の連続した試行のうち8回で正しい逃走反応をした場合、ラットが学習基準に達したと考えてください。
  11. 光のない腕への脱出は、誤った反応として記録します。
  12. 複数のトレーニングおよびテストセッション
    1. 複数のトレーニングとテストセッションを実行して、学習と記憶を評価します。
    2. 一定回数の試行中に正解と不正解の数を記録します。
    3. 開始領域を変更して、タスクの複雑さを増します。
  13. ラットの記憶保持能力を評価するために、間隔(例えば、トレーニング後24時間または48時間)で記憶保持を評価します。

5. 免疫組織化学

  1. ラットを麻酔する
    1. ラットを麻酔するために訓練の1時間後に10%クロラール水和物(0.4 mL / 100 g)の腹腔内注射を投与します。クロラール水和物溶液は、地域の規制に従って廃棄してください。
    2. 心臓を完全に露出させる開胸術を行う31.
  2. 麻酔ラットに生理用溶液を灌流する
    1. PBSを含む針を左心室に大動脈の方向に挿入し、止血鉗子で針を固定し、すぐにマウスの右耳介を切り開いて静脈血を放出します。
    2. 流出物が透明になり、肝臓と肺が白く見えるまで、PBSをすばやく注入します。
    3. 続いて、動物の体が硬くなり、ホルマリン固定を達成するまで、500 mLの10%ホルマリン溶液を急速かつゆっくりと注入します。
    4. ホルマリン溶液は地域の規制に従って廃棄してください。
  3. 脳を取り除く
    1. 頭蓋骨をすばやく開きます32.
    2. 半球を損傷することなく、頭蓋骨からそっと持ち上げ、基部の血管と脊髄を切断して、脳全体を取り除きます( 補足図S3を参照)。
  4. 海馬を解剖する
    1. 両側海馬を解剖します。
      1. マウスの後頭孔で、はさみで脳全体を切断します。
      2. はさみを大孔に斜めに慎重に挿入して、頭頂骨を切断します。
      3. 止血鉗子で頭頂骨の両側をこじ開けます。
      4. はさみを使って片側の視神経を切断し、頭蓋骨の付け根まで探ります。
    2. 海馬を10%ホルマリン溶液に12時間入れます。
    3. スクロースの勾配(10%、20%、30%)を含むホルマリンに検体を浸します。
    4. 検体組織が底に沈むまで4°Cで一晩保管します。
  5. 試験片の埋め込みと切断
    1. 標本をパラフィンに埋め込みます。ホルマリン溶液は地域の規制に従って廃棄してください。
    2. 埋め込まれた試験片を4μmに切断します。
  6. 切片の脱パラフィンと再水和
    1. 切片を50 mLのキシレンに3回浸して脱パラフィン化し、毎回15分間浸します。
    2. 50 mLの100%、90%、70%、および50%エタノールにそれぞれ10分間順次浸漬します。
    3. 50 mLの0.01 mM PBSで3回、それぞれ3分間すすぎます。
  7. 抗原検索
    1. 切片を50 mLのクエン酸緩衝液(PBS、pH 6.0)に入れます。
    2. ステンレス鋼の圧力鍋でセクションを120°Cに加熱します。 セクションをラックに置き、バッファーに完全に浸します。炊飯器を密閉し、加熱し、高圧下で3分間維持します。
    3. 炊飯器を火から下ろし、室温で自然冷ましてから蓋を開けます。
    4. PBS(pH 7.2)で切片を2分間すすぎ、3回繰り返します。
    5. 約100〜200 μLの3%H2O2 をスライド上のセクトギオンを覆い、室温で5〜10分間インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼ活性を除去します。
    6. PBSで2分間、3回すすいでください。
  8. 一次抗体のインキュベーション
    1. 200 μLの一次抗体(0.01 mol/L PBSで1:150に希釈)を切片に加えます。
    2. 4°Cで一晩インキュベートします。
  9. 二次抗体インキュベーション
    1. PBSで切片を3分間、3回すすぎます。
    2. 切片を約100〜200 μLのポリマーヘルパーでインキュベートしてスライド上の切片を覆い、37°Cで20分間インキュベートします。
    3. 切片を0.1 mol/L PBSで2分間、3回すすぎます。
    4. 約100〜200 μLのポリペルオキシダーゼ抗マウス/ウサギIgGを加え、37°Cで20分間インキュベートします。
    5. PBSで切片を3分間、3回すすぎます。
  10. 発色
    1. 発色のために約100〜200 μLのジアミノベンジジン(DAB)溶液(スライドのセクションを覆うのに十分)を加えます。
    2. 約3分間反応させます。
