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方法論記事

マウスにおける脊髄神経調節のための超音波トランスデューサの固定

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DOI:

10.3791/68605

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2025年8月1日

 ,  ,  , 
1Jinan University, 2Department of Neuromedical Center, The University of Hong Kong-Shenzhen Hospital, 3Shenzhen Institute of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences

この記事について

サマリー

このプロトコルは、覚醒マウスにおける脊髄の超音波刺激のために特別に設計された超音波トランスデューサー固定システムを説明する。この方法では、固定システムを採用して超音波トランスデューサーの正確な位置決めを確保すると同時に、刺激の精度を損なうことなく実験被験者が自由に動くことができるようにします。

要約

集束超音波 (FUS) は、脊髄神経調節の大きな可能性を示す革新的な非侵襲的神経調節技術として登場しました。ただし、脊柱に沿ってトランスデューサーを安定して固定するには、顕著な技術的課題があります。既存の固定化方法では、多くの場合、長時間の動物麻酔が必要になったり、接着の信頼性が不十分でした。これらの重大な制約は、動作安定性と生理学的適合性の両方を保証する新しい固定パラダイムを開発する緊急の必要性を強調しています。このプロトコルは、覚醒して自由に動くマウスの脊髄を刺激するための革新的な超音波トランスデューサー固定システムを導入します。脊柱に超音波トランスデューサーを正確に配置するための信頼性の高い方法を確立することは、神経刺激実験の鍵となります。この方法は、T13椎体の外科的露出、棘突起の精密研削による平面接触界面の作成、義歯床材と接着剤混合物を使用した金属ベースとコリメータの脊柱への確実な接着接着の3つのフェーズを統合しています。制限のない動きを通じて自然な運動行動を可能にし、セッション間の空間的変動を最小限に抑えて安定したポジショニングを確保し、意識のある動物モデルにおける超音波媒介脊髄介入の調査を容易にします。これは、脊髄損傷の修復、血液脊髄バリアの調節、および慢性疼痛メカニズムにおける行動評価を必要とする研究に特に関連しています。このプロトコルは、覚醒動物の神経調節研究における重要な技術的課題に対処することにより、動きを制限することなく安定したトランスデューサーと脊髄のインターフェースを提供し、より正確で信頼性の高い実験結果への道を開きます。

概要

脊髄は、中枢神経系と末梢神経系の間の情報を統合するための重要なハブであり、疼痛信号伝達、運動ニューラルネットワーク再構築、神経可塑性調節などの分野の臨床研究に役立ちます。集束超音波 (FUS) は、新たな非侵襲的神経調節技術であり、脊髄神経調節の重要な手段となっています。深部組織への浸透、ミリメートルレベルの空間分解能、制御可能なエネルギー出力パラメータなどの物理的特性により、その応用は基礎的な神経メカニズム研究からさまざまな脊髄病理学的モデルの前臨床翻訳研究まで広がります。

研究によると、FUSは脊髄神経回路を阻害するか、熱的および機械的効果によって活性化するかの2つの方法で制御できます。また、組織に対する時間的可逆性と安全性も特徴です 1,2,3。脊髄損傷モデルの研究では、FUSは炎症反応を調節し、神経修復を促進することにより、ラットの運動能力を改善しました4,5,6。さらに、FUSは、マイクロバブルを介したキャビテーション効果を通じて、血液脊髄関門を開き、局所的な薬物送達効率を高めることが示されています7,8。神経因性疼痛の分野では、Liaoらは、FUSがKCC2発現を調節し、CaMKIV KCC2経路を阻害することにより、ラットの神経因性疼痛症状を効果的に軽減することを確認しました9。Songらは、ラットの慢性狭窄損傷モデル10において、腰椎脊髄に適用された低強度のtsFUSが機械的アロディニアを大幅に減少させ、ミクログリアの活性化を抑制することを実証しました。FUS による正確な脊髄調節の達成は、超音波エネルギー供給システムの空間安定性に依存します。現在の固定戦略は主に 2 つのカテゴリに分類されます。1) 硬直固定法: 定位フレームを使用して正確な位置決めを実現しますが、継続的な麻酔が必要であり、実験対象者の神経活動を抑制し、行動評価の妥当性に影響を与えます 1,2,3,4,10 ;2)柔軟な固定法:弾性ベルト装置を使用して意識のある被験者の研究が可能ですが、脊椎の可動性が大きいため、変位誤差とトランスデューサーの剥離があります6,8,9。さらに、脊柱の椎板の幾何学的不均一性は、超音波エネルギーの有意な減衰につながり、神経調節の効率を低下させます7,8。

