方法論記事

質量分析に基づくラクチルロームと乳酸化タンパク質の確認

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DOI：

10.3791/68597

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2026年4月24日

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1Department of Immunology and Cell Biology, Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de Sherbrooke, 2Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Sherbrooke (CRCHUS), 3Institut de Recherche sur le Cancer de l'Université de Sherbrooke (IRCUS)

この記事について

サマリー

このプロトコルは、食道扁平上皮がん細胞株を用いてタンパク質ラクチル化を解析する方法を説明しています。このプロセスは、細胞培養から候補者の確認までのタンパク質ラクチル化を分析し、ラクチル化に基づく質量分析解析や免疫沈殿による確認を含みます。

要約

2019年に初めて特定されたラクチル化は、リジン残基に対する新しい翻訳後修飾(PTM)であり、その後、複数の病理や生理学的文脈で関心を持つことが示されています。このラクチル化は2つの異性体(L-ラクチル化とD-ラクチル化)を持ち、ターゲットタンパク質の複合体形成、細胞の局在、安定性を変化させることが知られています。このプロトコルは、TE11食道扁平上皮がん細胞株を例に、細胞培養からラクチル化標的の確認に至るまでのラクチル化解析方法を説明しています。以下のプロトコルでは、質量分析(MS)解析のためのペプチドのL-ラクチルリシン(KL-LA)特異的免疫沈殿(IP)によるラクチル化タンパク質の同定の詳細を提供します:(1) タンパク質抽出、(2) タンパク質還元、アルキル化および消化、(3) タンパク質精製およびペプチド濃度、(4) KL-LA ビーズを用いたIP、(5) KL-LA ペプチド濃度。これらのステップに続き、MSの生データの解析を行い、ラクチル化部位を特定し、これらのラクチル化タンパク質のIPによる確認を行います。この方法を用いることで、100から500のペプチドの範囲を同定でき、関心のあるラクチル化タンパク質を確認できます。結論として、ラクチル化タンパク質の研究は、正常状態および疾患状態の両方におけるPTM駆動細胞シグナル伝達の理解を深める可能性があります。

概要

ラクチル化は、解糖系由来の代謝物を用いてリジン残基に対する翻訳後修飾(PTM)です。L-ラクチルCoAとラクトイルグルタチオンは、それぞれL-ラクチル化(KL-LA)およびD-ラクチル化(KD-LA)の基質です1,2。L-ラクチル化は、アセチルトランスフェラーゼなどの酵素を関与させる酵素的プロセスです。3,4。一方、D-ラクチル化は、ラクトイルグルタチオンとリジン残基5との求核的置換による非酵素的プロセスです。HDAC1-3のような脱アセチル化は動的プロセスとして、ラクチル化の消しゴムとして示唆されています。2019年の発見以来、複数の病理や生理学的文脈で関心を持つことが示されています。このPTMは、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)-タンデム質量分析(MS/MS)を用いて72.021 Daの質量シフトを観察したことで、ヒストン上で初めて同定されました。3。それ以降、ラクチル化はヒストン以外のタンパク質でも検出され、文脈に応じて修飾タンパク質の機能的多様性、局所化、安定性に影響を与えることが示されています。

PTMはしばしば低存在量であり、動 的かつ一時的なプロセスの一部であるため、研究対象のPTMの免疫沈殿(IP)による濃縮が求められます。その後、MSはホスホプロテオームやユビキチン化プロファイリング11など、消化ペプチド上のPTM結合プロテオームを記述するために頻繁に用いられます。他のPTM、ラクチルロームや濃縮ラクチル化ペプチドと同様に、MSベースのプロテオミクスは新たなラクチル化部位を特定するゴールドスタンダード手法です。

このプロトコルは、MSベースのプロテオミクスによるKL-LAリッチペプチドの同定と、免疫沈殿によるラクチル化タンパク質の確認を記述しています。食道扁平上皮癌(ESCC)細胞株を例に、ラクチル化タンパク質を抽出してMSベースでラクチル化標的を特定し、その後のIPによる確認を行うプロトコルを記述します。

プロトコル

PTMは動的かつ一時的なプロセスであるため、フローサイトメトリーや抗KL-LA 抗体を用いたウェスタンブロッティングを用いて、総ラクチル化レベルが最適となる合流点を事前に確立することが重要です。例えば、ESCC細胞株ではラクチル化およびIP実験において70%〜80%のコンフルエンシーが望ましいです。なぜなら、ラクチル化の総レベルが最も高いためです。試薬および使用機器は材料 表に記載されています。

1. 細胞培養

  1. 前述の通り、100mmのペトリ皿で細胞を培養し、必要な合流に達するまで続けます。
    注意:ラクチルロームの場合は0.5〜1 mgのタンパク質、IPの場合は2 mg以上のタンパク質を獲得できるほどの細胞を培養してください。
  2. 細胞を5mLの事前に冷却した1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)でうがいします。
  3. 500μLの事前に冷却されたPBSを加え、細胞スクレーパーで細胞を採取します。1mLの低結合マイクロチューブに移します。
  4. 室温(RT)で2,000 x g の遠心分離機で5分間、透明な上清液を捨てます。細胞ペレットは-80°Cで保存可能です。