  11. 対比染色と取り付け
    1. 約100〜200 μLのヘマトキシリンを滴下添加して、各スライドのセクションを完全に覆うことにより、対比染色を実行します。
  12. セクションを脱水して取り付けます
    1. 50%、70%、90%、および100%エタノール50 mLでそれぞれ10分間切片を脱水し、続いて50 mLのキシレンを10分間脱水します。
    2. 標準的な手順を使用してセクションをクリアして取り付けます。
  13. 顕微鏡検査
    1. 各グループの海馬におけるp-CREB-およびc-fos陽性ニューロンの数を数えます33,34。
    2. 切片を顕微鏡で400倍の倍率で調べます。
    3. 動物ごとに3つのセクションからのカウントに基づいて、各スライスの陽性ニューロンの平均数を重複せずに記録します。
      注:すべてのデータはコンピュータースプレッドシートにまとめられています。すべての分析は、統計ソフトウェアを使用して実行されました。結果は、平均の標準誤差 (SEM) ±平均として提示され、SNK-q および Dunnett T3 事後検定35 による一元配置分散分析を使用して分析されました。SNK-q 検定は探索的研究に一般的に使用され、複数のサンプル平均間のペアワイズ比較に適しています。事前定義された仮説に依存しないため、すべてのグループ平均36 を比較するのに理想的です。ダネット T3 検定は通常、事前定義された仮説による確認研究に使用されます。これは、複数の治療群を対照群と比較すること、または特定の専門的意義を持つ手段を比較するのに適している35,37。ANOVA 検定の P 値が 0.05 ≤場合、ペアワイズ事後検定を実行して、どのグループが他のグループと有意に異なるかを判断しました。両側 P 値 < 0.05 は統計的に有意であると見なされました。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究のデータを例示として使用し、代表的な免疫染色画像やさまざまなグループからの行動および分子データなど、この方法論的フレームワークで生成できる結果の種類を紹介しました。生物学的重要性の解釈を提供するのではなく、このアプローチによって生み出される典型的な結果または期待される結果を提示することに重点が置かれています。

ラット各群の学習・記憶試験結果
実験群は、60% O2 グループと比較されました。セボフルラン単回投与群(sev1a)および複数回投与セボフルラン群(sev1b)のラットの記憶、すなわち、試験の1時間後に死落したラットは有意な減少を示し(すべて P < 0.05)、試験の3日後に死落したラットは有意差を示さなかった(すべて P > 0.05)(表2)。

ラットの海馬におけるc‐fosおよびp‐CREBタンパク質の発現
正常群のラット...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究では、セボフルランが記憶にどのように影響し、若年ラットのNMDAR/p-CREB/c-fosシグナル伝達経路を介して海馬ニューロンのp-CREBおよびc-fos発現を調節するかを調査しました。この結果は、セボフルランが幼年ラットの記憶維持能力に短期的(3日後ではなく訓練後1時間)の負の刺激効果を示唆しており、投与頻度(単回投与または7日間で7回投与)に基づく影響はありませんでした。セボフルランは、訓練後1時間で若年ラットの海馬ニューロンにおけるp-CREBおよびc-fosの発現を有意に減少させた。

この研究では、学習と記憶を研究するための統合方法論の概念実証として、セボフルランと学習および記憶保持との関係を調査しました。Ca2+は、NMDA受容体(NMDAR)または電位依存性カルシウムチャネルを介して細胞に侵入し、その後、複数のシグナル伝達経路を介して、c-fosやp-CREBなどのさまざまな即時初期遺伝子(IEG)の転写を引き起こします13

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、宣言すべき競合する利益は存在しないと報告している。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ye Jiang と Guohui Li が研究を設計しました。Ye Jiang と Lai Jiang はデータを収集して分析し、原稿を作成しました。Ye JiangとGuohui Liが原稿を修正しました。すべての著者が原稿の最終版をレビューし、提出することを承認しました。この研究は、上海浦江プログラムからのGuohui Liへの助成金(助成金番号23PJD057)によって支援されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
