方法論記事

拡張顕微鏡:従来型顕微鏡による高分解能蛍光イメージング

DOI：

10.3791/68595

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2025年12月19日

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1University of Bordeaux, CNRS, MFP, iMet UMR 5234, 2Université Claude Bernard Lyon 1, MeLiS-UCBL-CNRS UMR 5284-INSERM U1314, 3University of Bordeaux, CNRS, MFP, ProParaCyto UMR 5234

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、クライオ固定と拡張顕微鏡法(Cryo-ExM)を組み合わせた詳細なプロトコルを紹介し、さまざまな生物学的サンプルに適応した構造保存と高解像度イメージングを可能にします。生物サンプルは凍結され、膨張性ポリマーに埋め込まれ、変性・拡張・免疫標識処理され、標準的な光学顕微鏡による超分解能イメージングが可能になります。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

拡張顕微鏡(ExM)は、生物標本を物理的に拡大し、共焦点顕微鏡などの従来のシステムを用いた回折限界を超えたイメージングを可能にする革新的な超分解能蛍光顕微鏡技術です。膨張可能なハイドロゲルマトリックスにサンプルを埋め込むことで、ExMは試料の等方展開を可能にし、特殊なナノスコピー装置を必要とせずに空間分解能を向上させます。超微細展開顕微鏡(U-ExM)などの高度なバリエーションは、細胞小器官や高分子集合体などの細かい細胞細部を保存します。

特定の細胞構造や細胞小器官の観察は、特にアルデヒド系化学架橋剤の使用や冷たいメタノールによるタンパク質沈殿など、サンプルに適用される固定方法に大きく依存します。最近では、凍結固定法というゴールドスタンダードの固定技術をU-ExM法と統合することで、培養哺乳類細胞から生物全体に至るまで、ほぼ原生状態のナノスケール観察が可能になりました。拡張顕微鏡は、孤立した小器官から組織全体に至るまで、スケールを超えた生物学的構造を研究する強力なツールです。クライオ固定と組み合わせることで、従来の固定法に伴うアーティファクトを最小限に抑えつつ、細胞構造や動的プロセスに関する前例のない洞察を提供します。これらの進展により、ExMは高解像度かつほぼネイティブな生物イメージングのための多用途なフレームワークとして位置づけられています。

本研究では、さまざまな起源のサンプルの拡張顕微鏡と組み合わせたクライオ固定の詳細なプロトコルを概説しています。このプロトコルは、サンプル固定、ポリマー形成、拡張、免疫染色、イメージングなどの重要なステップを強調し、あらゆる実験室でこの手法を実装するための指針を提供します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

顕微鏡は生物学研究において重要な役割を果たし、生物全体から個々の分子に至るまで、前例のないスケールで生物系の超細構造や組織を可視化することを可能にします。顕微鏡分野は2つの異なるシステムに分けられます。電子顕微鏡(EM)は高度に分解能が高いものの特異的な標識能力は限られています。もうひとつは光の回折限界により分解能が限られるものの、細胞内構造を正確かつ特化的に可視化できる光顕微鏡です。超分解能蛍光顕微鏡(SRM)は細胞の亜回折分解蛍光イメージングの強力な手法として発展してきましたが、生物全体のような高分子集合体の超微細構造の詳細を可視化することは依然として困難です。さらに、SRM技術は10〜120 nmの解像度を達成し、高度な顕微鏡や画像再構成アルゴリズムに依存し、専門知識と専門的な顕微鏡を必要とし、多くの生物学研究所での利用が制限されています。新興の超分解能手法であるエクスパンション顕微鏡(ExM)は、これらの制約を克服しています。10年前にエドワード・S・ボイデンの研究室で開発されたExMは、現在では特殊な顕微鏡を必要とせずにイメージングを可能にする革新的なフォトニック顕微鏡技術です。高度なイメージング技術に依存するのではなく、ExMは生体サンプルを等方的に膨張する高分子に埋め込む方法を用います。この物理的拡大によりサンプルサイズは4倍以上増加し、解像度が向上し、従来の光学顕微鏡による観察が可能になります。もともとは脳スライスで開発されたExMプロトコルは、解像度の向上と手順の簡素化のために進化してきました。この技術は真核細胞、単細胞生物、寄生虫、組織、全生物など多様な生物サンプルに成功裏に応用されており、その多用途性を示しています。3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14。15歳。

現在、主に2つのプロトコルクラスが存在します:拡張前2,16と拡張後17,18で、これは拡張手順の前後に生物サンプル染色の瞬間を指します。本記事では、サンプルの変性と増殖後に免疫標識を行うポストエクスプレジングプロトコルに焦点を当てます。

このプロトコルでは、生物サンプルをクライオまたは化学的に固定し、化学剤と併用して培養することで、将来のポリマーへのタンパク質固定が可能となります。試料はその後、アクリルアミド/ビスアクリルアミド(電気泳動ゲルで一般的に使用)とアクリレートナトリウム(膨張を可能にする)からなる膨張性ポリマーに埋め込まれます。水を加えるとゲルの膨張が促進され、ゲルの膨張に比例してタンパク質間の距離が広がります。関心のあるタンパク質は、特異的抗体を用いてゲル内で直接標識します(図1)。

電子顕微鏡、フォトニック顕微鏡、超分解能顕微鏡、ExMを含む前述のすべてのイメージング技術は、生物学的サンプル固定を必要とします。アルデヒド系固定はタンパク質間の架橋を生み出し、光子顕微鏡や電子顕微鏡の処理中に必要な細胞組織を維持します。しかし、固定は細胞内のアーティファクトや形態変化を引き起こすこともあり、これらは古典的な光学顕微鏡では微妙に見えることもありますが、SRMの進歩と発展によりますます明らかになり、科学者たちは固定法の結果を再考するようになりました19。固定に関連するアーティファクトを回避する一つの方法は、生顕微鏡を用いることで、細胞構造をほぼ本来の状態で動的に可視化することが可能です。しかし、生体顕微鏡にはいくつかの欠点があり、特に遺伝子間接発現の必要性があり、これは細胞生理に影響を与え、内因性に比べてタンパク質の挙動を変化させる可能性があります。さらに、ライブ顕微鏡は固定顕微鏡よりも解像度が低く、蛍光タグは無毒かつ生体内で安定している必要があるため、利用可能なマーカーの数が制限されます。電子顕微鏡の分野は、その高い分解能により、細胞内または高分子構造を固定しつつ、その本来の状態を保つ最適な方法の開発に大きく貢献してきました。数十年前、デュボシェ、フランク、ヘンダーソンの研究室によってクライオ固定法が開発され、細胞をガラス状状態水中で迅速に固定し、これがネイティブ超微構造を保存する唯一の方法であることを示しました20,21。精製された分子はクライオ電子顕微鏡でガラス氷内で直接観察できますが、観察前に細胞を樹脂に埋め込み切片する必要があります。サンプルを可能な限り自然な状態に安定させるために、凍結置換処理が行われます。この過程で、氷分子が液体状態に戻ると、瞬時にアセトンに置き換わります。アセトンは水よりも拡散係数が高いです。水分を除去する際に、関心のある分子が集まり崩壊することがあります。これは化学的架橋固定に似ています。この凝集を制限するために、低温で凍結置換を行い、細胞内粘度を増加させることで凝集を減少させます。この制御されたアプローチにより、大型集合体の形成を制限し、細胞超細構造を本来の状態に近い状態に保ちます。