2. ラクチルローム

注意:サンプル汚染を防ぐために、必ず手袋を着用してください。必ずろ過済みの先端、低結合のマイクロチューブ、MSグレードの水を使用してください。
注:生物学的複製(当店では3〜5回)は、特定された修飾が再現可能であることを保証するために必ず実施すべきです。

  1. タンパク質抽出
    注意:氷の上で練習してください。
    1. 使用前にラクチルローム溶解バッファー(表1)を準備し、4°Cで保存してください。使用直前にプロテアーゼ阻害剤を加えます。
    2. 適切な量の溶解バッファーを使ってタンパク質を抽出します。
    3. 氷上で超音波処理を12サイクル、5秒のパルス+5秒の停止を20%〜25%の強度で行います。
    4. 16,000 x g で4°Cで10分間遠心分離機に入れます。タンパク質を含む透明な上澄液を新しい低結合マイクロチューブに移します。
    5. 製造元の推奨に従い、ビシンコニン酸(BCA)キットでタンパク質を定量してください。
      注:BCAキットは最大3M尿素に対応しています。したがって、サンプルはそれに応じて希釈する必要があります。
    6. 500μgから1mgのタンパク質を新しい低結合マイクロチューブに移します。各サンプルに同じ量のタンパク質を使用します。すべてのサンプルの体積をラクチルローム溶解バッファーで同じ最終体積に仕上げます。
  2. 還元、アルキル化、酵素的消化
    1. 最終濃度5 mMにジチオスレイトールを加えます。95°Cで2分間培養します。
    2. RTで30分間孵化します。
    3. クロロアセタミドを最終濃度7.5 mMに加えます。RTで暗闇の中で20分間培養します。
    4. ステップ2.1.6の試料体積の3倍の1 M(NH4)2CO3を加え、尿素を8 Mから2 Mに還元します。
      注意:総体積がマイクロチューブの容量を超える場合は、2つのマイクロチューブに分割してください。
    5. 100μgのタンパク質に対してMSグレードのトリプシン1μgを加えます。30°Cで一晩培養します。サンプルの精製を進めます。
  3. 精製とペプチド濃度
    注:RTで働いています。
    1. 試料を酸性化し、最終濃度0.2%にトリフルオロ酢酸(TFA)を加えます。
    2. MSグレードの水で新鮮な溶液を準備します:0.1%TFA、1%蟻酸(FA)、1%FA/50%アセトニトリル。
    3. 精製を進めるにはC18 100 mgカラムを使用してください。
      注意:このカラムを使用するには、2つのピペットチップを使用します。1つをカラムに充填し、もう1つのピペットの先端を切断して液体をカラムから排出します。カラムが常に湿っていることを確認してください。サンプルごとに1つのカラムを使用します。
    4. 100%アセトニトリル1mLの湿潤液を充填し、排出します。これを2回繰り返します。
    5. 0.1%TFAを1 mL充填してカラムを平衡し、排出します。これを2回繰り返します。
    6. 酸性化されたサンプル1mLをカラムに充填します。サンプルの電荷/排出を10サイクル繰り返します。サンプルが残っている場合はこれを繰り返します。
    7. カラムを0.1% TFA1mL充填して洗浄し、排出します。これを2回繰り返します。
    8. 洗脱のために、1%ファル/50%アセトニトリルの750μLを用いて10回のチャージ/エジェクトサイクルを進めます。新しい低結合マイクロチューブに採取します。さらに750μLの1%/50%アセトニトリルを追加して、合計1.5mLの精製ペプチドを繰り返します。
      注意:キャップの穴を開けてサンプルを汚染しないように、キャップ側ではなく側面のマイクロチューブを特定してください。
    9. 蒸発用の針でマイクロチューブのキャップに1〜3個の穴を開けます。
    10. 真空濃縮器を用いて、必要な時間60°Cで試料を濃縮します(最終体積1.5 mLの試料の場合、少なくとも4時間かかることがあります)。その後、ペプチドの免疫沈殿を行います。
  4. KL-LA ビーズを用いた免疫沈殿
    1. ウォッシュバッファーとラクチルロームIPバッファーを準備します(表2)。
    2. 氷の上に200μLのIPバッファーを濃縮ペプチドに加え、上下によく混ぜて溶解します。一部の沈殿物はまだ目に見えます。
    3. 12,000 x g で4°Cで10分間遠心分離機で降水物を除去します。
      注:遠心分離後、例えば分光光度計を用いて205 nmのペプチド濃度を定量し、制御段階として試料を投与することができます。
