方法論記事

低インプット初代マウス胆管細胞におけるクロマチン状態遷移プロファイリングのためのマルチオミクス技術

DOI：

10.3791/68606

⸱

2025年7月3日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Oncology, Tianjin First Central Hospital, School of Medicine, Nankai University, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, School of Basic Medical Sciences, Tianjin Medical University, 3Shenzhen Hospital, Southern Medical University, 4Tianjin Institute of Urology, The Second Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin Medical University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この原稿では、低インプットChIP-seqによるヒストン修飾のプロファイリングと、少量の初代マウス胆管細胞におけるクロマチンアクセシビリティの評価のためのATAC-seqの包括的なプロトコールを紹介しています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多発性嚢胞性肝疾患(PLD)は、胆管細胞由来の体液で満たされた嚢胞が形成されることを特徴とする遺伝性疾患で、疾患の進行と患者の生活の質の大幅な低下につながります。現在のPLDの治療法は不十分であり、新しい治療戦略の必要性が強調されています。PLDの進行におけるエピジェネティックな制御の役割、特にクロマチンアクセシビリティとヒストン修飾は、まだ十分に解明されていません。ChIP-seqやDNase-seqなどの従来のエピジェネティックプロファイリング技術は、多数の細胞を必要としますが、初代胆管細胞からは細胞を得るのが困難です。これに対処するために、低インプットChIP-seqおよびATAC-seqプロトコルを最適化し、初代胆管細胞の数を減らしました。これらのアプローチにより、最小限の細胞入力でヒストン修飾とクロマチンアクセシビリティの解析が可能になります。低インプットChIP-seqはDNA断片化にミクロコッカスヌクレアーゼ(MNase)を利用し、ATAC-seqはTn5トランスポザーゼを使用してオープンクロマチン領域を捕捉します。これらのマルチオミクス技術は、PLDやその他の胆道疾患における胆管細胞の運命移行におけるクロマチン状態のダイナミクスに関する貴重な洞察を提供します。重要なことは、最適化されたプロトコルは、他の低インプット初代細胞に自信を持って適用でき、さまざまな細胞状況にわたるエピジェネティックなメカニズムの探索を可能にすることです。この研究は、クロマチン状態の変化を研究するための体系的なアプローチを提示し、PLDおよび関連疾患のエピジェネティクスに基づく治療戦略の開発に貢献します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PLDは、胆管細胞に由来する複数の液体で満たされた嚢胞の発生を特徴とする遺伝性疾患です。これらの嚢胞が徐々に拡大するにつれて、患者の生活の質に深刻な影響を及ぼします1,2。PLDの既存の治療戦略は不十分であり、限られた利益しか提供せず、しばしば高い再発率と合併症を引き起こします3,4。そのため、PLD治療における未解決の臨床課題に対処するために、より安全で効果的な治療アプローチが急務となっています。

通常の条件下では、胆管細胞は静止したままですが、PLDでは、疾患進行の主要なドライバーである過剰な増殖を示します5,6。この嚢胞性移行の根底にある分子メカニズムは、まだ不明です。クロマチンアクセシビリティやヒストン修飾などのエピジェネティックな制御は、細胞の運命移行において重要な役割を果たしていますが7,8、PLDの進行におけるその役割は十分に研究されていません。しかし、多くのエピジェネティックプロファイリング技術では、多数の細胞が必要です。従来のChIP-seqは、超音波処理によるクロマチン断片化や、DNase-seqやMNase-seqなどのクロマチンアクセシビリティアッセイに依存しており、通常、初代胆管細胞から得られる数をはるかに超える10〜6個の細胞が必要です。

