このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

心筋損傷の正確かつ信頼性の高い分析のための顕微鏡2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム塩化物アッセイ

845 閲覧数

⸱

DOI：

10.3791/68596

⸱

2025年11月28日

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Molecular Cardiology, Medical Faculty and University Hospital Düsseldorf, Heinrich Heine University of Düsseldorf, 2Department of Anesthesiology and Perioperative Medicine, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University, 3Shanghai Key Laboratory of Anesthesiology and Brain Functional Modulation, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University, 4Clinical Research Center for Anesthesiology and Perioperative Medicine, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University, 5Translational Research Institute of Brain and Brain-Like Intelligence, Shanghai Fourth People's Hospital, School of Medicine, Tongji University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

現在の2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム塩化物(TTC)アッセイは、心筋損傷を顕微鏡的解像度で解析できる洗練されたTTC染色プロトコルを導入し、細胞レベルでの梗塞サイズと心筋細胞の生存率を正確かつ信頼性の高い評価を可能にする高品質な画像を生成します。

要約

本プロトコルでは、細胞分解能での心筋梗塞(MI)を正確かつ信頼性の高い解析のために、2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム塩化物(TTC)を用いた洗練された手法を提示します。このプロトコルは、心梗塞後24時間経過後に行う2段階のTTC染色手順を含みます。すなわち、1%のTTC溶液を大動脈カニューレを介して冠動脈血管に逆行灌流する灌流、そしてその後、心臓を4°CのTTC溶液に一晩培養する浸漬です。染色後、心臓はOCT化合物に埋め込まれ、100μm間隔で50μm厚の断片に横断して冷凍解剖されます。ザンボーニ固定剤による24時間の固定処理の後、顕微鏡検査で活発な心筋(深赤色)と壊死組織(黄色)の間に明確で明確な境界線が見分けられます。特筆すべきは、この顕微鏡的TTCアッセイにより、急性期(MI後24時間)だけでなく、7日を超える長期にわたるMI検出も可能である。顕微鏡的TTCアッセイは複数層画像(1心臓あたり80スライス)を生成するため、私たちは大規模画像データセットの迅速かつ効率的な解析を可能にし、数分以内に全身の梗塞サイズを定量化できる、堅牢で色ベースの半自動化アルゴリズムを開発しました。これらの改良により、現在のアプローチはTTC染色プロセスを大幅に洗練させ、心臓虚血損傷を調査する検査室にとって広く有用で有用なツールを提供します。

概要

過去20年間、心臓保護は重度の虚血性心臓損傷後の心筋細胞保存の重要な戦略として引き続き追求されてきました1。実験的および臨床的場面の両方において、心筋損傷の最終的な範囲は、心臓保護介入の効果を評価する上で重要な指標です。したがって、梗塞の大きさの信頼性と正確な評価は非常に望ましく、根本的に重要です。

齧歯類モデルでは、死後の梗塞サイズを評価する標準プロトコルは主にミトコンドリア脱水素酵素の活性に依存しており、これは無色化合物2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム塩化物(TTC)を活性細胞内で赤色沈殿物に変換し、壊死組織では淡い灰色のまま残る3。TTCベースの染色は簡単でコスト効率が良いものの、いくつかの方法論的課題と本質的な制約を伴います。これには、TTC溶液で攣縮を起こした心臓の切片が含まれ、これにより組織が大きく歪み、平面測定のために平らに横たわることができなくなります。試料処理中の不均一なスライス厚さ;また、発尿境界の正確な区分を妨げる画質の低さも問題です。近年、サンプル準備プロセスにはアクリル心臓マトリックス4 の使用や、心臓を半凍結してスライシングを容易にする3などの技術的改良が導入されています。これらの改良により組織切断の実用性は大幅に向上しましたが、従来の手法は厚い心臓切片の粗い画像撮影に依存しており、しばしば変動的かつ最適でない画像品質5を生み出し、色のコントラストが不足して梗塞測定に大きな主観性が生じることがあります。さらに、従来の方法は全心組織の使用を必要とし、同じ組織サンプルに対して多目的解析を行う必要があり、例えば心臓の生存に関与する主要なシグナル伝達カスケードを特定するための調節タンパク質の免疫共染色などを行いません。その結果、さまざまな研究課題に十分に対応するためには、多くの動物が必要となることが多いです。