    4. 200μLの氷冷1x PBSで、2,000 x gで遠心分離し、4°Cで1分間遠心分離し、各洗浄後に透明な上清液を除去し、200μLの氷冷1x PBSで3回洗浄します。
      注:このプロトコル開始時のタンパク質1mgについては、使用しやすいように以前に0.5mLの低結合チューブに分割したKL-LA アガロース共役ビーズ20μLを使用してください。
    5. 再懸濁ペプチドを含む透明な上清液を、洗浄済みビーズを含む0.5mLマイクロチューブに移します。漏れを防ぐためにチューブをパラフィンフィルムで密封します。
    6. 4°Cで一晩、ゆるく端から端まで回転させて孵化させます。
      注:ステップ2.4.7から2.4.12はすべて4°Cで実施されます。
    7. ビーズを2,000 x g の遠心分離で1分間ペレットします。透明な上清液は捨てます。
    8. 200μLのラクチルロームIPバッファーを加え、チューブを逆さまにして15秒洗浄します。遠心分離機で2,000 x g で30秒間処理し、透明な上澄液を廃棄します。
    9. ステップ2.4.8を一度繰り返します。
    10. 洗浄バッファー200μLを加え、チューブを逆さまにして15秒洗浄します。2,000 x g で遠心分離機で30秒間処理し、透明な上清液を捨てます。
    11. ステップ2.4.10を2回繰り返します。
    12. MSグレードの水200μLを加え、チューブを逆さまにして30秒洗浄します。遠心分離機で2,000 x g で1分間処理し、透明な上清液を捨てます。
      注:ラクチルロームプロトコルの残りのステップはRTで実施されます。
    13. 結合したペプチドを100μLの洗脱バッファー(0.1%TFAを新たに調製)で1分間、RTで優しく端から端まで回転させて洗脱します。遠心分離機で2,000 x g で2分間加熱します。
    14. ステップ2.4.13をさらに2回繰り返し、溶出液を組み合わせます。サンプルの精製を進めます。
  5. KL-LA ペプチドの濃縮と精製
    1. MSグレードの淡水で以下の溶液を調製します:0.1% TFA、1% FA、1% FA/50% アセトニトリル。
      注意:精製開始直前に、適切な量の溶液を1.5mLマイクロチューブに準備してください(ステップ2.5.3:100%アセトニトリル300μL、ステップ2.5.4:0.1%TFA300μL、ステップ2.5.6:0.1%TFA300μL、ステップ2.5.7:1%ファセトニトリル300μL/50%)。
    2. 精製を進めるには100μLのC18チップを使ってください。
      注意:100 μL C18チップは従来のピペットチップと同じ方法で使用されます。親指を握ったまま、工程間にはプランジャーを離さず、カラムを湿らせて空気の侵入を防ぎましょう。
    3. 100μLの100%アセトニトリル(湿潤溶液)を吸引し、液体をすべて排出しないように慎重に抽出します。これを2回繰り返します。
    4. 0.1%TFAを100μL吸引してカラムを平衡にし、慎重に抽出します。これを2回繰り返します。
    5. カラムにKL-LA ペプチドのサンプル100μLを充填します。新しい低結合マイクロチューブで10回のチャージ/エジェクトサイクルを進めます。サンプルが残っている場合は繰り返します。
    6. 0.1%TFAを100μL吸引してカラムを洗浄し、それを抽出します。これを2回繰り返します。
    7. 新しい低結合マイクロチューブで100μLの1%ファル/50%アセトニトリルを用いて、10回のチャージ/エジェクトサイクルを行って洗脱します。これを2回繰り返し、ユーオートを組み合わせます。
      注意:C18チップに結合するペプチドは、100μLの吸引を妨げる可能性があります。このステップをステップ2.5.7でマイクロチューブ内の液体(300μL)がなくなるまで繰り返します。
    8. 蒸発用の針でマイクロチューブのキャップに1〜3個の穴を開けます。
      注意:チューブの側面にあるマイクロチューブは、穴を開ける際にサンプルを汚染しないように注意してください。
    9. 真空濃縮機を用いて、液体が蒸発するまで必要な期間(合計300μLの場合、少なくとも2時間かかる)60°Cで試料を濃縮します。
    10. 濃縮ペプチドを1%ファルタリの30μLに再懸濁します。
    11. 質量分析プラットフォームのガイドラインに従い、205nmの分光光度計でペプチドを定量し、その濃度を測定してください。
    12. ガラスバイアルに移し、MS分析まで4°Cの温度で保ちます。