この原稿は、低インプットChIP-seq 9,10,11でヒストン修飾をプロファイリングし、ATAC-seq 11,12,13で低初代胆管細胞のクロマチンアクセシビリティを評価するための包括的なプロトコールを提供します。低インプットChIP-seqはMNaseを用いてDNA9を断片化し、ATAC-seqはTn5トランスポゼーゼ12を用いて開放クロマチン領域からDNA断片を捕捉します。これらのアプローチを利用したマルチオミクス解析は、PLDやその他の胆道疾患における胆管細胞の運命移行におけるクロマチン状態のダイナミクスに関する貴重な洞察を提供し、エピジェネティック標的治療の開発を促進します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. ATAC-seq用溶液と胆管細胞の調製

  1. ATAC-seq実験の少なくとも1日前に、 表1に記載されている試薬を使用してATAC溶解バッファーを調製します。
    注:ATAC溶解バッファーは、暗所で4°Cで少なくとも1か月間保存できます。
  2. 新たに単離された初代胆管細胞14については、単離後すぐに血球計算盤を用いて細胞をカウントし、ATAC-seq実験を進めてください。
    注:細胞生存率への影響を最小限に抑えるには、早ければ早いほど良いです。ただし、氷の上に置いておくと、通常は2時間以内に進行しても問題ありません。

2. ATAC-seq

注:ATAC-seqには100,000個の胆管細胞を使用してください。サンプルと溶液を氷上に保管します。ATAC-seq実験では、全体の手順に約2日かかります。

  1. 500 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
  2. 上清を捨て、プロテアーゼ阻害剤を含むATAC Lysis Bufferを200 μL加え、ピペットで静かに混合し、氷上で20分間インキュベートします。最初の10分間は、静かにピペットで混ぜます。
  3. 1,500 × g で4°Cで10分間遠心分離します。
  4. ATAC DNAライブラリ調製キットから3 μLのEnzyme Mix、ATAC DNAライブラリ調製キットから10 μLの5x Buffer、およびヌクレアーゼフリーの水37 μLを混合して、トランスポジション反応バッファー(50 μL)を調製します。よく混ぜます。
  5. 上清を慎重に捨て、回収した核ペレットを氷の上に置き、すぐに50μLのTransposition Reaction Bufferを加えます。静かに再懸濁し、37°Cで60分間インキュベートし、10分ごとにチューブの底をフリックして混合します。
    注:細胞が乾燥するのを防ぐために、上清を捨てる前にトランスポジション反応バッファーを準備してください。
  6. PCR精製キットを使用して、製造元の指示に従ってDNAを精製します。
    注:胆管細胞単離プロセス14 からの残留タンパク質Gビーズは、このステップで除去することができる。DNAサンプルは-80°Cで保存でき、長期保存が可能です。
  7. ATAC DNAライブラリ調製キットを使用して、製造元の指示に従ってライブラリ構築を行います。
    注:特に指定がない限り、すべてのサンプルと溶液を氷上に保管してください。手順は他のキットブランドによって異なる場合がありますが、すべて当社のプロトコルと互換性があります。
    1. PCR濃縮:PCRチューブ内で、10 μLのDNAサンプル(ステップ2.6から)、14 μLのヌクレアーゼフリー水、10 μLの5x TAB10 μL、5 μLのPPM、1 μLのTAE、5 μLのP5プライマー、および5 μLのP7プライマーを混合して、PCRチューブ内でPCR濃縮ミックス(50 μL)を調製します。やさしくピペットで混ぜます。
    2. チューブをPCR装置に移し、次のプログラムを実行します:(72°Cで3分間)×1サイクル、(98°Cで30秒)×1サイクル、(98°Cで15秒、60°Cで30秒、72°Cで3分間)×15サイクル、(72°Cで5分間)×1サイクル、4°Cで保持します。
    3. 精製:DNA Cleanビーズを室温で30分間にして使用し、その後、2段階の磁気ビーズ精製を行います。
      1. 第1ラウンド:30 μLのDNA CleanビーズをPCR産物(ステップ2.7.2)に加え、ピペットで静かに混合し、室温で5分間インキュベートします。PCRチューブを磁気セパレーターに置き、溶液が透明になるまで待ちます(~5分)。上清を新しいチューブに慎重に移し、DNA Cleanビーズを捨てます。
      2. 第2ラウンド:採取した上清(ステップ2.7.3.1)に7.5μLのDNAクリーンビーズを加え、ピペットで静かに混合し、室温で5分間インキュベートします。チューブを磁気セパレーターに置き、溶液が透明になるまで待ちます(~5分)。上清は慎重に捨てます。
    4. チューブをマグネティックセパレーターに保持し、DNA Cleanビーズを室温で調製したばかりの80%エタノール200μLで2 x 30秒間すすぎます。すすぐたびに上清を慎重に捨ててください。チューブを磁気セパレーターに取り付けたまま、チューブの蓋を開け、ビーズを10分間風乾します。最後に、22 μLのヌクレアーゼフリー水を加えてDNAを溶出します。
      注:DNAサンプルは、長期保存のために-80°Cで保存できます。
  8. 標準の次世代シーケンサーを使用してライブラリをシーケンスします。
    注:少なくとも5,000万のペアエンドリードを取得することをお勧めします。