これらの制限を克服するために、妊活期染色の顕微鏡画像に適したプロトコルを開発しました。この方法は、「パーフュージョン+イマージョン」染色工程と、心臓組織を光学顕微鏡によるイメージングに最適な薄切りにクリオセクション化することを組み合わせています。この方法は最近報告されましたが、詳細な実験手順を提供することで実用性とアクセスのしやすさが高まると考えています。さらに、顕微鏡的TTC法は複数の心臓切片層からなる高解像度画像を生成するため、大規模な画像データセットの解析に時間がかかる問題に対応する堅牢な色ベースの半自動アルゴリズムを開発しました。本手法により、梗塞領域を迅速に検出し、数分以内に全身の梗塞大きさを定量化できます。

全体として、ここで提示されるプロトコルは貴重なツールとして機能し、研究者がこの手法を効率的かつ正確に実装することを可能にします。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

すべての実験はドイツ・ノルトライン・ヴェストファーレンの LANUV によって承認され、ARRIVEガイドラインおよびNIHの実験動物ケア・利用ガイドに従って実施されました。必要な機器や化学薬品はすべて材料表に記載 されています。

1. ランゲンドルフ逆灌流システムの設置

注:このシステムは、20ゲージの鈍針から作られた大動脈カニューレに接続された2つのガンストップコックと、洗浄液用(リン酸緩衝生理食塩水(PBS)ポート)とTTC点滴用(TTCポート)用の2つの注入ポートで構成されています。三方向ストップコックの方向を交互にすることで、保有液を心臓に交換的に届けることができます。

  1. 装置を150mmのペトリ皿に水平に固定し、粘着テープで後回の動作で不要な動きを防ぎます。
  2. 心臓を平らに置いたとき、カニューレの先端を底部より1mm上に調整し、大動脈根の高さに合わせて調整します。
  3. PBSポートから10mLのシリンジを使って氷のように冷たいPBSをシステムに予備充填します。
  4. 新しい染色液(1%TTCをPBSに溶解)を準備します。各心臓に対して最低6mLの容量が必要です。
    注意:TTCは一般的に危険とされ、軽度の皮膚刺激や重度の目の刺激を引き起こす可能性があり、吸入すると有害になるため注意が必要です。廃棄物や残留物は地方自治体の要件に従って処分してください。
  5. 3mLのシリンジを使ってTTCポートに染色液をあらかじめ充填してください。
  6. システム内に意図しない気泡が入らないように注意してください。気塞が原因で着色を妨げる可能性があります。ほとんどの場合、システム内に気泡が見えます。存在する場合は、PBSを抜いて補充し、立ったカニューレの位置で三方向ストップコックを優しく叩いて除去してください。
  7. 6-0シルク縫合糸で緩い半角い結び目を作り、カニューレの遠位端に当てて、後で大動脈根を固定します。

2. 心臓サンプルの調製

注:本研究ではC57BL/6Jマウス(20-25g)を使用しました。実験的心筋梗塞(MI)は、左前降動脈(LAD)を外科的に結紮して30〜60分間誘導しました(以下に説明)。心筋筋誘導法は以前に8 回報告されており、本論文では詳細は記載されていません。特に記載がない限り、心筋梗塞後24時間以内に心臓サンプルを採取しました。