3. MS解析とバイオインフォマティクス

注:サンプルはシェルブルック大学プロテオミクスコア施設で質量分析計(MS)(データ依存取得方式および並列蓄積・シリアル断片化(DDA-PASEF)モードで運用)を用いて分析されました。

  1. 質量分析
    1. 各サンプルごとに、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)システムに375 ngのペプチドを注入します。
    2. ペプチドを4 μL/minの一定流量でトラップカラムに積み込みます。
    3. 分析用C18カラム上で、0.1%ファルタリル中5%〜37%アセトニトリルの2時間勾配、流量400 nL/minでペプチドを分離します。
    4. 以下の設定で電気噴霧イオン化を行います:毛細血管電圧:1500 V、乾燥ガス:3.0 L/min、乾燥温度:180 °C、TIMS圧:2.6 mBar。
    5. DDAのオートMS/MSモードで100〜1700 m/zの範囲の質量スペクトルを取得します。
      注:装置は0から5+までの電荷状態を検出するよう設定されています。デュアルトラップドイオン移動度分光法(TIMS)構成が使用され、ランプ時間は100ms、取得サイクルごとに10回の並列蓄積-シリアル断片化(PASEF)スキャンを行い、デューティサイクルは1.17秒となります。動的排除は0.4分に設定されています。
    6. 衝突誘発解離(CID)エネルギーを線形に増加させ、イオン移動度0.6〜1.6 V/cm²の範囲で行う。
      注:ターゲット強度は20,000に設定し、強度閾値は2,500です。標準フィルターポリゴンを適用し、m/zイオン移動面内の+2、+3、+4の荷電ペプチドに対して斜めスキャン線沿いの前駆体を優先します。
  2. データ前処理:MaxQuant解析
    注:次のステップはMaxQuant v.2.6.713 ソフトウェアを用いてラクチル化ペプチドの同定を行います。
    1. 右上のセクションで「 設定 」タブをクリックし、ラクチル化が修正として追加されているか確認してください。
    2. もしなければ、Unimod.org データベース14を使用します。ゲストとしてログインし、lactylation(accession #2114)を検索してください。
    3. 追加ボタンをクリックしてください。名前にLactylation (K)と書き、Unimodで書いた通りに変更ボタンをクリックして作曲を入力してください。
    4. 取得した単一同位体質量を確認してください。 OKをクリックしてください。
    5. 画面左上の青色で「 変更を保存 」ボタンをクリックしてください。
    6. 左上のセクションで 「生データ 」をクリックします。生データファイルを読み込み、「 No fractions 」ボタンで自動的に名前を付けます。
    7. 左下にスレッド数を、コンピュータ上でアクセス可能なコア数に基づいて設定します。
    8. グループ専用タブで、青色の「Modifications」をクリックします。
    9. 右のマスに矢印ボタンをクリックして、変数修正に乳酸化を加えます。
    10. ラベルフリー量化をクリックします。LFQを入力し、正規化タイプを「なし」に変更します。
    11. 「消化」をクリックします 。 右の正方形にトリプシン/Pが加わっていることを確認してください。
    12. 最大4のカットラインを4に増やしてください。ラクチル化がトリプシンの消化に影響を与える可能性があります。
    13. 「Instrument」をクリックします。ラクチル化が一般的なPTMではないことを考慮し、 メイン検索ペプチド耐性 を 20に変更してください。
    14. 左上のセクションで「 グローバルパラメータ」をクリックしてください。 対応する種のために、以前UniprotまたはEnsemblからダウンロードしたFastaファイルを追加します。
    15. 識別 子ルール をクリックして テスト して、Fastaファイルが正しく読み取れるか確認してください。
    16. 青色の 「タンパク質定量」 をクリックします。右側のマスにラクチル化を加えてください。
    17. 青色の 識別 をクリックします。 FDR を 0.05に変更してください。 Second Peptides と Match between runsを必ずチェックしてください。
    18. 青色のラベル フリークオンティフィケー ションをクリックします。iBAQとTop3のボックスにチェックを入れてください。
    19. 右上のセクションで「 パフォーマンス」をクリックしてください。
    20. 下部のセクションで青色の 「スタート 」をクリックしてください。
  3. ラクチル化タンパク質の同定
    注意:MaxQuantの実行終了時に、以下のような複数の出力ファイルが取得されます。
    • ラクチル化(K)部位:主要な関心ファイル - ラクチル化リジン残基のサイト特異的情報を正確なペプチド配列(タンパク質の同定、ラクチル化の配列位置、濃度、信頼レベル)を含みます。
    • 乳酸化パラメータ:MaxQuant解析で使用される設定および閾値に関するすべての情報を含みます。
    • ラクチル化ペプチド:修飾済みおよび未修飾ペプチドの同定。
    ・乳酸化タンパク質基:タンパク質基と検出されたラクチル化との関連を特定しました。
    これらのファイルの利用は研究課題によって異なります。次のステップでは、ラクチル化部位の特定方法を説明します。
    1. Excelで Lactylation (K)Sites ファイルを開きます。
    2. 下部の「 乳化(K)サイト 」タブを複製して元のデータを保持してください。
    3. 逆および潜在汚染物の列をAからZへ並べ替えてください。値がある行があれば、その行を削除してください。
    4. この新しいタブでは、(1) タンパク質:UniProt14 主要登録番号、(2) タンパク質内の位置:後述で確認するラクチル化の予測位置、(3) タンパク質名、(4) 遺伝子名、(5) 乳酸化数(対応するペプチド上で検出されるK)、(6) 乳酸化(K)確率(ラクチル化位置の確率1)、(7) 強度(対応するペプチドに属するすべての強度の合計)
    5. タンパク質名や遺伝子名などの欠落した値を補完します。
    6. 「タンパク質」欄の最初の登録番号のみを保持してください。得られた表は検出されたすべてのラクチル化ペプチドと、そのペプチドが検出される可能性が高いタンパク質を示しています。
      注:ラクチル化は豊富なPTMではないため、100から500ペプチドがラクチル化されていると推定されます。検出されるペプチドは複製ごとに異なるため、少なくとも2つの生物学的複製で検出される閾値を設定することが可能です。
    7. 修飾残基の位置を確認するには、NIH15 のBLASTやUniProt16 のAlignなどのアラインメントウェブツールを使用し、ペプチド配列を「Lactylation (K) Probabilities」(任意の確率を消去)欄に、UniProtデータベース17のタンパク質配列を配置します。
      注:単一のタンパク質配列内で複数のラクチル化部位を同定できるため、これらの部位を同時にアラインメントすることが可能です。これにより、異なるペプチド上にあるが同じ位置にある重複部位の特定にも役立ちます。
    8. データ解析は研究課題によって異なりますが、統計データ解析を行う前に正規化、センタリング、スケーリング、ログ変換のステップを考慮する必要があります。
    9. MS解析で特定されたラクチル化タンパク質を確認するために、免疫沈殿プロトコルを進めてください。