2022年、化学的固定が人工物を生じさせるという証拠が増え、膨張顕微鏡の進歩が相まって、Guichard/Hamel研究所は「Cryo-ExM'23」として知られる冷凍固定と膨張顕微鏡を統合した手法を開発しました。このアプローチは、生物学的構造を最小限の歪みで保存することで、両技術の強みを活かしています。試料は高圧凍結または手動プランジを用いてクライオ冷凍されますが、これらは電子顕微鏡検査室やコア施設で一般的に使われる特殊な機器を必要とします。

本論文は、凍結固定と拡張顕微鏡の段階的なプロトコルを概説し、ヒト培養細胞と睡眠病の原因である単細胞寄生虫 トリパノソーマ・ブルーシー という2つの実験モデルの代表的な結果を提示します。従来の固定法に比べてクライオ固定がもたらす改良点を強調し、この技術に伴う最も一般的な落とし穴や固定アーティファクトを紹介します。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

注:本プロトコルで使用される試薬は材料表に記載されています。このプロトコルは、若干修正を加えて異なる生物サンプル(酵母24,25、トキソプラズマ・ゴンディイ26、近縁動物27、緑藻28,29、微生物真核生物30、マウス23、31、32、33)の観察に適応されています).これらの異なるサンプルにプロトコルを適応させるための修正については、元の論文から取得できるため、本論文には記載されていません。ここでは、RPE1細胞とトリパノソーマ・ブルーシーが哺乳類細胞や寄生虫の代理として用いられます。このプロトコルは、生物学的サンプルの固定および拡張ステップを強調しています。したがって、サンプル培養に関する情報は本記事には掲載されていません。

1. ストック溶液の調製

  1. ポリリジン溶液
    1. ポリLまたはポリDリジン臭化水素(材料表)を水に再懸浮させ、1 mg/mLのポリリジンのストック溶液を得ます。このストック溶液は-20°Cで保存し、さらに0.2 mg/mLの水で希釈してカバースリップのコーティングに使います(表1、材料表)。
  2. アンカリング解
    1. 化学フードの下で38μLのホルムアルデヒド(36.5%-38%)を混ぜて新鮮なアクリルアミド/ホルムアルデヒド溶液を準備します。 材料表)さらに、912μLのPBSに50μLのアクリルアミド(40%、 材料表)を投入して1mLの溶液を得ました。
  3. APS(起爆剤)を使わないゲル化溶液
    1. 混合溶液として、38%アクリレートナトリウム500 μL(最終19%)、40% アクリルアミド 250 μL(最終10%)、2%ビスアクリルアミド 50 μL(最終0.1%)、TEMED 50 μL(0.5%最終)、100 μL 10x PBS(1x最終液)を加えます。最大2ゲル(80-90 μL)に適した容量で、使用前に少なくとも12時間-20°Cで保存してください(長期保存は表1 参照)。
      注意:ゲル化溶液の混合物を調製するために示された体積は最終体積1 mLを得るために計算されていますが、実際の溶液の体積は950 μLであり、APSは総体積の1/20に相当し、即席で加えられます。ゲル化溶液17 の元の保存期間は、-20°Cで最大1か月間保存可能で、ゲルの固形性や膨張効率を損なうことなく維持できることが確認されたため延長されました。
  4. TEMEDとAPS
    1. APS 10% w/v:APS粉末を水に希釈し、アリコートして-20°Cで保存します。
    2. TEMED 10% v/v:TEMEDを水に希釈し、アリコートして-20°Cで保存します。
  5. アクリレートナトリウム(SA)38%
    1. 精製されたSA(AKサイエンティフィックまたはシグマ)から38%のSAを準備します。 材料表)
      1. アクリレートナトリウム38gを100mLの水に、常にかき混ぜて再懸濁します(重要)。骨材を避けるために水楊酸を段階的に取り入れ、4°Cで一晩かき混ぜて完全な再懸濁を確保します。溶液が半透明で無色か、やや黄色であることを確認しましょう。分割して最大1年間4°Cで保存します。
    2. アクリル酸から38%のSAを準備します(シグマ; 材料表)
      1. 化学フードの下でアクリル酸を中和し、38%アクリレートナトリウム90mlを準備します。
      2. かき混ぜながら29mLの水と25mLのアクリル酸を混ぜます。
        注意:この段階から、反応は発熱反応であるため、pHと温度を一定に制御しながら氷上で行う必要があります。
      3. パスツールピペットを使って10N NaOHを一滴ずつ加えます。
        注意:温度が25°Cを超えないように注意してください(もし超過した場合はNaOHの添加をやめて温度が下がるのを待ちましょう)。
      4. pHが7〜8になるまで中和を続け、氷の上で1時間攪拌します。
        注意:pHが突然10を超えたら、アクリル酸を加えてpHが7〜8まで下がるまで続けてください。
      5. 溶液は密閉容器に一晩保存してください。溶液が沈殿した場合は、1,000 × g で10分間遠心分離機にします。上清液をアリコート液として採取し、-20°Cで保存します。
  6. 変性解
    1. TrisBase 1 M:TrisBase 121.14gを1Lの水に希釈し、HClでpHを9に調整してRTで保存します。
    2. 変性バッファー:水中に200 mMのドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、200 mM NaCl、50 mM TrisBaseを混合します。200 mL溶液の場合、124.9 mLのddH2Oに10 mLのTris-BASE 1 M(pH 9)を加え、さらにSDS(20%/700 mMストック)57.1 mL、NaCl 8 mL(5 Mストック)を加えながらかき混ぜます。RTでストア(表1)。