3. Low-input ChIP-seqのための溶液と胆管細胞の調製

  1. 低インプットChIP-seq実験の少なくとも1日前に、 表2、表3、表4、および表5に記載されている試薬を使用して、ChIP Lysis Buffer、ChIP MNase Buffer、ChIP Stop Buffer、ChIP 2x RIPA Buffer、ChIP RIPA Buffer、およびChIP LiCl Bufferを調製してください。
    注:上記の溶液は、4°Cで少なくとも1か月間保存できます。
  2. 単離されたばかりの初代胆管細胞14については、単離後すぐに血球計算盤を用いて細胞をカウントし、低インプットChIP-seq実験を進めます。
    注:細胞生存率への影響を最小限に抑えるには、早ければ早いほど良いです。ただし、氷の上に置いておくと、通常は2時間以内に進行しても問題ありません。

4. Low-input ChIP-seqの1日目:細胞溶解、MNase消化、抗体インキュベーション

注:低インプットChIP-seq実験の場合、全体の手順は約3日かかります。

  1. 胆管細胞をチューブあたり100,000細胞のアリコートに分割し、サンプルと溶液を氷上に保ちます。
    注:複数のヒストン修飾について低インプットChIP-seq実験を行う場合は、ヒストン修飾抗体を添加する前に、容量を比例的にスケールアップしても問題ありません。次のステップの試薬容量は、1 × 105 個の細胞を含む 1 本のチューブに基づいています。
  2. 2,000 × g で4°Cで5分間遠心分離します。
  3. 上清を捨て、プロテアーゼ阻害剤を含むChIP Lysis Buffer 19 μLを加え、ピペットで静かに混合し、氷上で10分間インキュベートします。気泡の発生を避けてください。
  4. 19 μLのChIP MNase Bufferを加え、ピペットで静かに混合します。
  5. 2 μL の MNase (0.01 U/μL) を加え、ピペットで静かに混合します。37°Cで5分間インキュベートします。
    注:インキュベーション時間は重要です。MNaseの最終濃度は0.0005 U/μLです。MNaseの最適な濃度は、細胞の種類と数に基づいて決定できます。
  6. すぐにサンプルを氷上に置いた後、5 μLのChIP STOP Bufferを加えて分解を終了し、ピペットで静かに混合します。
  7. プロテアーゼ阻害剤を含むChIP 2x RIPA Buffer 45 μLを加え、ピペットで静かに混合し、さらに氷上で10分間インキュベートします。
  8. 20,000 × g で4°Cで15分間遠心分離します。 上清をゆっくりと新しいチューブに移します。
    注:胆管細胞単離プロセス14 からの残留タンパク質Gビーズは、このステップで除去することができる。
  9. 40 μLのChIP RIPA Bufferを添加します。
  10. 免疫沈降(IP)サンプルの場合は、サンプルあたり1 μgの抗体を添加し、懸濁液をローテーター(20 rpm)で4°Cで一晩インキュベートします。
  11. インプットサンプルの場合は、抗体を添加せず、懸濁液をローテーター(20 rpm)で4°Cで一晩インキュベートします。