4. 免疫沈殿(IP)

  1. タンパク質抽出
    注意:氷の上で練習してください。
    1. 使用前にIP溶解/洗浄バッファー(表3)を準備し、4°Cで保存してください。使用直前にプロテアーゼ阻害剤を加えます。
      注意:サンプル調製には、-80°Cで保存された細胞ペレットを使用できます。新鮮な細胞を扱う場合は、4.1.2および4.1.3の手順に従います。それ以外の場合は、4.1.2ステップで述べたのと同じ量のIP溶解/洗浄バッファーに細胞ペレットを再懸浮させ、4.1.4を進めます。
    2. 1mLのIP溶解/洗浄バッファーを加え、細胞を4°Cで10分間培養します。
    3. 細胞スクレーパーを使って細胞を採取し、溶解液を1.5mLのマイクロチューブに移します。
    4. 4°Cで30分間、優しく端から端まで回転させて培養します。
    5. 遠心分離機は16,000 x g で4°Cで10分間加熱します。
    6. 透明な上清液を新しい1.5 mLマイクロチューブに移します。
    7. メーカーのプロトコルに従ってBCAキットでタンパク質を定量化してください。
  2. ビーズの事前クリアリングとKL-LA 抗体培養
    注意:氷の上で作業してください。各実験条件に対して、対照のIPチューブ(KL-LA 抗体と同じ種のIgG)とKL-LA IP用のチューブを準備します。
    1. 1mgのタンパク質を新しい1.5mLマイクロチューブに移します。すべてのサンプルをIP溶解/洗浄バッファーで最終体積を同じに仕上げます。
      注意:このプロトコルは磁気ビーズまたはアガロースビーズを使用して実施可能です。以下のステップでは磁気ビーズを使用しました。
    2. 必要なビーズの容量を新しい1.5 mLマイクロチューブに移します。
    3. ビーズを予洗いするには、30秒間または溶液が透明になるまで磁化します。透明な上清液を捨てます。500μLのIP溶解/洗浄バッファーでビーズを3回洗浄します。洗浄後は透明な上清液を捨てます。最初に採取したビーズの体積と同じ量のIPバッファーを加えます。
    4. タンパク質サンプルを10〜15μLのあらかじめ洗浄されたビーズと共に、4°Cで20分間優しく回転させて培養します。
      注:タンパク質1mgには磁気ビーズ10〜15μLを使用します。このステップにより、免疫沈殿プロトコル中に非特異的タンパク質がビーズに結合するのを最小限に抑えます。
    5. ビーズを30秒または溶液が透明になるまで磁化します。透明な上澄液を新しい1.5 mLマイクロチューブに移します。
    6. 1本のチューブに1.5 μLの抗KL-LA抗体、もう1本のチューブに対応する量のIgGを加えます。
      注意:このプロトコルの開始時にタンパク質1mgを摂取した場合、抗体1.5μgを使用します。
    7. サンプルを4°Cで一晩、穏やかに端から端まで回転させて培養します。
  3. KL-LA 免疫沈殿
    注意:氷の上で練習してください。
    1. 使用前にIP溶解/洗浄バッファー(表3)を準備し、4°Cで保存してください。使用直前にプロテアーゼ阻害剤を加えます。
    2. ビーズはステップ4.2.3で説明されている通りに予洗いします。
      注意:このプロトコルの冒頭でタンパク質1mgを摂取した場合、磁気ビーズ40μLを使用してください。
    3. サンプルを40μLのあらかじめ洗浄された磁気ビーズで、4°Cで4時間、左右に優しく回転させて培養します。
    4. ビーズを30秒間または溶液が透明になるまで磁化します。最初の透明な上澄液を集めます。500μLのIP溶解/洗浄バッファーでビーズを3回洗います。洗浄後は透明な上澄液を取り除きます。
      注:最初の上清液は定量化され、ウェスタンブロッティング(WB)で使用可能です。免疫沈殿の有効性を評価するのに有用です。
    5. ビーズを20μLの2xラエムリと5%のβメルカプトエタノールバッファーで再懸濁させます。
    6. SDS-PAGEゲルにロードする前に、95°Cで5分間インキュベートします。または、変性サンプルは-20°Cで数週間保存することも可能です。
  4. WB検出
    1. IPチューブを磁気スタンドに30秒置き、その後サンプルを採取しSDS-PAGEゲルに装填します。
    2. 対象タンパク質に対する抗体および/または抗KL-La 抗体を用いてWBを行い、5%牛血清アルブミン(BSA)中のラクチル化タンパク質のプルダウンを確認します。二次抗体は5%BSAで1:5000で希釈されました。
    3. HRPベースの化学発光検出でバンドを検出します。