2. クライオフィクショナレーションおよび拡張手術

  1. サンプル調製とクライオ固定
    注意:このプロトコルは12mmカバースリップで栽培・装填されたサンプルに最適化されています。他のサポートのために解答のボリュームを修正してください。
    1. 試料の調製
      1. サンプルは生物学的サンプルに適した条件で培養し、12mmのカバースリップ(哺乳類の付着細胞)または懸浮液(T. brucei)で培養します。
      2. ポリリジンであらかじめコーティングされたカバースリップ(T. brucei)にサンプルを以下のように装填します。短時間、12mmのカバースリップをポリリジン(0.2 mg/mL)で37°Cで1時間培養し、素早く洗浄して自然乾燥させます。
      3. 寄生虫を300gで室温(RT)で10分間遠心分離します。PBSでリサスペンドし、培養培地10%を補足し、凍結固定の5〜10分前にカバースリップに負荷をかけます。
    2. プランジセットアップ(図2A-C)
      注意:アセトンを操作する際は、手袋と白衣を着用して化学フードの下で作業してください。液体窒素や液体エタンを操作する際は、白衣とゴーグルを着用してください。
      1. 化学フードの下で、5mLのチューブ(カバースリップ/チューブ1枚)に1mLのエクストラドライアセトンを、シリンジと針を使って空気汚染を防ぎます。
        注:生物学的膜の保存を改善するためには、パラホルマルデヒド(PFA)/グルターアルデヒド(GA)(0.1/0.02%)の添加が必要です。カバースリップの直径に合わせてチューブを調整してください(12mm>カバースリップは5mLチューブには収まりません)。
      2. チューブを液体窒素で凍結し、冷えに強いプラスチックまたは金属製のラックを使って直立させてください。
      3. 発泡スチロールの箱の半分(厚さ30cm×30cm/厚い壁)にドライアイスを入れます。
      4. Vitrobotタイプのデュワーに液体窒素を蒸発が止まるまで満たし、温度が安定するまで10〜15分待ちます。スパイダーの使用はシステムの冷却を促進するために必要です(図2B、アスタリスク)。必要なら補充してください。
      5. クモを取り除き、金属製のプランジングチャンバーに液体エタンを充填します。
      6. エタンが平衡するまで10分待ちます。
        注意:実験中は必要に応じて液体エタンを補充してください(この時点でスパイダーは使わないでください)。気体から液体エタンへの移行は困難です。適切な圧力の使用は液体エタンの形成に不可欠です。高圧は金属チャンバー内の絶え間ないガスオーバーフローによって液体の形成を防ぎ、低圧では金属チャンバーと充填管内で固いエタンを形成します。氷の形成を避けることが実験に不可欠です。液体と空気の界面に充填先端を保つことで、固体エタンの形成を防ぐことができます。
    3. プランジング(図2A-C)
      注意:液体窒素や液体エタンを操作する際は、白衣とゴーグルを必ず使用してください。
      1. 細いピンセット付きの12mmカバースリップを用意してください。
      2. 余分な培地はティッシュペーパーで吸い取ってください。
      3. ピンセットでカバースリップを半分押さえ、クランプリングをクライオプランジャーに取り付けます。
      4. カバースリップを固定しているピンセットをクライオプランジャーのホルダーに入れます。余った媒体はワットマン紙で拭き取ります。
      5. クライオプランジャーを作動させて、カバースリップを金属チャンバーのエタン溶液に突き刺します。
      6. カバースリップを凍ったアセトン入りのチューブ(カバースリップ1本/チューブ)に素早く移します。
        注意:サンプル採取と浸孔の両方で同じピンセットを使わないでください。培養培地との汚染を避けるためです。12mm>カバースリップを使う場合は特に注意してください(15mmまたは18mm直径のカバースリップはキャリアに合いますが、突き落とすのが難しい場合があります)。この工程では、試料を凍結したままエッペンドルフに移送しやすくするために、プランディング後にカバースリップを液体窒素に浸すことが可能です。アセトンは-96°Cで凍結するため、凍結置換のためにカバースリップを凍ったアセトンの上に置く必要があります。
    4. 凍結置換と再水化
      注意:凍結置換時のサンプル操作時は内部作業をしてください。温度が上昇すると管内に圧力がかかり、それが管の爆発を引き起こす可能性があります。
      1. チューブをドライアイスでチルト角度(約45°)で孵化させます。
      2. 軌道シェーカーで一晩攪拌します。閉じた箱をシェイカーに4°CまたはRTで置き、温度を-180°Cから-80°Cまで上げます。
      3. 箱からドライアイスの大部分を取り出します(箱の底に少量だけ残し)、チューブを素早く開閉して圧力を解放し、軌道シェーカーで45分間攪拌を続けて、さらに-80°Cから-20°Cまで温度を上げ続けます。
      4. カバースリップを12ウェルプレート(または任意の便利な容器)に移し、その中には事前に冷却された純粋なエタノール(100%)溶液が入っています。5分間培養し、徐々に水分補給を進めてください:EtOH 100%(5分) - EtOH 95%(3分) - EtOH 95%(3分) - EtOH 70%(3分) - EtOH 50%(3分) - EtOH 25%(3分) - H2O 100%。
      5. カバースリップをPBSで転写し、顕微鏡で(先端で表面をかきながら)向き合わせて、すべてを上に向けてください。
        注意:EtOH 100%と95%は-20°Cで、EtOHは70%と50%は4°C、EtOH 25%とddHはRTで保存し、RTまで温度を上げ続けます。膜標識には、アセトンおよび再水和溶液にPFA/GA(0.1%/0.02%)を加える必要がありますが、ddH2Oを除く。
  2. 拡張
    1. タンパク質アンカリング
      1. 新鮮な1.4%ホルムアルデヒド/2%アクリルアミド(FA/AA)溶液をPBSに1回調製します。
      2. カバースリップを0.5/1 mLのAA/FAを充填した4/12ウェルプレートに置きます。
      3. 攪拌せずに37°Cで3〜5時間培養します。
        注:ホルムアルデヒドはアクリルアミドに遊離アミン基を結合させます。過剰なアクリルアミドは、通常ホルムアルデヒドによって誘導されるタンパク質架橋を抑え、タンパク質を将来の膨張ポリマーに固定します。タンパク質の固定ステップ延長を一晩で行う必要がある場合もあります。いずれにせよ、より長い潜伏は以下のステップに影響を与えません。蒸発を防ぐために、自由井戸に水を注ぐか、湿ったチャンバーに入れてください。
    2. ゲル化
      1. 解凍、APS(10%)、ゲル化液(アクリレートナトリウム19%、アクリルアミド10%、ビスアクリルアミド0.1%、TEMED0.5%を10倍PBSで希釈)を氷上で10分前に行います。
      2. 湿ったチャンバーに薄く湿った組織とパラフィルムを敷き、4°Cで10分間保存します。
      3. 湿ったチャンバーを氷の上に置いてください。
      4. タンパク質の固定液からカバースリップを取り出し、余分な溶液をティッシュペーパー(2枚連続)で取り除きます。
      5. ゲル化液にAPS(最終濃度0.5%)を加え、2〜3秒間渦を巻き、湿気チャンバーのパラフィルムに35μLを2滴投与します。
      6. 一滴ずつカバースリップ(ゲル化溶液の方を向く細胞)で覆います。
      7. ジェルが浸透できるように氷で5分間孵化してください。
      8. 37°Cで30〜60分間孵育します。
    3. 変性
      1. 生検パンチツール(直径0.4cm、 図2D)でゲルをパンチし、1mLの変性バッファーを入れた6ウェルプレートに10〜15分間攪拌し、ゲルがカバースリップから剥がれるまで加熱します。
      2. ゲルを新鮮な変性バッファーを入れた1.5 mLのマイクロ遠心分離管に移します。
      3. 95°Cで1時間30分培養します。
      4. ゲルをddH2Oに10分間移し、変性バッファーを適切に洗浄するために3回繰り返します。
      5. ゲルをミリペーパーやキャリパーで測定し、ゲルの膨張率を評価してください。
      6. ゲルをPBSに移して免疫染色を行います。
      7. または、短期間はPBS-azide 0.02%で4°Cで短期間保存(表1)、長期間保存する場合は-20°Cで保存する方法もあります(表1)。長期保存の場合、ゲルは複数の水浴で培養する必要があります。グリセロール50%溶液を攪拌下で2〜3時間培養し、-20°Cの十分な容量の溶液に置き、ゲルサイズに合わせて調整する必要があります。
        注意:望む場合はゲル全体を全てに残すこともできます(図2D、E)(ステップ2.2.3.1)。1本のチューブに最大5回のパンチ(ゲル全体に相当)を集めることができます(ステップ2.2.3.2)。変性温度と時間は尊重されなければなりません(ステップ2.2.3.3)。高温はチューブの開口を引き起こし、変性緩衝材の蒸発やゲルの排出を引き起こすことがあります。必ずセーフロックチューブを使うか、カバーしてください。変性後のゲル洗浄は蒸留水で行う必要があります。PBSはSDSの沈殿を引き起こし、洗浄効率に影響を与えるためです。このステップではゲルがわずかに膨張しますが、プロトコルの次のステップ(ステップ2.2.3.4)には影響しません。グリセロールは大きなゲルの場合にスペースを節約するためにPBSで希釈できます。0.4mmパンチの場合、ゲルは理想的には3mLの水(グリセロール)を充填した12ウェルプレートに保管されます。