  1. MIマウスをケージから取り出し、深層イソフルラン麻酔(3%、v/v)下で頸椎脱臼で安楽死させます。
    注意:すべての安楽死手続きは、安楽死の理由や使用方法を含め、地域の規則に従って適切に文書化・報告されなければなりません。
  2. 安楽死した動物を手術台に移し、四肢すべてを粘着テープで固定してください。
  3. 腹部中央から前足中央部の毛皮をマイクロ解離鉗子とハサミで除去します。
  4. 腹筋壁、横隔膜のすぐ下に2cmの横切開を入れ、その後の開胸術を可能にします。
  5. 横隔膜を細いハサミで広げて心臓を露出させ、その後、皮膚、筋肉、肋骨に両側切開をして胸腔を開きます。
  6. 横隔膜を両側に切り戻し、胸骨を持ち上げて心臓を完全に露出させます。
  7. すぐに心表面に氷のように冷たいPBS20mLを注ぎ、心拍を止めます。
  8. 心臓と周囲の組織(肺と食道)を切除し、組織塊を氷のように冷たいPBSを入れた50mLのビーカーに約1分間移し、心拍を落ち着かせます。
  9. 心臓を150mmのペトリ皿に移し、細かい鉗子とハサミを使って双眼顕微鏡の下で大動脈根の結合組織を切除します。
  10. 胸腺を優しく取り除き、上行大動脈を露出させます。
  11. 大動脈根を結合組織を切り離してトリミングします。
  12. 細いピンセットで大動脈断端を持ち上げ、すでにPBSとTTC染色液で満たされた灌流装置に接続されたカニューレの上に取り付けます。挿入時には細いピンセットを使って大動脈根壁を安定させてください。
  13. カニューレにあらかじめ作られた緩い結び目で大動脈を固定します。PBSで逆灌流している間、カニューレと心臓を慎重に検査してください。心臓の充填は、心室の膨隆によって視覚的に確認できます。これは、心臓に入るPBSの量が増加するにつれてです。
  14. 心臓を自然で適切な位置に保つために、心臓の外部組織(肺と食道)はそのままにしておきましょう。

3. TTC染色

  1. カノレーションが固定されたら、心臓を湿ったティッシュペーパーで覆います。
  2. 心臓を氷のように冷たいPBSを2〜3mL/分のペースで3分間、事前に接続した10mLシリンジで心臓を洗浄し、心臓の溶出液がきれいになるまで続けます。これにより、心臓や冠動脈に残る血液は最小限に抑えられます。この段階では、灌流時に過度な圧力をかけることを避けてください。これは梗塞した心室の破裂を引き起こす恐れがあります。
  3. 双眼顕微鏡で心臓を調べ、大動脈根部に漏れがないか、灌流圧で適切に膨らんでいるかを確認します。
  4. 三方向ストップコックをTTC溶液の方に向け、TTCポートから30秒かけてゆっくりと1mLの染色液を注入します。
  5. 5分後に1mLのTTC溶液を再度注入し、さらに5分後(最初のTTC点滴から10分後)にこの手順を繰り返します。15分間の3回の輸液には合計3mLのTTC溶液が必要です。
  6. 双眼顕微鏡で心臓表面を調べてください。この時点で、生存可能な心筋(深赤色)と壊死組織(淡い灰色)の明確な区別が見えているはずです。
  7. 細かいハサミで心臓以外の組織をすべて取り出し、染色した心臓を3 mLのTTC溶液を含む15 mLの円錐形チューブに移します。
  8. 円錐形の管を4°Cの温度で一晩置き、2回目の浸漬処理を行います。