結果

例として、食道扁平上皮がんのTE11細胞株は80%のコンフルエンスに達するまで培養されました。 図1 に示されたワークフローおよびこのプロトコルで説明されたMaxQuant解析に従い、ラクチルロームが決定されました。これらの細胞では、137個のペプチドがラクチル化の可能性があると特定され、82のユニークなタンパク質を表しました。これは同一タンパク質上の複数の部位が同定されたためです(図2A)。これは固有のペプチドを考慮していないことに注意してください。食道扁平上皮がん細胞株の実験では、100から500の同定ペプチドが予想されます。

同定されたラクチル化タンパク質は、クロマチンの再構築やクロマチン組み立てなど、すでに文献でラクチル化タンパク質に富集していると記述されていたいくつかの生物学的プロセスに関連しています(図2B)。最初に同定されたラクチル化タンパク質の一部はヒストンであり、このデータにもヒストンH1.2(表4)が見られます。ラクチル化は同一タンパク質の複数の異なるリジン残基で同定可能です。例えば、ヒストンH1.2上にはリジン(K)168(おそらく)と191の2つのラクチル化部位が同定されました。最初のペプチド(表4、行2)では、K168残基がラクチル化される確率が高く、1に0.733の確率を持つのに対し、K169はわずか0.267の確率であることが観察されました。HNRNPA1は、適切な修飾残基を特定するためにアラインメントが必要なペプチドの良い例です。

ラクチルローム結果に基づくHNRNPA1のラクチル化を検証するため(表4)、この翻訳後修飾を標的としたIPアッセイを実施しました。まず、どのビーズタイプが抗KL-LA抗体と最適な相互作用を示すかを判定するため、GビーズとA/Gビーズを比較しました。KL-LA抗体を用いたIP処理とKL-LAに対するWBを行った後、K-L-LAタンパク質の目に見える濃縮が両ビーズタイプで予想された入力値と比較して観察されました(図3)。これらの結果は、ラクチル化タンパク質の濃縮におけるプロトコルの効率性と堅牢性を示しています。両ビーズタイプ間で顕著な差は観察されませんでした。MSで特定された標的を検証するために、特定のIPを確認できます。例えば、MSによって同定されたHNRNPA1の乳酸化(表4)は較正されました。KL-LA IPとHNRNPA1 WBの後にHNRNPA1に対応する特定のバンドが検出され、HNRNPA1がラクチル化によって修飾されていることを示しています(図4)。GビーズとA/Gビーズは標的タンパク質の免疫沈殿に成功しましたが、A/Gビーズではより強いシグナルHNRNPA1が観察され、親和性や回復の強化が示唆されています。

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図1:ラクチルオーム分析のワークフローの概要。 略称:IP = 免疫沈殿;KL-LA = L-ラクチルリシン;LC-MS/MS = 液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析法。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

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図2:TE11細胞のラクチルロームに対して得られた一部のタンパク質の代表的な結果。 (A) 同定されたタンパク質およびペプチドの総数。同一タンパク質上で複数のラクチル化部位を同定できます。(B) STRINGデータベースを用いて取得したTE11細胞におけるラクチル化タンパク質の上位5つの生物学的プロセス。P値はBenjamini-Hochbergを用いた複数回の検査で補正されました。各バーの数字は、このGene Ontology(GO)のタンパク質総数のうち、ネットワーク内でラクチル化されたタンパク質の数を表しています。 この図の拡大版を見るには、こちらをクリックしてください。

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図3:G または A/G ビーズを用いた KL-LA の免疫沈殿および TE11 細胞における Pan-KL-LA のWB検出。 Pan-KL-LA の検出は、この PTM の免疫沈殿の有効性と特異性を確認するための重要な対照群となります。この実験は、IP が KL-LA 修飾を保有するタンパク質を効果的に濃縮することを保証します。(*) は、IP: IgG lanes(対照 IP)(N = 3)で明確に観察される抗体の重鎖および軽鎖を示します。 この図の拡大版はこちらをクリックしてください。

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図4:G または A/G ビーズを用いた K L-LA(ケイト・L-L-LA )の免疫沈殿と、WB によるHNRNPA1検出。 G または A/G ビーズを用いた KL-LA 特異的免疫沈降におけるWBのHNRNPA1検出により、TE11細胞内でのラクチル化(N=3)が確認されます。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。

解決策最終集中
尿素8 M
炭酸水素アンモニウム1 M
ヘペス20 mM

表1:ラクチルローム溶解バッファー。 MSグレードの水で調製し、pHを8に調整。

溶液 - ラクチルオールム洗浄バッファー最終集中
NaCl100 mM
EDTA1 mM
トリスHCl20 mM
ラクチルロームIPバッファを追加最終集中
NP-400.5%

表2:ラクチルローム洗浄バッファーおよびIPバッファー。 MSグレードの水で調製し、両方の溶液でpHを8に調整。

解決策最終集中
塩化ナトリウム100 mM
フッ化ナトリウム50 mM
トリスHCl(pH 7.5)50 mM
β-グリセロリン酸40 mM
EDTA(pH 8)5 mM
グリセロール5%
トライトン X-1001%
新鮮な追加:
プロテアーゼ阻害カクテル100X1X
PMSF1 mM
オルトバナ酸塩0.2 mM