実験動物
Sprague-Dawley (SD) ラッツチャールズ・リバー研究所(中国・北京)該当なし生後21日, オス
スタンダード ラット チャウKeao Xieli Feed(中国・北京)該当なし標準的な実験動物の食事
<強>薬品・試薬
クロラール水和物Sinopharm Chemical Reagent (中国・上海)80113818終末灌流用麻酔薬
クエン酸緩衝液(10x)ZSGB-BIO (中国・北京)ZLI-9064抗原回収液、pH 6.0
エタノール(100%)Sinopharm Chemical Reagent (中国・上海)100092683組織学用脱水剤
ヘマトキシリン染色液Baso Diagnostics Inc.(中国、珠海)BA-4041IHC用対比染色
過酸化水素(H2O2)Sinopharm Chemical Reagent (中国・上海)10011218内因性ペルオキシダーゼを遮断するための3%溶液
ニュートラルバルサムソーラービオ(中国・北京)G8590スライド用封入媒体
窒素(N2)Shanghai Medical Gas Co.(中国・上海)該当なし高純度, 混合ガス用
酸素(O2)Shanghai Medical Gas Co.(中国・上海)該当なし医療グレード, 混合ガス用
パラフィンライカ・バイオシステムズ(ドイツ・ヌスロック)39601006組織包埋培地
パラホルムアルデヒド(PFA)シグマ・アルドリッチ(米国ミズーリ州セントルイス)158127組織灌流および固定用固定剤
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)Gibco(米国マサチューセッツ州ウォルサム)7001104410x原液、pH 7.4
セボフルランAbbVie Inc.(米国イリノイ州ノースシカゴ)該当なし吸入麻酔薬
ソーダライムW. R. Grace and Co. (米国メリーランド州コロンビア)22-01-0010吸入チャンバー用CO2吸収剤
水酸化ナトリウム(NaOH)Sinopharm Chemical Reagent (中国・上海)10019818PFA溶液のpH調整に使用
蔗糖サンゴンバイオテック(中国・上海)A502693脳組織の凍結保護に使用
キシレンSinopharm Chemical Reagent (中国・上海)10023418組織学用透明剤
抗体およびキット
c-Fos抗体アブカム(英国、ケンブリッジ)アブ190289ウサギ抗マウス、一次抗体
DAB発色剤キットZSGB-BIO (中国・北京)ZLI-9018HRP発色用基材
p-CREB (Ser133)抗体細胞シグナル伝達技術(米国マサチューセッツ州ダンバース)9198ウサギ抗マウス、一次抗体
ポリマーHRP検出キットZSGB-BIO (中国・北京)PV-9000IHCの二次抗体および検出システム
Equipment
麻酔器RWDライフサイエンス(中国・深セン)R500混合ガス供給の制御用
自動ティッシュプロセッサーライカ・バイオシステムズ(ドイツ・ヌスロック)ASP6025自動脱水・清掃用
クライオスタット/ミクロトームライカ・バイオシステムズ(ドイツ・ヌスロック)CM1950凍結/埋め込み脳組織の切片化用
顕微鏡システムオリンパス(東京、日本)BX53IHCスライドのイメージング用
灌流ポンプLonger Precision Pump Co.(中国、保定)BT100-2J経心灌流用蠕動ポンプ
セボフルラン気化器RWDライフサイエンス(中国・深セン)R510PSシリーズ正確なセボフルラン濃度制御のために
Y-Maze装置Med Associates Inc.(米国バーモント州セントオールバンズ)MED-VFC-S-Y電力網とアクティブ回避のためのライト付き
ソフトウェア
GraphPadプリズムGraphPadソフトウェア(米国カリフォルニア州サンディエゴ)バージョン 9統計分析とデータ可視化
イメージJ国立衛生研究所(米国メリーランド州ベセスダ)バージョン 1.53細胞計数用画像解析ソフトウェア
マイクロソフトエクセルMicrosoft Corporation (米国ワシントン州レドモンド)オフィス365データ編集用スプレッドシートソフトウェア

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hadders-Algra, M. The developing brain: challenges and opportunities to promote school readiness in young children at risk of neurodevelopmental disorders in low- and middle-income countries. Front Pediatr. 10, 989518(2022).