この研究は、意識的で自由に動くマウスにおける脊髄神経調節研究のための埋め込み型集束超音波トランスデューサー固定スキームを革新的に提案します。このプロトコルは、低侵襲の外科的アプローチを使用して、金属ベース、コリメータ、および脊柱を統合し、超音波トランスデューサの繰り返し装着をサポートし、超音波ターゲットの一貫性を確保し、椎弓板を通る超音波エネルギー減衰を許容範囲内に保ちます。開発された方法論は、既存のアプローチの重大な限界に対処し、それによって覚醒した行動する動物におけるより信頼性が高く再現性のある脊髄神経調節実験を可能にします。主なパラメータには、T13 での 2.5 cm の正中線切開、ステンレス鋼の金属ベースの固定、義歯床材とシアノアクリレート接着剤の 3:1 の体積比が含まれます。制限には、中程度の外科的侵襲性と、骨表面準備におけるオペレーター依存の精度が含まれます。

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プロトコル

本研究に記載されているすべての動物手順は、深セン先端技術研究所の動物実験の施設倫理委員会によって承認されました (証明書番号: SIAT-IACUC-200721-YGS-NLL-A1313)。すべての実験は雄のC57BL/6Jマウス(8週齢)を使用した。手術時のマウスの体重は18〜22gでした。

1. 麻酔導入と維持(5±1分)

  1. 麻酔回路を5分間予備充電します。
  2. 誘導チャンバーを、医療用空気中に 4% イソフルランを 2 L/min の流量で供給するように設定します。
  3. 正心反射の喪失後、フェイスマスク換気に切り替えます。
  4. 気化器を調整して、1.5〜2%のイソフルランの濃度を維持します。
  5. 加温ブランケットを使用してマウスの体温を37°Cに維持し、麻酔中の目標範囲は36〜38°Cです。
  6. テラマイシン点眼軟膏を塗布します。

2. ポジショニング (1 ± 1 分)

  1. マウスには調整可能な定位アダプターを使用してください。
  2. 脊椎の生理学的湾曲を維持するために、脊椎のアライメントでマウスを腹臥位にします。
  3. イヤーバーを使用してマウスの頭を固定します。
  4. 手足を左右対称に配置します。

3. 手術野の準備(1±1分)

  1. 電動バリカン(刃の隙間0.1mm)を使用して、手術部位から毛を取り除きます。
  2. 脱毛領域が約3cm×1cmであることを確認してください。
  3. 髪の成長と反対方向にクリッピングを3回実行します。

4. 切開とアプローチ(2±1分)

  1. ヨードフォアでその部分を3回(30秒間隔)拭きます。
  2. 最後の肋骨(マウスのT13椎骨に付着)を触診し、
    主要なランドマーク。T13椎骨レベルで2.5cmの切開を行います。
    メスを使用した背側正中線。
  3. 皮下筋膜を順次解剖します。
  4. 解剖学的平面を通して傍脊髄筋を露出させます。

5.傍脊髄筋郭清(5±1分)

  1. 傍脊椎筋と椎骨構造を最適に視覚化するために、手術用顕微鏡の倍率を5倍に設定します。
  2. マイクロハサミを使用して傍脊椎筋の鋭い解剖を行います。
  3. 腹側の筋肉層を温存しながら、背側および外側の傍脊椎筋を完全に切除します。
  4. 吸収性止血ガーゼで出血を管理します。

6.金属ベースの取り付け(1±1分)

  1. 固定ロッド(プラスチック)を定位アダプターに取り付けます。
  2. カスタムメタルベース(ステンレス鋼、0.28 g)をロッドの遠位端に取り付けます(図1A)。
  3. カスタムメタルベースをT13脊椎横突起に両側に配置します。
  4. 結合の安定性を確認します。

7. 骨界面の準備 (2 ± 1 分)

  1. 外科用顕微鏡下で椎板および棘突起から残存筋組織を除去します。
  2. 滅菌綿プレッジット圧縮で完全な止血を実現します。
  3. 連続生理食塩水洗浄を伴う精密骨ドリルを使用して平面接触面を作成します。発熱を最小限に抑えるために、ドリルを5,000〜10,000rpmの速度で操作します。穴あけ中はアイシールドとマスクを着用してください。
  4. 生理食塩水で湿らせた綿棒で骨粉を取り除きます。