3. 免疫染色と最終拡張

  1. PBSの浴槽を15分の潜伏期間に交換してください。
  2. ジェル全体を4つに均等に切ります。
  3. ゲル片やパンチを適応キャリア(図2D、E)に移し、PBS-BSA 2%で希釈した一次抗体と共に3時間から一晩、攪拌しながらインキュベートします(詳細な条件は 表2および 表3 を参照)。
  4. PBS+Tween 0.1%で3回洗い、10分間RTで攪拌します。
  5. ゲルを二次抗体に培養し、HoechstをPBS-BSA 2%に3時間から一晩かき混ぜて攪拌します(詳細な条件は 表2 および 表3 参照)。
  6. PBS+Tween 0.1%で3回、10分間RTで攪拌しながら洗います。
  7. 任意:全プロテオームのパンラベリングを行い、NHSエステル(詳細は 表2 参照)をPBSでRTで攪拌下で1時間30分培養し、その後PBS+Tween 0.1%で3回洗い10分間行う。
  8. ゲルを適応キャリアに移し、蒸留水(ddH2O)での培養によるゲル展開を進めます。
    注:抗体洗浄に使用される洗剤の濃度や種類(Tween、Triton-X100、Saponin)は、生物学的サンプルに適応可能です。水を何度も補充することが、塩分の痕跡を除去し、完全な膨張を防ぐために非常に重要です。

4. 取り付けとイメージング

  1. ポリリジンを塗るには(セクション1.1参照)、約200μLのポリリジンをカバースリップに塗り、RTで1時間培養し、ddH2Oで3回洗浄して過剰なポリリジンを除去します。カバースリップは乾かし、使用まで4°Cで保存します。
  2. 発酵ゲルを非コーティングのカバースリップに置き、蛍光顕微鏡でサンプルの向きを確認します。
  3. 向きを合わせたら、糸くずのない紙に乾かして余分な水分を取り除き、ポリリジンコーティングされたカバースリップに取り付けます(手順はステップ1.1参照)。
  4. 逆立顕微鏡でサンプルを観察します。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本論文は、培養哺乳類細胞と T. brucei 寄生虫の2種類のサンプルに対して、凍結固定と拡張顕微鏡を組み合わせた結果を強調しています。両サンプルとも、膨張と免疫染色前に4%PFAで凍結固定または化学的に固定されていました。なお、他の化学的固定法(メタノールやグルターアルデヒドなど)が特定の小器官により適している場合があり、単純化のためにクライオ固定と比較するために比較対象となったのはPFAのみです。

ヒトのRPE1(網膜色素上皮細胞)はαβ-チューブリン、ATP5a、ホエクストを染色し、それぞれ微小管、ミトコンドリア、核を可視化しました。さらに、ゲルは蛍光性のNHSエステルとインキュベートされ、拡張前に誘導アミン基と反応し、細胞全体を染色しました。すでに示されたように、化学的固定と比べてクライオ固定のいくつかの利点が観察されています。最も顕著な特徴は、クライオ固定がミトコンドリアネットワークを完全に保存していたことで、NHSエステルやATP合成酵素サブユニットα(ATP5a)に対する特異的抗体を用いて観察できます(図3A,B)。さらに、ATP5aは内側ミトコンドリア膜に局在するため、クライオ固定を用いてミトコンドリアクリスタを解消することも可能です(図3B)。むしろ、PFA固定はミトコンドリアネットワークを保存できず、この状態ではミトコンドリアのクリステアが見えませんでした(図3C)。また、両条件下で微小管を染色し、クリオ固定が細胞質や星体微小管などの動的微小管をより良く保存することを示しました(図3B-E)。しかし、中心細胞や繊毛のような安定した微小管は、9重微小管の三重形/二重形からなる非膜性小器官であり、PFA固定細胞では凍結固定細胞よりも同等かそれ以上に保存されていました(図3B',C')。細胞タンパク質の整合性を保持するクリオフィクセーションは、中心細胞や繊毛のような非常に高密度な構造にはあまり適用できない可能性があることに注意が必要です。この観察は、化学的固定によって細胞質タンパク質の洗い流しを引き起こす核孔のような剛性構造でも行われており、核孔構造の観察精度が向上しています23,32。最後に、クライオ固定は化学的固定の架橋効果も回避し、有糸分裂紡錘体でPFAに比べてほぼ2倍膨張したように、拡張能力に悪影響を及ぼすことも示せます(図3D,E)。