  2. Pfeifer, J. H., Allen, N. B., Byrne, M. L., Mills, K. L. Modeling developmental change: contemporary approaches to key methodological challenges in developmental neuroimaging. Dev Cogn Neurosci. 33, 1-4 (2018).
  3. Pezzoli, P., et al. Challenges and solutions to the measurement of neurocognitive mechanisms in developmental settings. Biol Psychiatry Cogn Neurosci Neuroimaging. 8 (8), 815-821 (2023).
  4. Risgaard, K. A., Sorci, I. A., Mohan, S., Bhattacharyya, A. Meta-analysis of Down syndrome cortical development reveals underdeveloped state of the science. Front Cell Neurosci. 16, 915272(2022).
  5. Caporusso, E., et al. Current limitations in technology-based cognitive assessment for severe mental illnesses: a focus on feasibility, reliability, and ecological validity. Front Behav Neurosci. 19, 1543005(2025).
  6. Kasari, C., Brady, N., Lord, C., Tager-Flusberg, H. Assessing the minimally verbal school-aged child with autism spectrum disorder. Autism Res. 6 (6), 479-493 (2013).
  7. Hilton, M. T. Methodological challenges faced by researchers studying early neurodevelopmental outcomes in majority settings. Cambridge J Human Behav. 1 (2), 106-114 (2023).
  8. Lisman, J., et al. Viewpoints: how the hippocampus contributes to memory, navigation and cognition. Nat Neurosci. 20 (11), 1434-1447 (2017).
  9. Lee, J. H., Zhang, J., Wei, L., Yu, S. P. Neurodevelopmental implications of the general anesthesia in neonate and infants. Exp Neurol. 272, 50-60 (2015).
  10. Keunen, K., Sperna Weiland, N. H., de Bakker, B. S., de Vries, L. S., Stevens, M. F. Impact of surgery and anesthesia during early brain development: a perfect storm. Paediatr Anaesth. 32 (6), 697-705 (2022).
  11. McCann, M. E., et al. Neurodevelopmental outcome at 5 years of age after general anaesthesia or awake-regional anaesthesia in infancy (GAS): an international, multicentre, randomised, controlled equivalence trial. Lancet. 393 (10172), 664-677 (2019).
  12. Han, F. F., et al. Predictors and occurrence of postoperative cognitive dysfunction in children undergoing noncardiac surgery: a prospective cohort study. iBrain. 9 (2), 148-156 (2023).
  13. Chung, W., et al. Sevoflurane exposure during the neonatal period induces long-term memory impairment but not autism-like behaviors. Paediatr Anaesth. 25 (10), 1033-1045 (2015).
  14. Apai, C., Shah, R., Tran, K., Pandya Shah, S. Anesthesia and the developing brain: a review of sevoflurane-induced neurotoxicity in pediatric populations. Clin Ther. 43 (4), 762-778 (2021).
  15. Arefayne, N. R., Berhe, Y. W., van Zundert, A. A. Incidence and factors related to prolonged postoperative cognitive decline (POCD) in elderly patients following surgery and anaesthesia: a systematic review. J Multidiscip Healthc. 16, 3405-3413 (2023).
  16. Malik, A. R., Willnow, T. E. Excitatory amino acid transporters in physiology and disorders of the central nervous system. Int J Mol Sci. 20 (22), 5671(2019).
  17. Albarracin, S. L., Baldeon, M. E., Sangronis, E., Petruschina, A. C., Reyes, F. G. R. L-glutamate: a key amino acid for sensory and metabolic functions. Arch Latinoam Nutr. 66 (2), 101-112 (2016).
  18. Vyklicky, V., et al. function, and pharmacology of NMDA receptor channels. Physiol Res. 63 (Suppl 1), S191-S203 (2014).
  19. Zorumski, C. F., Izumi, Y. NMDA receptors and metaplasticity: mechanisms and possible roles in neuropsychiatric disorders. Neurosci Biobehav Rev. 36 (3), 989-1000 (2012).
  20. Lau, C. G., et al. Regulation of NMDA receptor Ca2+ signalling and synaptic plasticity. Biochem Soc Trans. 37 (Pt 6), 1369-1374 (2009).
  21. Bye, C. M., McDonald, R. J. A specific role of hippocampal NMDA receptors and Arc protein in rapid encoding of novel environmental representations and a more general long-term consolidation function. Front Behav Neurosci. 13 (8), (2019).