5. Low-input ChIP-seqの2日目:免疫沈降、洗浄、溶出

注: IP サンプルの場合は、手順 5.1 から 5.7 に従ってください。入力サンプルの場合は、手順 5.8 から 5.12 に従います。

  1. Protein Gビーズを氷冷したChIP RIPA Buffer1 mLで予洗浄してください。
  2. 400 μgのProtein Gビーズをサンプルに加え、4°Cで2時間回転(20 rpm)してインキュベートします。
  3. ビーズを5 x 5分間、氷冷した150 μLのChIP RIPA Buffer Bufferで4°C、5分間ローテーター(20 rpm)で洗浄します。磁気セパレーターを使用して上清を取り除きます。
  4. ビーズを氷冷した150 μLのChIP LiCl Bufferで4°C、5分間ローテーター(20 rpm)で洗浄します。磁気セパレーターを使用して上清を取り除きます。
  5. ChIP Elution Buffer 30 μL(ヌクレアーゼフリー水29 μL、プロテイナーゼK 1 μL)を加えてビーズを再懸濁し、900 rpm、55 °Cで90分間振とうします。定期的にチューブをそっとフリックして、ビーズを懸濁状態に保ちます。
  6. 磁気セパレーターを使用して上清を収集し、ゆっくりと新しいチューブに移します。72°Cで40分間インキュベートし、プロテイナーゼKを不活性化します。
  7. 蛍光光度計を使用してDNA濃度を測定します。
    注:DNAサンプルは、長期保存のために-80°Cで保存できます。
  8. インプットサンプルの場合は、1 μL のプロテイナーゼ K を加え、900 rpm で 55 °C で 90 分間振とうします。
  9. フェノール-クロロホルム抽出法を用いてDNAを精製します。130 μLのDNA抽出試薬を加え、溶液がピンク色に変わるまで激しくボルテックスします。20,000 × g で5分間遠心分離します。
  10. 上清を新しいチューブに移し、氷冷したイソプロパノール130μLを加え、次にグリコーゲン1μLと3M NaAc6.5μLを加えます。20,000 × g で15分間遠心分離します。
  11. 上清を捨て、70%エタノール1mLで1回洗浄し、20,000 × g で15分間遠心分離します。ペレットを乾燥させ、30 μLのヌクレアーゼフリー水に再懸濁します。
  12. 蛍光光度計を使用してDNA濃度を測定します。
    注:DNAサンプルは、長期保存のために-80°Cで保存できます。