トリパノソーマ・ブルーシー細胞は、特有のミトコンドリアを可視化するためにTDH34(図4A-D)と、内質網を強調するためにBiP35(図4E,F)のために染色されました。さらに、ゲルは蛍光性NHSエステルで染色されました。ヒト細胞で観察されたように、クライオ固定と拡張を組み合わせることで、PFA固定(図4C、D、F)に比べて細胞全体の構造、特にこれら二つの膜構造をよりよく保存します(図4C,D,F)。T. bruceiの微小管細胞骨格は、人間の細胞よりも硬く安定しています。したがって、PFAとクリオフィクセイションの間に有意な違いは認められませんでした。さらに、U-ExM技術の解像度制限により、個々の微小管を区別できません(図示されていません)。

全体として、クリオフィクセーションは膜質小器官(ミトコンドリア、小胞体)や動的細胞骨格要素(細胞質または星体微小管)の保存など、古典的な化学固定の限界に対応します。さらに、クライオ固定はタンパク質間に架橋を生じないため、特に剛性や高密度構造において膨張能力を完全に保持します。

生物サンプルの細胞超微細を維持するためには、凍結固定と拡張の品質を制御することが不可欠です。いくつかのミスは固定不良を引き起こし、生物学的サンプル内にアーティファクトを生み出します。ここでは、凍結固定の最も一般的な欠点と、固定不良の結果を紹介します。クライオ固定によって最も明白なアーティファクトは、生物試料内に亀裂が生じること(図5A)であり、これもクライオ電子顕微鏡でよく見られます。これらの亀裂は、ミトコンドリアや微小管の 図5A (挿入図)に示されるように、細胞小器官の本質的な超構造を変えるものではありませんが、これらの亀裂の生物学的意義の誤解を招く可能性があり、慎重に検討する必要があります。操作の問題とこれらのひび割れの出現・多さとの間に特別な相関関係はありません。

固定不良を示す特有の特徴の一つは、細胞質内に「気泡状構造」が現れ、氷の結晶の存在を示すことです。これらの構造は特にNHSエステル染色で目立ちます(図5B)。通常、波状の微小管(図5B)などの細胞骨格要素の保存が限定的であり、膜質小器官( 図5Bのミトコンドリア)の保存が非常に悪いと同時に見られます。これらの特徴は、固定に関する重要な問題を示しています。これは、(i) 不適切なエタン体積および/または温度(プロトコルのステップ2.2.4-2.2.6)、(ii) 生物学的サンプルの非段階的なウォームアップ(プロトコルのステップ2.3および2.4)、および (iii) 凍結置換溶液中の不純物の存在(プロトコルのステップ2.2.1)によって引き起こされることです。図 5Cには、使用可能で38%のナトリウムアクリレート(無色かつ半透明[1])またはやや黄色で半透明[2])、膨張に使用できない(黄色/オレンジで曇っている[3])の期待される側面を示すナトリウムアクリレート溶液の代表画像が示されています。

figure-results-1
図1 クライオエクセルのワークフロー。 (A) 生細胞(ヒト細胞または T. brucei)は、-180°Cの液体エタンに浸し、ドライアイスの上で冷凍アセトンで培養することでクリオ固定されます。凍結置換は、ドライアイス上で-180°Cから-80°Cまで温を一定かつゆっくりと上昇させ、アセトン液化を引き起こす(-96°C)、さらにドライアイスなしで-80°Cから-20°Cまで培養することで行われます。再水和は、エタノールを蒸留水の三日月濃度と混合した連続的な浴槽で行われ、さらに-20°Cから室温まで温度を一定に上げることで行われます。(B) 再水和されたサンプルは次のように膨張します:サンプルはアクリルアミド-ホルムアルデヒド(AA/FA)の混合物で37°Cでインキュベートされ、タンパク質をアクリルアミド、ビスアクリルアミド、アクリレートナトリウム(AA/BIS/SA)からなる膨張性ポリマーに固定します。後者がゲルに膨張特性を与えます。サンプルはNaCl/SDSで95°Cで培養され、タンパク質間相互作用の不安定化および穏やかな変性処理が行われます。このステップは等方展開に不可欠です。その後、通常の一次抗体と二次抗体で免疫染色され、最後に蒸留水で増殖されます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図2。冷凍プランジと拡張のセットアップ。 (A) クライオプランジャーは起動位置(上部パネル)、下部位置(下部パネル)で起動。矢印はプランジを起動するPUSHボタンを示します。(B) 低温プランジ装置:低温固定に適した液体窒素(N2)のレベルを示し、デュワーを囲む泡の高さ(赤い矢じり)で示す。取り外し可能なクモはアスタリスクで示されています。(C) カバースリップを保持する際のクライオプランジの重要なステップ(左上)、液体エタンデュア中のカバースリップの位置(左下)、および凍結置換用の収集管(右)の図。(D) ヒトサンプルにおける免疫染色のための「ジェルパンチング」法の図示。カバースリップ(1)に重合したゲルは特定の生検パンチ(P)で切断され、直径0.4cmのゲルパンチ(2)が形成され、シリコンプレート(右側パネル)で染色することで抗体量を減らすことができます。(E) ヒトおよび T. brucei サンプルにおける免疫染色のための「ゲル切断」法の図示。重合および変性ゲル(1)は4つの等しい断片(2)に切断され、抗体を用いた12ウェルプレート内でインキュベーションされます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

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図3。ヒト細胞におけるクライオ固定とPFA固定の比較。 (A) αβ-チューブリン(シアン)、ミトコンドリアATP合成酵素サブユニット5a(ATP5a、黄色)、NHSエステル(赤/灰色)染色された冷凍固定および拡張されたRPE1細胞の回転ディスク画像。膜ベースの小器官および中心細胞および繊毛(矢じり)を含む細胞骨格要素の両方が優れた保存状態であることを示している。スケールバー:10 μm(B, C) 凍結固定(B)およびPFA(C)RPE1細胞の回転ディスク画像。αβ-チューブリン(シアン)、ミトコンドリアのATP5a(黄色)、ホエスト(マゼンタ)染色され、一次繊毛(矢印、B'、C')とミトコンドリア(B"、C")を強調しています。クライオ固定とPFA固定が中心細胞と一次繊毛を同等に保存するなら、ミトコンドリア構造の保存に関しては、クライオ固定はPFAを大きく上回る(B"、C"- 赤い矢じりはミトコンドリアクリスタエを示し、凍結固定条件下でのみ確認)。スケールバー:それぞれ1、1、2.5μm。(D、E)αβ管状の黄色/灰色、ミトコンドリアATP5a(マゼンタ色)、ホエスト(BOPブルー)の凍結固定(D)およびPFA固定(E)有糸分裂RPE1細胞の回転円板画像は、クライオ固定により有密分裂紡錘体の拡張が促進され、有糸分裂紡錘体微小管の保存が良好であること(赤い矢印)が示されています。有糸分裂紡錘体の長さの測定値:凍結固定ではそれぞれ12μm、PFA固定は7μmです。スケールバー:10μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