  22. Callaway, J. K., Jones, N. C., Royse, A. G., Royse, C. F. Sevoflurane anesthesia does not impair acquisition learning or memory in the Morris water maze in young adult and aged rats. Anesthesiology. 117 (5), 1091-1101 (2012).
  23. Li, R., et al. Sevoflurane exposure in the developing brain induces hyperactivity, anxiety-free, and enhancement of memory consolidation in mice. Front Aging Neurosci. 14, 934230(2022).
  24. Yuan, I., Xu, T., Kurth, C. D. Using electroencephalography (EEG) to guide propofol and sevoflurane dosing in pediatric anesthesia. Anesthesiol Clin. 38 (3), 709-725 (2020).
  25. Schinelli, S., et al. Stimulation of endothelin B receptors in astrocytes induces cAMP response element-binding protein phosphorylation and c-Fos expression via multiple mitogen-activated protein kinase signaling pathways. J Neurosci. 21 (22), 8842-8853 (2001).
  26. Florian, C., Mons, N., Roullet, P. CREB antisense oligodeoxynucleotide administration into the dorsal hippocampal CA3 region impairs long- but not short-term spatial memory in mice. Learn Mem. 13 (4), 465-472 (2006).
  27. Cabrera, O. H., Useinovic, N., Jevtovic-Todorovic, V. Neonatal anesthesia and dysregulation of the epigenome. Biol Reprod. 105 (3), 720-734 (2021).
  28. Arellano, J. I., Duque, A., Rakic, P. A coming-of-age story: adult neurogenesis or adolescent neurogenesis in rodents. Front Neurosci. 18, 1383728(2024).
  29. Borsini, A., Giacobbe, J., Mandal, G., Boldrini, M. Acute and long-term effects of adolescence stress exposure on rodent adult hippocampal neurogenesis, cognition, and behaviour. Mol Psychiatry. 28 (10), 4124-4137 (2023).
  30. Kraeuter, A. K., Guest, P. C., Sarnyai, Z. The Y-maze for assessment of spatial working and reference memory in mice. Methods Mol Biol. 1916, 105-111 (2019).
  31. Ordodi, V. L., Paunescu, V., Mic, F. A. Optimal access to the rat heart by transverse bilateral thoracotomy with double ligature of the internal thoracic arteries. J Am Assoc Lab Anim Sci. 47 (5), 44-46 (2008).
  32. Aboghazleh, R., et al. Rodent brain extraction and dissection: a comprehensive approach. MethodsX. 12, 102516(2024).
  33. Fedchenko, N., Reifenrath, J. Different approaches for interpretation and reporting of immunohistochemistry analysis results in the bone tissue: a review. Diagn Pathol. 9, 221(2014).
  34. Diem, K., et al. Image analysis for accurately counting CD4+ and CD8+ T cells in human tissue. J Virol Methods. 222, 117-121 (2015).
  35. Lee, S., Lee, D. K. What is the proper way to apply the multiple comparison test. Korean J Anesthesiol. 71 (5), 353-360 (2018).
  36. Shaffer, J. P. Controlling the false discovery rate with constraints: the Newman-Keuls test revisited. Biom J. 49 (1), 136-143 (2007).
  37. Liu, W. Some results on step-up tests for comparing treatments with a control in unbalanced one-way layouts. Biometrics. 53 (4), 1508-1512 (1997).
  38. Steven, A., et al. What turns CREB on? And off? And why does it matter. Cell Mol Life Sci. 77 (20), 4049-4067 (2020).
  39. Naqvi, S., Martin, K. J., Arthur, J. S. CREB phosphorylation at Ser133 regulates transcription via distinct mechanisms downstream of cAMP and MAPK signalling. Biochem J. 458 (3), 469-479 (2014).
  40. Brosnan, R. J., Thiesen, R. Increased NMDA receptor inhibition at an increased sevoflurane MAC. BMC Anesthesiol. 12, 9(2012).
  41. Wang, H., Peng, R. Y. Basic roles of key molecules connected with NMDAR signaling pathway on regulating learning and memory and synaptic plasticity. Mil Med Res. 3 (1), 26(2016).