8.固定システムのシーリング(3±1分)

  1. 義歯床材料とシアノアクリレート接着剤(502接着剤)を3:1の体積比で混合します。ニトリル手袋と安全ゴーグルを着用して、皮膚や目に触れないようにしてください。
  2. 接着剤混合物を使用して、超音波コリメータ(プラスチック、0.6 g、 図1B)と金属ベースを脊柱に取り付けます(図1C)。
  3. 接着剤混合物を制御された周囲条件(24±1°C、相対湿度40〜60%)で硬化させます。完全な凝固(表面の光沢の喪失と剛性界面の形成)が目視で確認されるまで、60秒間静的ポジショニングを維持します。
  4. 金属ベースをプラスチック製の固定棒から分離します。
  5. 固定安定性の検証:水平面の金属ベースに穏やかな回転力を加えます。コリメータと椎骨の界面を5倍の倍率で観察し、変位(<0.1 mmの公差)を調べます。動きが許容範囲を超える場合は、接着剤混合物を再塗布し(ステップ8.2)、硬化を繰り返します(ステップ8.3)。

9. 創傷閉鎖 (1 ± 1 分)

  1. 巻かれた端を揃えて、金属ベースを完全にカプセル化します。
  2. 4-0シルク縫合糸で断続縫合を行います。
  3. ヨードフォアで切開部を拭きます。
  4. コリメータの層流露露部位内の残留血液/骨の破片を取り除き、密閉と止血のために滅菌綿で梱包します。

10.術後管理

  1. 体温調節:歩行が完全に回復するまで(通常、麻酔後2〜3時間)、マウスを加温ブランケット(37°C)に維持します。
  2. 術後の抗生物質による予防:手術直後に後頸部領域に皮下注射してセファゾリンナトリウム(50 mg / kg、0.9%生理食塩水に50 mg / mLの濃度に溶解)を投与します。
  3. 創傷衛生を維持します。最初の 3 日間は生理食塩水で湿らせた綿棒を使用して傷を洗浄し、感染、裂開、または炎症の兆候がないか手術部位を毎日検査します。
  4. 術後鎮痛: カルプロフェン (5 mg/kg、皮下) を術後 3 日間 12 時間ごとに投与します11.
    注: 図1D は、回復後の生きたマウスに移植された固定システムを示しています。

11. 有害廃棄物の処理

  1. 骨粉や血液で汚染された物質を、「バイオハザード」記号のラベルが付いた漏れ防止バイオハザードバッグに集めて、認可された医療廃棄物処理施設に移送します。
  2. 未硬化の義歯床材料と 502 接着剤の残留物を「化学廃棄物」とラベル付けされた密閉された耐薬品性容器に入れ、化学廃棄物管理プロトコルに従って廃棄するために指定された換気キャビネットに保管します。
  3. 針、メスの刃、骨ドリルは、「バイオハザード」ラベルの付いた耐穿刺性鋭利物容器に廃棄してください。

12. 安全上の警告

  1. 義歯床材料を取り扱う場合は、ニトリル手袋と安全ゴーグルを着用して直接皮膚に触れないようにし、揮発性モノマーの吸入を最小限に抑えるために、換気の良いヒュームフードで混合および硬化を行ってください。
  2. 残存物質は、施設のガイドラインに従って化学廃棄物として処分します。502シアノアクリレート接着剤の場合、皮膚や目への接触を防ぎ、暴露が発生した場合はすぐに水で15分間すすぎ、医師の診察を受けてください。換気の良い場所で使用し、発火源から離れた涼しく乾燥した場所に保管し、綿やウールの生地との接触を避けてください。
  3. 精密ドリルを使用する場合は、ハンドピースを固定し、フェイスシールドとサージカルマスクを着用し、熱傷を防ぐために穴あけ部位を生理食塩水で洗浄してください。

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結果

オープンフィールドテスト
オープンフィールドテストは、手術後のマウスの潜在的な行動変化を評価するために設計されました(図2A)。40 cm × 40 cm の標準的なオープンフィールドチャンバーを使用して、比較的一貫した環境条件を維持し、外部干渉を最小限に抑えながら、マウスに十分な活動スペースを確保しました。実験は、手術前と手術後 7 日間の 2 つのフェーズで構成されていました。各フェーズで、マウスの行動を記録するために10分間のビデオ録画が行われました。SMART ソフトウェアを使用して、収集されたビデオを分析し、マウスの総移動距離を正確に測定し、それによってマウスの活動レベルを定量化しました。合計6匹のマウスが実験に参加し、各マウスの手術前後のデータが記録され、その後の統計分析のためにペアになりました。

Wilcoxon 符号付き順位検定は、GraphPad ソフトウェアを使用して実行され、手術前と手術後の段階の間で移動した総距離に有意差があるかどうかを判断しました。その結果、...