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図4。 トリパノソーマ・ブルーシーにおけるクライオ固定とPFA固定の比較。 (A、 B)ミトコンドリアスレオニン脱水素酵素(TDH、黄色)およびNHSエステル(赤/灰色)染色されたクリオ固定・拡張された T. brucei の前環細胞の共焦点画像。特有のミトコンドリアの優れた保存と細胞の一般的な構造を示しています。スケールバー:5μm(C, D) PFA固定および拡大した T. brucei プロサイクリック細胞の共焦点画像で、TDH(黄色)およびNHSエステル(赤/灰色)染色。ミトコンドリア構造の保存とネットワークを比較すると、クライオ固定はPFA固定を上回ります。スケールバー:5 μm.(E, F) クライオ固定(E)およびPFA固定(F)および拡張された T. brucei のプロサイクリック細胞の焦点画像で、内質網マーカーBiPおよびNHSエステル(グレー)を染色し、クリオ固定により小胞体の拡張と保存が促進されることが示されています。スケールバー:5μm。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

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図5。冷凍睡眠の問題。(A,B)αβ-チューブリン(シアン)、ミトコンドリアATP合成酵素サブユニット5a(ATP5a、黄色)、NHSエステル(赤)に染色された冷凍固定および拡張RPE1の回転ディスク画像。これらはクライオ固定の古典的な効果、すなわち亀裂(A、矢印)と気泡(B、矢印)を示している。亀裂は細胞小器官の超構造(A)には影響しませんが、細胞質(B)に気泡が存在することは固定不良を示し、細胞内小器官(ミトコンドリアや微小管、内セット)の保存を著しく変えます。スケールバー:5μmおよび2μm(インセット)。(C) 使用可能38%のナトリウムアクリレート溶液(無色で半透明(1)またはやや黄色で半透明(2)、膨張不可(黄色/オレンジで曇った3))を強調した異なるナトリウムアクリレート溶液の画像。この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

表1:溶液の保管条件 この表をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

表2:抗体の一覧 この表をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

表3:免疫染色の条件 この表をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本論文では、凍結固定と拡張顕微鏡(Cryo-ExM)を統合した詳細なプロトコルを提示し、構造歪みや抗原喪失など化学的固定に伴うアーティファクトを回避しつつ、細胞内区画を可視化する堅牢なアプローチを提供します。細胞構造をほぼネイティブ状態に保つことで、広範な固定最適化の必要性を排除し、より正確なタンパク質局在化を可能にします。

プロトコルは一般的に単純ですが、成功させるためには特に注意が必要です。クライオプランジングは特に敏感で、特定の材料( 材料表参照)と、特に液体エタン充填を扱う際の器用さが求められます。これは潜在的な落とし穴となります。凍結固定技術の事前知識は有利です。この方法を初めて採用する際は、クライオEM専門家や電子顕微鏡施設の管理者に相談することをお勧めします。膨張段階では、変性条件を厳守することが不可欠であり、偏差は試料の保存や膨張効率の両方を損なう可能性があります。最後に、すべての試薬の適切な保管条件( 表1参照)を維持することは、再現性と一貫した画像品質を確保するために非常に重要です。

本論文はCryo-ExMプロトコルのいくつかの主要な利点を強調しています。特に、クライオ固定は従来の固定法でよくある可溶性タンパク質の損失を最小限に抑え、膜の完全性をより良く保つことで細胞画像の精度を向上させます。この技術の大きな強みは、標準的な広視野顕微鏡や共焦点顕微鏡との互換性にあります。多くの他の超分解能法が専門的でしばしば高価な機器を必要とするのに対し、ExMは従来の蛍光顕微鏡を用いて実装可能です。ExMのもう一つの大きな利点は、その多様性です。この技術は、個々の細胞から複雑な組織まで幅広い生物学的サンプルに成功裏に応用されており、多様な研究分野での応用可能性を示しています。本論文では、このプロトコルがT. bruceiとヒト細胞という2つの非常に異なるモデルシステムとの互換性を強調していますが、より大きく複雑なサンプルでは手動のプランジではサンプル全体を保存できないため、高圧凍結固定が必要になることに注意してください。.拡張顕微鏡は、これまで解明が困難または不可能だったナノスケールの細胞構造を可視化する能力を革命的に変え、細胞生物学、発生生物学、神経科学などの分野での画期的な進展を可能にしました。特に、この手法は従来の光学顕微鏡ではしばしば不足している寄生虫学において画期的なものとなっています。多くの寄生虫にとって、超微細展開顕微鏡(U-ExM)は画期的な技術となり、アピコプラスト、コノイド、細胞骨格要素などの複雑な小器官を前例のない鮮明度(6,37,38)で高解像度でイメージングできるようになりました。これらの進展は、U-ExMがこれまでアクセスできなかった構造的詳細を明らかにし、細胞生物学、神経科学、寄生虫生物学における新たな発見の道を開き、潜在的な治療標的の探索を支援しています。さらに、ExMは一般的に使われる免疫蛍光抗体との互換性を維持しており、既存のワークフローへの統合を容易にしています。ほとんどの場合、蛍光顕微鏡やウェスタンブロッティングで通常使われる抗体は拡大した試料に対して効果的に作用し、特殊な試薬を必要としません。このアクセスのしやすさにより、Cryo-ExMは多くの生物学研究所にとって魅力的な選択肢となり、高度なイメージングシステムに伴うコストや複雑さを伴うことなく高解像度のイメージングを提供します。

利点があるにもかかわらず、ExMにはいくつかの制限があります。主な欠点は抗体の大量消費であり、特に限られた量で入手可能な自家製抗体ではコストがかかったり問題を生むことがあります。以下に、免疫染色に使用される抗体の量を減らすためにこのプロトコル戦略を提案する理由です(図2D,E)。膨張プロセスは試料の厚さも増加させ、標準的な顕微鏡対物レンズの作業距離の制限により、より深い構造の可視化に影響を及ぼすことがあります。この制約は、より大きく厚いサンプルの研究において特に困難であり、従来の顕微鏡では深い領域を効果的にイメージ化できない場合があります。さらに、組織の拡張は時に機械的な歪みをもたらすことがあり、正確な空間表現を確保するために慎重な検証と修正作業が必要です。最後に、古典的なExMはサンプル固定に厳密に依存しており、観察対象の生物サンプルや細胞内構造によって異なります。中心小体や繊毛は前置固定なしでも増殖できるほど安定していますが、細胞小器官はPFA、メタノール、グルターアルデヒドなどの異なる化学的固定を必要とし、これが偽物を生み出し、複数の細胞構造を同時に観察することを妨げる可能性があります。最後に、ExMは構造化照明顕微鏡(SIM)39、刺激放射空虚顕微鏡(STED)40、直接確率光学再構成顕微鏡(dSTORM)41、そして最近では光シート顕微鏡42などの超分解能イメージング手法と互換性があるため、本研究で述べたアプローチは細胞構造を高精度で調査するための多用途なツールを提供します。最近の研究では、クライオ固定と反復展開顕微鏡を組み合わせ、細胞の自然な状態を可能な限り保持しつつ解像度の限界をさらに押し広げました。