4. 組織ブロックの調製

  1. 円錐形のチューブから心臓を取り出し、ティッシュペーパーで慎重に乾かします。この時点で、生存可能な心筋の着色がより顕著になり、灌流されていない心筋(心外膜および場合によっては心内膜領域)でも薄い赤色が現れます。
  2. 1mLの注射器を使って、最適切断温度(OCT)化合物を注入した鈍った湾曲した20ゲージのカニューレを充填します。
  3. 細かいハサミで三尖弁を切除し、カニューレを右心室に挿入します。
  4. 空洞をOCT化合物(約50〜80μL)で満たし、逆流が観察されたら注入を止めます。
  5. 僧帽弁を露出させ、カニューレを左心房から挿入し、僧帽弁を左心室に挿入します。
  6. 腔内にOCT化合物(約80μL)を優しく注入し、大動脈からの流出が確認されたら輸液を停止します。
  7. アルミニウムホイル製の直径1cmの小さな円筒形カプセルを準備し、300μLのOCT化合物を充填します。
  8. 心臓をカプセルの頂点下向きに慎重に入れ、垂直方向に調整します。上から下から見ると、頂点はどちらの側にも過度に突き出てはいけません。
  9. カプセルを-30°Cから-40°Cで事前に冷却した2-メチルブタン溶液に浸します。
  10. サンプルを溶液中に5〜10分間置いて固まらせてから組織ブロックを形成します。
  11. 組織ブロックにラベルを付け、さらに組織学的解析のために-80°Cで保存してください。

5. 冷凍切房と固定

  1. 組織ブロックをOCT化合物を使ってクライオスタットチャックに取り付けます。
  2. チャックをクライオスタットに入れ、温度を約-24°Cに設定します。
  3. 組織ブロックを切り、頂点が見えるまで切ります。
  4. 断面厚を50μmに設定し、2枚ごとにスライスを回収し、100μm間隔を作ってスライスを交換します。
    注意:冷凍切開時の組織折りたたみは避けてください。これは空の心室腔をOCT化合物で満たすことでほぼ最小限に抑えられます(ステップ4.4-4.6参照)。
  5. ガラス顕微鏡スライド上でスライスを順番に整列し、1枚につき8枚のピースを配置します。合計で80セクション、すなわち10枚のスライドが1心臓あたり期待されます。
  6. スライドを最低設定で室温の空気流で約10分間乾燥させます(加熱は不要)。
  7. スライドをザンボーニ溶液(2%パラホルマルデヒドと0.4%ピクリン酸を含む固定液)を充填した染色室に浸します。
    注意:ザンボーニの固定剤はアレルギー性皮膚反応を引き起こす可能性があり、遺伝的欠陥や発がん性の原因と疑われています。廃棄物や残留物は地方自治体の規則に従って処分してください。
  8. 心臓組織を4°Cで一晩固定します。この長期固定により、固定過程で発生した気泡が心臓組織表面に残らないことが保証されます。
  9. 固定後は、固定剤からスライドを取り出し、PBSで3回洗い流します。
  10. スライドはマウントメディウムで取り付け、カバースリップでカバーカバーをカバーします。この工程が終わると、ハートスライドは画像取得の準備が整います。
  11. サンプルは常温のスライドボックスに保存してください。
    注:フォルマザンの沈殿物は水に溶けないため、染色は強度を損なうことなく何年も保存可能です。

6. イメージングと現像

  1. 1.25倍の対物レンズを使った光学顕微鏡を設置し、CellSensソフトウェアを使ってイメージングを行います。
  2. 心臓の部分を視野の中央に配置します。
  3. 必要に応じて露出時間、ピント、ホワイトバランスを調整してください。
  4. 各セクションの画像を撮影し、同じハートの画像をすべて専用フォルダに保存してください。
  5. Rスクリプト(補足ファイル1)をRStudioプラットフォームにコピーし、Rベースの自動アルゴリズムを実行してMIを評価します。このアルゴリズムは各スライスに対してプラニメトリック梗塞サイズを計算し、心臓全体の総梗塞容積を計算します。
  6. データセットをExcelファイルにエクスポートし、必要に応じてデータを分析します。
  7. 各ハートの画像をすべてImageJプラットフォームにインポートし、その後の3D再構築を行います。
  8. ImageJプラットフォームのポップアップメニューを使って、すべての画像を一貫した順序で積み重ねてください。
  9. 表面プロット関数を使って3D構造を作成します。
  10. ボリュームビューアウィンドウを開き、3D投影用の全パラメータを調整してください。
    注:免疫組織化学9の方法論および従来のTTC染色4,5の動画は既に報告されており、本論文には含まれていません。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