  42. Chen, B. S., Roche, K. W. Regulation of NMDA receptors by phosphorylation. Neuropharmacology. 53 (3), 362-368 (2007).
  43. Brightwell, J. J., Smith, C. A., Neve, R. L., Colombo, P. J. Transfection of mutant CREB in the striatum, but not the hippocampus, impairs long-term memory for response learning. Neurobiol Learn Mem. 89 (1), 27-35 (2008).
  44. Colombo, P. J., Brightwell, J. J., Countryman, R. A. Cognitive strategy-specific increases in phosphorylated cAMP response element-binding protein and c-Fos in the hippocampus and dorsal striatum. J Neurosci. 23 (8), 3547-3554 (2003).
  45. Kida, S. A functional role for CREB as a positive regulator of memory formation and LTP. Exp Neurobiol. 21 (4), 136-140 (2012).
  46. Liu, Z., et al. Long-term sevoflurane exposure resulted in temporary rather than lasting cognitive impairment in Drosophila. Behav Brain Res. 442, 114327(2023).
  47. Wei, W., et al. Biomechanical effect of proximal multifidus injury on adjacent segments during posterior lumbar interbody fusion: a finite element study. BMC Musculoskelet Disord. 24 (1), 521(2023).
  48. Giza, C. C., Maria, N. S., Hovda, D. A. N-methyl-D-aspartate receptor subunit changes after traumatic injury to the developing brain. J Neurotrauma. 23 (6), 950-961 (2006).
  49. Jia, M., et al. Role of histone acetylation in long-term neurobehavioral effects of neonatal exposure to sevoflurane in rats. Neurobiol Dis. 91, 209-220 (2016).
  50. Tang, X., et al. Resveratrol mitigates sevoflurane-induced neurotoxicity by the SIRT1-dependent regulation of BDNF expression in developing mice. Oxid Med Cell Longev. 2020, 9018624(2020).
  51. Gao, H., et al. Effects of intravenous anesthetics on the phosphorylation of cAMP response element-binding protein in hippocampal slices of adult mice. Mol Med Rep. 18 (1), 627-633 (2018).
  52. Allen, T. A., Fortin, N. J. The evolution of episodic memory. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (Suppl 2), 10379-10386 (2013).
  53. Bucci, D. J., Robinson, S. Toward a conceptualization of retrohippocampal contributions to learning and memory. Neurobiol Learn Mem. 116, 197-207 (2014).
  54. Cherubini, E., Miles, R. The CA3 region of the hippocampus: how is it? what is it for? how does it do it. Front Cell Neurosci. 9, 19(2015).
  55. Lehr, A. B., et al. Ca2+ beyond social memory: evidence for a fundamental role in hippocampal information processing. Neurosci Biobehav Rev. 126, 398-412 (2021).
  56. Bliss, T. V., Lomo, T. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol. 232 (2), 331-356 (1973).
  57. Benke, T. A., Luthi, A., Isaac, J. T., Collingridge, G. L. Modulation of AMPA receptor unitary conductance by synaptic activity. Nature. 393 (6687), 793-797 (1998).
  58. Shi, S., Hayashi, Y., Esteban, J. A., Malinow, R. Subunit-specific rules governing AMPA receptor trafficking to synapses in hippocampal pyramidal neurons. Cell. 105 (3), 331-343 (2001).
  59. Benke, T. A., et al. Mathematical modelling of non-stationary fluctuation analysis for studying channel properties of synaptic AMPA receptors. J Physiol. 537 (Pt 2), 407-420 (2001).
  60. Poncer, J. C., Esteban, J. A., Malinow, R. Multiple mechanisms for the potentiation of AMPA receptor-mediated transmission by alpha-Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II. J Neurosci. 22 (11), 4406-4411 (2002).
  61. Vorhees, C. V., Williams, M. T. Assessing spatial learning and memory in rodents. ILAR J. 55 (2), 310-332 (2014).
  62. Macheda, T., Snider, H. C., Watson, J. B., Roberts, K. N., Bachstetter, A. D. An active avoidance behavioral paradigm for use in a mild closed head model of traumatic brain injury in mice. J Neurosci Methods. 343, 108831(2020).
  63. Shang, M., et al. Moderate white light exposure enhanced spatial memory retrieval by activating a central amygdala-involved circuit in mice. Commun Biol. 6 (1), 414(2023).

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