これらの高度なイメージング技術が細胞を本来の状態で捉えることを可能にすることで、Cryo-ExMは複雑な細胞過程の将来の研究を前例のない明瞭さで切り開きます。このアプローチはまた、相関光と電子顕微鏡(CLEM)の新たな可能性を開き、マルチモーダルイメージングの可能性をさらに高めています。

結論として、ExMはさまざまな生物学的サンプルに広く応用可能な超分解能イメージングの強力なツールです。標準的な顕微鏡との互換性、試料の種類の多様性、比較的単純な実装により、多くの研究室にとって魅力的な選択肢となっています。技術のさらなる進歩により、解像度、抗体の使用、サンプル取り扱いのさらなる改善が期待されており、その能力が向上し、幅広い生物学的応用により利用可能になることが期待されています。特にCryo-ExMは有望な進歩であり、細胞構造を非常に詳細に研究しつつ、その本来の完全性を保つ手段を提供し、最終的には現代顕微鏡の限界を押し広げています。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者たちは利益相反を認めていない

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ジェニファー・ヴィイヤールには、批評的な助言と原稿の読解に感謝いたします。RPE1細胞の画像取得において、SFR Santé Lyon-Est(UAR3453 CNRS、US7 Inserm、UCBL)の施設CIQLE(LyMIC会員)の貢献を認めます。私たちは、プランジャーとエタンへのアクセスを提供してくれたBICのモニカ・フェルナンデス・モンレアル氏、そしてCNRS-INSERMのサービス部門であるボルドーイメージングセンターおよびフランスの国立インフラ「バイオイメージング」のメンバーであるボルドー大学に、T . brucei の画像取得に感謝します。この研究はCNRS(T. brucei)およびINSERM(ヒト細胞)の支援を受け、以下の機関から資金提供を受けました。 国立研究機関(ANR-20-CE91-0003、ANR-19-CE17-0014からM.B)、LabExパラフラップ(ANR-11-LABX-0024)、およびセルヴォー研究基金(FRC-AP2024、M.L.)です。P.HはANR-OILの資金援助を受けました(ANR24-CE15-2171-01からL.R.まで)、L.KはANR-BBDIV(ANR-22-CE13-0014からB.D.まで)の支援を受けました。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
5MLチューブメタリックホルダードミニク・デュッチャーQB-E5フリーズ置換ステップ
620 マニュアルクライオプランジャーRHOSThttps://rhost-em.com/クライオフィクセーションのステップ
アセトン 99.8% アクロシールアクロス・オーガニクスキャット。番号67-64-1 フリーズ置換ステップ
アクリラミド 40%(AA)シグマ・オルドリッチA4058膨張手順 (錨を下ろす)
アクリル酸 シグマ・オルドリッチ8.00181 膨張手順(ポリマー)
過硫酸アンモニウム(APS)サーモ・フィッシャー17874膨張手順(ポリマー)
生検パンチドミニク・デュッチャーPUK-40変性前にゲルを切断するために必要なこと。
BSAシグマ・オルドリッチP1379免疫染色 
細胞チャンバー アットフルアインビトロジェンA7816イメージングチャンバーは24mmカバースリップに適応して撮影用に調整されました
セルチャンバー生涯のイメージングサービス10900イメージングチャンバーは18mmカバースリップに適応して撮影用です
カバースリップ 12mm ドミニク・デュッチャー100040増殖細胞/T.bruceiの付着
カバースリップ 24mm ドミニク・デュッチャー900547画像検査およびnbsp;
カバースリップ 18mmVWR631-0153画像検査およびnbsp;
エタンガス リンデ・ガズ88888DE冷凍固定に必要
ホルムアルデヒド36.5–38%(FA)シグマ・オルドリッチ F8775膨張手順 (錨を下ろす)
グルタラルドヘヒド 25%(GA)シグマ・オルドリッチ G5882フリーズ置換ステップ
グリセロール ユーロメデックス EU3550長期ゲル保存 
液体窒素など;リンデ・ガズ2200975クライオフィクサーション(システムの冷却)に必要です
マイクロチューブクリアロック5ml ドミニク・デュッチャー390932A凍結代替に必要
ニードル18Gドミニク・デュッチャー050123Bアセトンの採取が必要でした
N,N-メチルビサクリルアミド 2%(BIS)シグマ・オルドリッチM1533、SIGMA膨張手順(ポリマー)
パラホルムアルデヒド 16%(PFA)EMSキャット。番号15710フリーズ置換ステップ
ポリ-D-リジンシグマ・オルドリッチP1024サンプル/イメージング用のコーティングカバースリップ 
ポリLリジンシグマ・オルドリッチP1274サンプル/イメージング用のコーティングカバースリップ 
圧力再調整装置とnbsp;リンデ・ガズCPLH0SJ-LIN224エタンの撹乱を可能にする圧力再調整装置(クライオ固定)
Seringe Terumo 10 mlドミニク・デュッチャー50132アセトンの採取が必要でした
シリコーンエラストマーキットダウ4001834シリオン井戸板(免疫染色)の準備キットおよびnbsp;
アクリレートナトリウム 97-99%(水楊酸)シグマ・オルドリッチ408220膨張手順(ポリマー)
AKサイエンティフィックR624膨張手順(ポリマー)
ドデシル硫酸ナトリウムユーロメデックスEU0660膨張過程(変性)
テトラメチルエチレンジアミン(TEMED)サーモ・フィッシャー17919膨張手順(ポリマー)
チューブ サーモ・サイエンティフィック8060-0060エタンの攪乱(クライオ固定)用チューブ
トゥイーン-20ユーロメデックス1005-7免疫染色 
ピンセット デュモン n°5 ファインサイエンスツールズ11255-20カバースリップの操作とnbsp;