顕微鏡下TTC染色を行う際の主要な手順は 図1に示されています。TTC染色を2回行った後、心臓の表面に明確なパンチ模様が現れました。心臓全体を100μm間隔で連続的に切断したことで約80の組織切片が得られ、その結紮部位は60番目の スライス付近に位置しました。各切片では、生存可能な心筋細胞(viaCM)の深赤色染色が、ピクリン酸で標識された黄色の壊死組織(necCM)と明確に区別され、鮮明な境界線が見られました(図2A)。全切片の3D再構築により、心臓内のviaCMおよびnecCMの空間分布と体積がさらに可視化されました(図2B)。画像品質を従来の染色プロトコルと直接比較すると、顕微鏡プロトコルの方が境界がより明確かつ鋭く、生存可能な信号比と梗塞信号比が改善されることがわかります(

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

心筋梗塞(MI)は、長期にわたる心筋虚血によって引き起こされ、世界的な健康問題として依然として大きな問題となっています。なぜなら、虚血性損傷は効果的な血液循環に必要な心臓の収縮機能を損なうことが多いからです。過去数十年にわたり、虚血性ストレスに対する心臓の抵抗性を高める介入や化合物の特定に大きな努力が注がれてきました。酵素放出11、虚血後機能回復、培養細胞における細胞生存指標などの代替的評価項目も検討されています13が、抗梗塞介入の有効性を確定するには組織壊死の直接的な定量化のみが可能となります。したがって、無損な心臓における心筋細胞の生存可能性および心筋梗塞を早期に検出する信頼性の高い早期方法が、この分野の研究を前進させるために不可欠です14。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者たちは競合する金銭的利害関係がないと宣言しています。

謝辞

この研究はFoKo 23/2013およびデュッセルドルフ心血管研究所(CARID)の資金提供を受けました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.25倍の目標オリンポスプランアポ 1.25X/0.04イメージング
10 mL シリンジャーB.ブラウム4617100V逆灌流
2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム塩化物ミリポール1.08380.0100化学物質
20GカニューレBD305895逆灌流
3 mLシリンガーB.ブラウム4617022V逆灌流
3ウェイストップコックB.ブラウム16494C逆灌流
アクアマウント BDH362262Hシロセクション
バランスオハウス該当なし化学薬品の計量
双眼鏡ミクロスコープライカMZ6カニュレーション
C57BL/6Jジャンヴィエ該当なし動物
カメラオリンポスUC30イメージング
カバースリップエプレディアBB02400500A113MN20シロセクション
クライオスタットライカM850シロセクション
二重蒸留水ミリポール該当なし溶解化学物質
細かい解剖用ハサミエスカラップBC702R外科器具
微かな微細解離鉗子とnbsp;エスカラップFM001R外科器具
ガラス顕微鏡スライドエンゲルブレヒト11102シロセクション
イメージJNIH1.54gイメージング処理
イソフルランピラマル14150097146754化学物質
イソプロパノールロス 0733.1化学物質
光顕微鏡オリンポスBX61イメージング
微小解離鉗子およびnbsp;F.S.T.11152-10外科器具
OCTコンパウンドさくら4583化学物質
ペトリ皿テルノ・サイエンティフィック172931逆灌流
リン酸塩緩衝生理食塩水ロス9143.1化学物質
RstudioPosit Software2024.09.0イメージング処理
シルク縫合F.S.T.18020-60逆灌流
ソフトウェアオリンポスCellSens V3.2イメージング
ステンレス解剖はさみエスカラップBC257R外科器具
ザンボーニソリューションモルフィスト12773.0050化学物質