表3:IP溶解/洗浄バッファー。 変性剤はタンパク質上のPTMの存在を不安定化させる可能性があるため、変性剤が含まれていなければなりません。

タンパク質内の位置タンパク質タンパク質の名称遺伝子名乳化数(K)乳酸化(K)確率強度
168P16403ヒストンH1.2HIST1H1C1KPAAATVTK(0.733)K(0.267)1.98E+04
191P16403ヒストンH1.2HIST1H1C1SAAK(1)AVKPK6.91E+04
51A8K2U0アルファ2-マクログロブリン様タンパク質1A2ML11VCLDLSPGYSDVK(1)3.18E+04
5; 5; 5C9JMM0クロモボックスタンパク質ホモログ3CBX31ASNK(1)TTLQK1.21E+05
10; 10; 10C9JMM0クロモボックスタンパク質ホモログ3CBX31TTLQK(0.828)MGK(0.172)2.49E+05
112; 141O76095-2プロテインJTBJTB2K(0.858) ALEK(0.18)VRK(0.962)1.47E+04
350; 298; 298; 297; 285; 245;
253; 169; 48; 100; 95; 93; 79;
23; 93; 92; 79; 28; 74; 50; 73;
51; 57; 56; 48; 61; 66; 66; 73		P09651異質核リボ核核タンパク質A1HNRNPA11SSGPYGGGGQYFAK(1)PR6.13E+04

表4:TE11食道扁平上皮がん細胞株のラクチル化ペプチドの代表的な結果。 この表はMaxQuant解析後に得られたものです。

ディスカッション

このプロトコルは、KL-LA修飾タンパク質の免疫沈殿をMSで用いて新しいラクチル化タンパク質とそのラクチル化部位を発見する方法を説明しています。このラクチルロームプロトコルは共役ビーズを用いて行われますが、研究課題に応じてKL-LA 抗体やKD-LA 抗体でも実現可能です。共役ビーズの代わりに抗体を使用する場合、ポリクローナル抗体を選ぶことで複数のエピトープに結合できるため、より緊密な複合体の形成が促進されます。しかし、この方法は変動が生じる可能性があります。共役ビーズを使用する利点の一つは、抗体が固体支持体から放出される浸出を防ぎ、MSサンプルを汚染する可能性があることです。また、未接合抗体よりも時間効率が良いです。

さらに、この種の分析で同定されたペプチドの量は複数の要因によって影響を受ける可能性があることに注意が必要です。まず、抗体特異性は正しいタンパク質が捕捉される上で重要な役割を果たします。アガロースビーズによる事前クリアリングのステップを加えることで、非特異的な相互作用を除去する方法が考えられます。一方で、ラクチル化がトリプシン消化に影響を与えるかは不明です。なぜなら、ラクチル化はアルギニン残基のC末端側のペプチドを切断するためであり、最も重要なリジン残基を切断するためです。この場合、ペプチドの被覆率が低下する可能性があります。したがって、プロテアーゼの他の選択肢を検討することが可能です。このプロトコルでは、この制限を考慮して「最大切り裂き見逃し」パラメータが増加します。最後に、サンプルの準備や取り扱い、例えば皮膚からのケラチンによるサンプル汚染を防ぐための手袋の使用や、PTMターンオーバーが動的かつ時に高速なプロセスであるための変質安定性も考慮すべきです。

低存在量PTMの検出率が低い広範なMSアプローチとは異なり、MSベースのプロテオミクスによる濃縮K-L-LAペプチドの同定により、新たに特徴付けられたラクチル化部位やラクチル化タンパク質の特定など、詳細なPTM部位解析が可能です。ウェスタンブロットは細胞内のラクチル化の一般的なパターンに関する情報を提供しますが、タンパク質特異的ラクチル化については情報が出ません。したがって、IPはMSで検出されたPTM20を確認するために一般的に用いられる手法です。近接結合アッセイ(PLA)も、プロテオミクスによって特定された潜在的な標的のラクチル化を確認するために用いられる技術です。この技術は修飾タンパク質の局在も示すことができますが、特異性は低いです。ラクチル化特異的IPアプローチは広範なPTMスクリーニングに適していますが、研究課題によってはタンパク質特異的IPを行うことも興味深い場合があります。

全タンパク質抽出物中の特定のラクチル化タンパク質の割合を定量化する際、単なるIP単独では不十分です。KL-LA ビーズを用いたIPはラクチル化タンパク質の捕捉を可能にしますが、標的タンパク質の濃縮に限定されるため、ラクチル化の割合を正確に定量することはできません。したがって、質量分析が必要であり、より詳細な分析を提供し、ラクチル化を正確に定量的に測定できます。したがって、潜在的にラクチル化されたタンパク質に対して抗体を用いてIPを行い、その後質量分析分析を行うことで、全タンパク質サンプル中のラクチル化タンパク質の割合を測定できます。一方、IPはMSでラクチル化と特定されたタンパク質のラクチル化を確認する効率的な方法となります。