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jacquemet, G., et al. The cell biologist's guide to super-resolution microscopy. J Cell Sci. 133 (11), jcs240713(2020).
  2. Chen, F., Tillberg, P. W., Boyden, E. S. Optical imaging: expansion microscopy. Science. 347 (6221), 543-548 (2015).
  3. Laporte, M. H., et al. Time-series reconstruction of the molecular architecture of human centriole assembly. Cell. 187 (9), 2158-2174 (2024).
  4. Steib, E., et al. WDR90 is a centriolar microtubule wall protein important for centriole architecture integrity. Elife. 9, e57205(2020).
  5. Le Borgne, P., et al. The evolutionary conserved proteins CEP90, FOPNL, and OFD1 recruit centriolar distal appendage proteins to initiate their assembly. PLoS Biol. 20 (9), e3001782(2022).
  6. Bertiaux, E., et al. Expansion microscopy provides new insights into the cytoskeleton of malaria parasites including the conservation of a conoid. PLoS Biol. 19 (3), e3001020(2021).
  7. Liffner, B., et al. Atlas of Plasmodium falciparum intraerythrocytic development using expansion microscopy. Elife. 12, RP88088(2023).
  8. Amodeo, S., et al. Characterization of the novel mitochondrial genome segregation factor TAP110 in Trypanosoma brucei. J Cell Sci. 134 (5), jcs254300(2021).
  9. Corrales, R. M., et al. Tubulin detyrosination shapes Leishmania cytoskeletal architecture and virulence. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (3), e2415296122(2025).
  10. Brunet, M., et al. Drosophila Alms1 proteins regulate centriolar cartwheel assembly by enabling Plk4-Ana2 amplification loop. EMBO J. 44 (8), 2396(2025).
  11. Langner, E., et al. Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM) of mouse and human kidneys for analysis of subcellular structures. Cytoskeleton (Hoboken). 81 (11), 618-638 (2024).
  12. Mercey, O., et al. The connecting cilium inner scaffold provides a structural foundation that protects against retinal degeneration. PLoS Biol. 20 (6), e3001649(2022).
  13. Steib, E., et al. TissUExM enables quantitative ultrastructural analysis in whole vertebrate embryos by expansion microscopy. Cell Rep Methods. 2 (10), 100311(2022).
  14. Freifeld, L., et al. Expansion microscopy of zebrafish for neuroscience and developmental biology studies. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (50), E10799-E10808 (2017).
  15. Yu, C. J., Orozco Cosio, D. M., Boyden, E. S. ExCel: super-resolution imaging of C. elegans with expansion microscopy. Methods Mol Biol. 2468, 141-203 (2022).
  16. Tillberg, P. W., et al. Protein-retention expansion microscopy of cells and tissues labeled using standard fluorescent proteins and antibodies. Nat Biotechnol. 34 (9), 987-992 (2016).
  17. Gambarotto, D., et al. Imaging cellular ultrastructures using expansion microscopy (U-ExM). Nat Methods. 16 (1), 71-74 (2019).
  18. Ku, T., et al. Multiplexed and scalable super-resolution imaging of three-dimensional protein localization in size-adjustable tissues. Nat Biotechnol. 34 (9), 973-981 (2016).
  19. Schnell, U., et al. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nat Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
  20. Dubochet, J. Cryo-EM-the first thirty years. J Microsc. 245 (3), 221-224 (2012).
  21. Neuhaus, E. M., et al. Ethane-freezing/methanol-fixation of cell monolayers: a procedure for improved preservation of structure and antigenicity for light and electron microscopies. J Struct Biol. 121 (3), 326-342 (1998).
  22. Kellenberger, E. The potential of cryofixation and freeze substitution: observations and theoretical considerations. J Microsc. 161 (Pt 2), 183-203 (1991).
  23. Laporte, M. H., et al. Visualizing the native cellular organization by coupling cryofixation with expansion microscopy (Cryo-ExM). Nat Methods. 19 (2), 216-222 (2022).
  24. Hinterndorfer, K., et al. Ultrastructure expansion microscopy reveals the cellular architecture of budding and fission yeast. J Cell Sci. 135 (24), jcs260240(2022).
  25. Mikus, F., Dey, G. Ultrastructure expansion microscopy (U-ExM) of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods Mol Biol. 2862, 47-59 (2025).
  26. Ben Chaabene, R., et al. Toxoplasma gondii rhoptry discharge factor 3 is essential for invasion and microtubule-associated vesicle biogenesis. PLoS Biol. 22 (8), e3002745(2024).
  27. Shah, H., et al. Life-cycle-coupled evolution of mitosis in close relatives of animals. Nature. 630 (8015), 116-122 (2024).
  28. Klena, N., et al. An in-depth guide to the ultrastructural expansion microscopy (U-ExM) of Chlamydomonas reinhardtii. Bio Protoc. 13 (17), e4792(2023).
  29. van den Hoek, H., et al. In situ architecture of the ciliary base reveals the stepwise assembly of intraflagellar transport trains. Science. 377 (6605), 543-548 (2022).
  30. Mikus, F., et al. Charting the landscape of cytoskeletal diversity in microbial eukaryotes. bioRxiv. , (2024).
  31. Petrich, A., et al. Expanding insights: harnessing expansion microscopy for super-resolution analysis of HIV-1-cell interactions. Viruses. 16 (10), 1610(2024).
  32. Louvel, V., et al. iU-ExM: nanoscopy of organelles and tissues with iterative ultrastructure expansion microscopy. Nat Commun. 14 (1), 7893(2023).
  33. Lemaître, F., et al. Unveiling the molecular architecture of T cells and immune synapses with cryo-expansion microscopy. bioRxiv. , (2025).
  34. Millierioux, Y., et al. De novo biosynthesis of sterols and fatty acids in the Trypanosoma brucei procyclic form: carbon source preferences and metabolic flux redistributions. PLoS Pathog. 14 (5), e1007116(2018).
  35. Bangs, J. D., et al. Molecular cloning and cellular localization of a BiP homologue in Trypanosoma brucei: divergent ER retention signals in a lower eukaryote. J Cell Sci. 105 (Pt 4), 1101-1113 (1993).
  36. Dolgin, E. 'Expansion microscopy' turns ten: how a tissue-swelling method brought super-resolution imaging to the masses. Nature. 637 (8046), 752-754 (2025).
  37. Tosetti, N., et al. Essential function of the alveolin network in the subpellicular microtubules and conoid assembly in Toxoplasma gondii. Elife. 9, e56635(2020).
  38. Gorilak, P., et al. Expansion microscopy facilitates quantitative super-resolution studies of cytoskeletal structures in kinetoplastid parasites. Open Biol. 11 (9), 210131(2021).
  39. Halpern, A. R., et al. Hybrid structured illumination expansion microscopy reveals microbial cytoskeleton organization. ACS Nano. 11 (12), 12677-12686 (2017).
  40. Gao, M., et al. Expansion stimulated emission depletion microscopy (ExSTED). ACS Nano. 12 (5), 4178-4185 (2018).
  41. Zwettler, F. U., et al. Molecular resolution imaging by post-labeling expansion single-molecule localization microscopy (Ex-SMLM). Nat Commun. 11 (1), 3388(2020).
  42. Daetwyler, S., Fiolka, R. P. Light-sheets and smart microscopy, an exciting future is dawning. Commun Biol. 6 (1), 502(2023).

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