参考文献

  1. Bolli, R., Becker, L., Gross, G., Mentzer, R., Balshaw, D., et al. Myocardial protection at a crossroads: the need for translation into clinical therapy. Circ Res. 95 (2), 125-134 (2004).
  2. Murphy, E., Steenbergen, C. Mechanisms underlying acute protection from cardiac ischemia-reperfusion injury. Physiol Rev. 88 (2), 581-609 (2008).
  3. Bohl, S., Medway, D. J., Schulz-Menger, J., Schneider, J. E., Neubauer, S., et al. Refined approach for quantification of in vivo ischemia-reperfusion injury in the mouse heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 297 (6), H2054-H2058 (2009).
  4. Liepinsh, E., Kuka, J., Zvejniece, L., Vilskersts, R., Dambrova, M. Rodent heart and brain tissue preparation for digital macro photography after ischemia-reperfusion. J Vis Exp. (180), e62942(2022).
  5. Kim, S. -C., Boehm, O., Meyer, R., Hoeft, A., Knüfermann, P., et al. A murine closed-chest model of myocardial ischemia and reperfusion. J Vis Exp. (65), e3896(2012).
  6. Lindsey, M. L., et al. Guidelines for experimental models of myocardial ischemia and infarction. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 314 (4), H812-H838 (2018).
  7. Ding, Z., et al. A refined TTC assay precisely detects cardiac injury and cellular viability in the infarcted mouse heart. Sci Rep. 14 (1), 25214(2024).
  8. Zhu, H., et al. IL-6 coaxes cellular dedifferentiation as a pro-regenerative intermediate that contributes to pericardial ADSC-induced cardiac repair. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 44(2022).
  9. Zhu, H., et al. Sfrp1 as a pivotal paracrine factor in the trained pericardial stem cells that foster reparative activity. Stem Cells Transl Med. 13 (2), 137-150 (2023).
  10. Yellon, D. M., Hausenloy, D. J. Myocardial reperfusion injury. N Engl J Med. 357, 1121-1135 (2007).
  11. Li, C., Chen, M., Zhang, D., Xu, T., Wang, Z. Cardiac injury induced by obstructive jaundice: a comprehensive review. Perioper Precis Med. 28 (1), 28-38 (2025).
  12. Chang, X., et al. ß-tubulin contributes to Tongyang Huoxue decoction-induced protection against hypoxia/reoxygenation-induced injury of sinoatrial node cells through SIRT1-mediated regulation of mitochondrial quality surveillance. Phytomedicine. 108, 154502(2023).
  13. Li, Z., Hu, B., Zou, X. Research advances in understanding the role and mechanism of pyroptosis in myocardial ischemia-reperfusion injury. Perioper Precis Med. 2 (2), 52-63 (2024).
  14. Ouyang, W., et al. An immunostaining-based approach for assessing myocardial viability in the infarcted mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 12, 1598314(2025).
  15. Benedek, A., et al. Use of TTC staining for the evaluation of tissue injury in the early phases of reperfusion after focal cerebral ischemia in rats. Brain Res. 1116 (1), 159-165 (2006).
  16. Lindsey, M. L., et al. Guidelines for in vivo mouse models of myocardial infarction. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 321 (6), H1056-H1073 (2021).
  17. Lujan, H. L., Janbaih, H., Feng, H. -Z., Jin, J. -P., DiCarlo, S. E. Myocardial ischemia, reperfusion, and infarction in chronically instrumented, intact, conscious, and unrestrained mice. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 302 (12), R1384-R1400 (2012).
  18. Redfors, B., Shao, Y., Omerovic, E. Myocardial infarct size and area at risk assessment in mice. Exp Clin Cardiol. 17 (4), 268-272 (2012).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

TTC 3D
心筋損傷の正確かつ信頼性の高い分析のための顕微鏡2,3,5-トリフェニルテトラゾリウム塩化物アッセイ
お問い合わせ
図書館への推薦

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。