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ディスカッション

この研究は、覚醒して自由に行動するマウスにおける脊髄の正確な超音波神経調節を促進する新しい椎骨結合プロトコルを提示します。従来の固定アプローチとは異なり、この方法論は従来の固定アプローチの限界を克服します。継続的な麻酔を必要とする硬い定位フレーム(神経活動を抑制し、行動評価を複雑にする10)や、脊椎の動きによる変位誤差が発生しやすい弾性ベルト9とは異なり、この方法論は、機能研究に不可欠な自然な運動行動を維持します。脊椎骨に直接取り付けるため、デバイスの変位の可能性が低くなります。このシステムは、フォン フレイ フィラメント試験やコールド プレート アッセイなどの行動評価を含む、下肢神経因性疼痛のマウス モデルにおける治療効果の予備調査のために特に検証されています。将来の研究では、その応用がより広範な研究領域に拡大される可能性があります。

プロトコルの重要なステップには、3つの連続したフェーズが含まれます。まず、傍脊椎筋組...

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開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

この研究は、助成金HKUSZH202207003の下で香港大学深セン病院のハイレベルな人材科学研究スタートアッププロジェクトによって部分的に支援されました。プロトコルの最適化と動物ケアへの支援をしてくださったすべての研究室メンバーと、中国科学院深セン先端技術研究所(SIAT)の制度的支援に心から感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
麻酔導入チャンバー深センRWDhttps://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts
シアノアクリレート接着剤(502接着剤)北京化学工場https://item.taobao.com/item.htm?
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義歯床材ニューセンチュリーデンタルhttps://www.sncdental.com/product-item-11.html
固定ロッド習慣
イソフルラン深センRWDhttps://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia-parts
金属ベース習慣
マイクロインストゥルメント 深セン宗石科学機器有限公司
精密ドリル深センRWDhttps://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/auxiliary-equipment
小動物用マルチチャンネル麻酔システム深センRWDhttps://www.rwdls.com/product-solutions/life-sciences/modeling/anesthesia/data_66.html
マウスおよび幼体ラット用の定位アダプター長沙マユエhttps://item.taobao.com/item.htm?abbucket=14&detail_redpacket_pop
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超音波コリメータ習慣

参考文献

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  3. Kim, E., Kum, J., Kim, H. Trans-spinal focused ultrasound stimulation selectively modulates descending motor pathway. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 30, 314-320 (2022).
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  5. Hwang, B. Y., et al. Ultrasound in traumatic spinal cord injury: A wide-open field. Neurosurgery. 89 (3), 372-382 (2021).
  6. Liao, Y. -H., et al. Low-intensity focused ultrasound alleviates spasticity and increases expression of the neuronal K-Cl cotransporter in the l4-l5 sections of rats following spinal cord injury. Front Cell Neurosci. 16, 882127(2022).
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  8. Fletcher, S. -M. P., Choi, M., Ogrodnik, N., O'Reilly, M. A. A porcine model of transvertebral ultrasound and microbubble-mediated blood-spinal cord barrier opening. Theranostics. 10 (17), 7758-7774 (2020).
  9. Liao, Y. -H., Wang, B., Chen, M. -X., Liu, Y., Ao, L. -J. Lifu alleviates neuropathic pain by improvingthe kcc2 expression and inhibiting the camkiv-kcc2 pathway in the l4-l5 section of the spinal cord. Neural Plast. 2021, 6659668(2021).
  10. Song, W., Giannotti, A., Bekiaridou, A., Bloom, O., Zanos, S. Low intensity trans-spinal focused ultrasound reduces mechanical sensitivity and suppresses spinal microglia activation in rats with chronic constriction injury. Bioelectron Med. 11 (1), 8(2025).
  11. Glasenapp, A., Bankstahl, J. P., Bähre, H., Glage, S., Bankstahl, M. Subcutaneous and orally self-administered high-dose carprofen shows favorable pharmacokinetic and tolerability profiles in male and female C57bl/6j mice. Front Vet Sci. 11, 1430726(2024).

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