非結合抗体を用いたIPでは、ラクチル化タンパク質の最適な捕獲のためにビーズと抗体の比率を最適化することが不可欠です。実際、これら二つの成分のバランスはIPの特異性と効率に直接影響します。抗体が過剰に存在すると非特異的結合が生じ、背景ノイズが増加し、検出の全体的な精度が低下します。逆に、標的タンパク質の濃縮が非効率的になり、信号が弱まり感度が低下することがあります。これらの技術的配慮は、ラクチル化タンパク質の研究において信頼性が高く正確な結果を得るために極めて重要です。

結論として、このプロトコルは恒常性の緩和後のラクチル化プロファイルの変化(例えばがん8,10)を用い、薬物関連反応に影響を与える可能性があります。この方法を用いてバイオマーカーの同定も可能となります。複数の細胞株、組織タイプ、さらには患者の生検にも適用可能であり、この技術は疾患や正常な状態におけるPTM駆動細胞シグナル伝達の理解を深める可能性を秘めています。

開示事項

開示すべき利益相反はありません。

謝辞

ジルー研究室の全メンバーの科学的議論に心より感謝申し上げます。また、シェルブルック大学医学・健康科学部のプロテオミクスおよび質量分析プラットフォームのサービスと指導に感謝しています。VGはカナダ自然科学工学研究評議会(RJPIN-2019-06185)およびカナダ保健研究所(178171)の支援を受けています。VGは消化器幹細胞生物学のカナダ研究チェアTier 2を務めています。MHはシェルブルック大学炎症腫瘍消化センター、シェルブルック大学フェンダシオン・デ・セーヴ、CRCHUS、消化器学・リヴィエール新世代研究者TRaIning(TRIANGLE)プログラム、FRQからの奨学金を受けています。FMBはFRQSメリットリサーチスカラー(366044年)です。VGとFMBはFRQS資金提供の「Centre de Recherche du CHUS」のメンバーです。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
100 uL ジップチップ C18 ピアース87784
アクレイム PepMap100 C18ダイオネックス・コーポレーション1649460.3mm内径×5mm
アセトニトリル(MSグレード)フィッシャーA955-4
炭酸水素アンモニウムシグマ・オルドリッチA6141-500
抗HNRNPA1モノクローナル抗体Novus Biologicals NB100-672
抗L-ラクチルリシン(KL-La)モノクローナル抗体PTM-バイオPTM1401RM
抗マウスIgG、HRP結合抗体CST7076S型
抗ウサギIgG、HRP連鎖抗体CST7074S
Azure 280バイオシステムAZI280-01
BCAキットサーモフィッシャー・サイエンティフィックP123227
ボビン血清アルブミン(BSA)ウィーツン800-095-EG
キャプティブスプレー nanoESIソースブルーカー・ダルトニックス
クロロアセタミドシグマ・オルドリッチC0267
クラリティマックス ウェスタンECL基板バイオ・ラッド1705062
ジチオスレイトール(DTT)サーモフィッシャー・サイエンティフィックR0861
Dynabeads 免疫沈殿用プロテインGビーズサーモフィッシャー・サイエンティフィック10004D
EDTAシグマ・オルドリッチE9884
蟻酸(FA;MS成績)サーモフィッシャー・サイエンティフィックA117-50
グリセロールフィッシャー・サイエンティフィックBP229-1
HEPES(1歳男性)ウィーツン330-050-EL
ハイパーセプC18 100mgカラムフィッシャー60108-302
KL-LAアガロース共役ビーズPTM-バイオPTM-1404
Laemmli 2X(SDS、ブロモフェノール)ワイセント、J.T.ベイカー800-100-CG、D293-01
低結合マイクロチューブ 0.5 mLサーステット72.704.600
低結合マイクロチューブ 1.5 mLサーモフィッシャー・サイエンティフィックP190410
マイクロチューブ 1.7 mLアクシゲンMCT-175-C
NanoElute HPLCシステムブルーカー・ダルトニックス1.9μmの粒径、75μm内径×25cm
正常なウサギのIgG多クローナル抗体ミリポール・シグマ12-370
ペップセップブルーカー・ダルトニックス1811112
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)ウィーツン311-425-CL
PMSFサーモフィッシャー・サイエンティフィック36978
プロテアーゼ阻害剤カクテル(写真)シグマ・オルドリッチP8340-5
セラマグスピードビーズ プロテインA/G磁気粒子サーモフィッシャー・サイエンティフィック09-981-920
塩化ナトリウムシグマ・オルドリッチS9888-500
フッ化ナトリウムシグマ・オルドリッチS1504
オルトバナデートナトリウムシグマ・オルドリッチS6508
TimsTOFプロ質量分析計 ブルーカー・ダルトニックス
トリフルオロアセチン酸(TFA)サーモフィッシャー・サイエンティフィックA116-50
トリスHClウィーツン600-125-IK
トライトン X-100シグマ・オルドリッチX100
トリプシン(MSグレード)ピアース90058
尿素サーモフィッシャー・サイエンティフィックU15-500
バキューフュージプラスエッペンドルフ22820168
水(MSグレード)VWR10803-890A
β;-グリセロリン酸シグマ・オルドリッチG5422
&β;-メルカプトエタノールシグマ・オルドリッチM3148

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