光イメージングによる非侵襲的検出のための蛍光色素で標識幹細胞

蛍光色素との間葉系幹細胞のラベリングは、DID

1. 間葉系幹細胞を標識するための手順を開始するには、トリプシン処理および細胞の定義の数と、懸濁液を得るために細胞を数える。
2. インキュベーターから細胞を取り出し、ラベルを付ける細胞を含むフラスコから古い培地を吸引除去
3. のMg / Caのフリー10mlのPBSで細胞を洗浄する。 PBSを吸引除去する。 MgおよびCaは、トリプシンを阻害する、従って私達はこれらなしでPBSを使用してください。
4. 我々は5mlを使用するT75フラスコのために、予め温めておいた0.05％トリプシンを追加。フラスコの表面全体が覆われていることを確認してください。
5. 約5分間37インキュベーターで℃でインキュベートする。
6. 顕微鏡下で剥離を確認してください。細胞がまだフラスコに付着した場合、それを数回タップし、トリプシン処理が成功するまで少し長く待つ。
7. 今、それは10％FCSを含有する培地を加えることによってトリプシンを中和する必要があります。トリプシンがあるので、我々はメディアの同じ量を使用してください。
8. すべての細胞は培地に再懸濁していることを確認するために数回上下にピペッティングし。
9. 滅菌15ミリリットルキャップポリプロピレンチューブに細胞溶液を移す。
10. 5分間、400 rcfで遠心する。
11. 細胞ペレットを崩さないように確実に上清を吸引除去する。
12. DMEMで細胞を再懸濁し、細胞数に進みます。
13. 無血清培地（DMEM）のmlあたり^ 6 × 10の密度で標識される細胞をサスペンド。
14. これは、細胞懸濁液のすべての準備だった。今、それはラベルを開始する準備ができています。
15. 最初に、細胞懸濁液のmlあたり、DID造影剤を5μLを加える。
16. その後、軽くピペッティングすることによってソリューションを混在させること。
17. 37標識溶液℃で6 - ウェル低アタッチメント皿で20分間で細胞をインキュベートする。
18. シンプルなインキュベーションが完了したら、それは15ミリリットルキャップポリプロピレンチューブに細胞溶液を転送する必要があります。
19. 5分間、400 rcfで、それを遠心してください。
20. 細胞ペレットを乱さないように確実に、標識メディウムを吸引除去する。
21. PBSで細胞を洗浄。細胞ペレットを分割することを確認し、上下のセルをピペッティング。
22. 後者の二つのステップをさらに2回繰り返し、3の洗浄工程の合計があるので。
23. 細胞をカウントし、細胞の生存を決定するためにトリパンブルーテストを実行します。これらは、我々がここで説明するつもりはないされている標準的な細胞培養のプロトコルです。
24. あなたの細胞は、光イメージャで撮像される準備が整いました。

蛍光色素ICGとヒト胚性幹細胞の標識

1. ヒト胚性幹細胞を標識するための手順を開始するには、インドシアニングリーン造影剤を​​準備する。トランスフェクション剤のプロタミンと混ぜる。
2. インドシアニングリーン粉1mgのを測定します。ジメチルスルホキシド（DMSO）を100μLでICGの粉末を溶かし。
3. 混合するダルベッコ改変イーグル培地（DMEM + 10％ウシ胎児血清）メディア400μLを加え、よくそれを振る。インドシアニングリーンの2mg/mlの最終濃度でこれが結果。
4. トランスフェクションエージェントのプロタミンを追加。造影剤のためのシャトルとしてプロタミン行為、それはより効率的に細胞内に取得できるように。
5. 300μLICGと300μLの無血清ダルベッコ改変イーグル培地で、10mg/mlの濃度で供給される5μL硫酸プロタミンを、混ぜる。
6. ゆっくりとフォームへの複雑なように5分のための新しいトランスフェクション溶液を振る。
7. 標識溶液が準備ができています。
8. hESCの10ミリメートルのシャーレから、古いメディアを吸引除去する。
9. 予め温めておいた血清を含まないDMEM 5mlを追加します。
10. 細胞に予め用意されたICG /プロタミン溶液を加える。 37℃インキュベーターに皿を置くことによって1時間のインキュベーションを開始℃に
11. インキュベーションが完了したら、インキュベーターから皿を削除し、標識溶液を吸引除去する。
12. 5mlのPBSで皿を洗浄して細胞を洗浄する。
13. PBSを吸引除去し、0.25％トリプシン5mlのと交換してください。 ℃で5分間トリプシン処理を発生させるための37皿をインキュベートする。それは、たまに料理を少し振るのに役立ちます。
14. 静かに残りのコロニーを分割するために、上下にピペッティングし。
15. 皿にKSRの同量を追加してトリプシンを中和する。
16. 15ミリリットルチューブに細胞溶液を移し、5分間で400 rcfで解決策を遠心する。
17. 完全なメディアで細胞を再懸濁します。
18. この時点でも塊がある場合は、トリプシン処理し、再度遠心する。
19. 塊のない細胞溶液が達成されると、古いメディアを吸引除去し、予め温めておいたフルESCメディア10mlのでペレットを再懸濁します。
20. この時点で、それはヒトES細胞からマウスのフィーダー細胞を分離する必要がある。これはことを保証するために行われ、後に、唯一のイメージング幹細胞が発生します。
21. このためには、目を移すゼラチンコートした10cmディッシュへの電子の細胞溶液。
22. 37℃のインキュベーターに料理を入れて、それが45分放置します。この時間の間に、料理を邪魔しないように注意してください。今、フィーダーは皿に付着し、幹細胞はしません。
23. ペトリ皿の中から解決策を転送する。そして今、私たちはヒト胚性幹細胞の標識した単一細胞のソリューションを持っている。
24. 細胞は、今カウントすることができますし、トリパンブルー試験は、それらを実行することができます。
25. 細胞は、イメージを作成する準備が整いました！

OI is a relatively new imaging technique, based on the detection of fluorescence. OI is as sensitive as radiotracer-based imaging techniques, but not associated with any irradiation exposure. OI provides an effective means of tracking cells non-invasively and repetitively, thereby providing insight into cell migration to the target site. One major limitation of the technique is the limited tissue penetration of fluorescent probes in vivo. Thus, a tracer accumulation in deep tissues, more than about 5-10 cm from the skin surface, may not be detected. Current clinical applications are limited to superficial techniques such as endoscopic, cardiovascular and retinae imaging (Funovics et al. 2003) but this domain of research will continue to expand through the recognition of the vast possibilities offered by in vivo cell tracking.