6. 低インプットChIP-seqの3日目:ライブラリの構築とシーケンシング

  1. 製造元の指示に従って、ChIP DNAライブラリ調製キットを使用してライブラリ構築を行います。
    注:ステップには、エンドプレパレーション、アダプターライゲーション、およびライブラリ増幅が含まれます。ライブラリ構築用のChIPサンプル(インプットおよびIPサンプル)5 ngをピペットで保存します。特に指定がない限り、すべてのサンプルと溶液は氷上に保管してください。手順は他のキットブランドによって異なる場合がありますが、すべて当社のプロトコルと互換性があります。
  2. 最終調製:5 ngのDNAサンプル(ステップ5.6またはステップ5.11)、15 μLのEnd Prep Mix 4、6.5 μLのTris EDTA、およびヌクレアーゼフリーの水を混合して、PCRチューブにEnd Preparation Reaction Buffer(65 μL)を調製し、最終容量65 μLにします。チューブをPCR装置に移し、次のプログラムを実行します:20°Cで15分間、65°Cで15分間、4°Cで保持します(Hot Lid:105°C)。
  3. アダプターライゲーション:DNAアダプターSを1:100の比率で希釈します。65 μLのEnd Preparation Products(ステップ6.2)、25 μLのRapid Ligation Buffer 2、5 μLのRapid DNA Ligase、および5 μLの希釈したDNA Adapter Sを混合して、PCRチューブにAdapter Ligation Reaction Buffer(100 μL)を調製します。チューブをPCR装置に移し、次のプログラムを実行します:20°Cで15分間、続いて4°Cで保持します(ホットリッド:105°C)。
  4. 浄化：
    1. DNA Cleanビーズを室温で30分間戻してからご使用ください。60 μLのDNA CleanビーズをAdapter Liation製品に加えます(ステップ6.3以降)。静かにピペットで混合し、室温で5分間インキュベートします。
    2. PCRチューブを磁気セパレーターに置き、溶液が透明になるまで待ちます(~5分)。上清は慎重に捨てます。
    3. チューブを磁気セパレーターの上に置いておきます。DNA Cleanビーズを、調製したばかりの80%エタノール200 μLで2 x 30秒間、室温で洗い流します。すすぐたびに上清を慎重に捨ててください。
    4. チューブを磁気セパレーターに置いたまま、チューブの蓋を開け、ビーズを5分間風乾します。最後に、22.5 μL の 10 mM Tris-HCL (PH 8.0) を添加して DNA を溶出します。
  5. ライブラリー増幅:20 μLの精製産物(ステップ6.4)、2.5 μLのi5 PCR Primer、2.5 μLのi7 PCR Primer、および25 μLのAmplification Mixを混合して、PCRチューブ内にLibrary Amplification Reaction Buffer(50 μL)を調製します。やさしくピペットで混ぜます。チューブをPCR装置に移し、次のプログラムを実行します:(95°Cで3分間)×1サイクル、(98°Cで20秒、60°Cで15秒、72°Cで30秒)×18サイクル、(72°Cで5分間)×1サイクル、4°Cで保持します。
  6. 精製:DNA Cleanビーズを室温で30分間にして使用し、その後、2段階の磁気ビーズ精製を行います。
    1. 第1ラウンド:30 μLのDNA CleanビーズをLibrary Amplification製品に加えます(ステップ6.5以降)。静かにピペットで混合し、室温で5分間インキュベートします。PCRチューブを磁気セパレーターに置き、溶液が透明になるまで待ちます(~5分)。上清を新しいチューブに慎重に移し、DNA Cleanビーズを捨てます。
    2. 第2ラウンド:採取した上清に7.5μLのDNAクリーンビーズを加えます。静かにピペットで混合し、室温で5分間インキュベートします。チューブを磁気セパレーターに置き、溶液が透明になるまで待ちます(~5分)。上清は慎重に捨てます。チューブを磁気セパレーターの上に置いておきます。DNA Cleanビーズを、調製したばかりの80%エタノール200 μLで2 x 30秒間、室温で洗い流します。すすぐたびに上清を慎重に捨ててください。チューブを磁気セパレーターに取り付けたまま、チューブの蓋を開け、ビーズを10分間風乾します。最後に、22.5 μL の 10 mM Tris-HCl (PH 8.0) を添加して DNA を溶出します。
      注:DNAサンプルは、長期保存のために-80°Cで保存できます。
  7. ライブラリのシーケンスは、標準の次世代シーケンサーで行います。
    注:少なくとも1,000万〜2,000万のペアエンドリードを取得することをお勧めします。

7. ATAC-seqとLow-input ChIP-seqのデータ解析

  1. 解析仮想環境(miniconda)の準備
    1. 次のコマンドを使用してWebサイトからMiniconda3をダウンロードし、Minicondaのインストール手順に従います。
      wgetの https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/Miniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
      バッシュMiniconda3-4.7.12.1-Linux-x86_64.sh
    2. ATAC-seqとChIP-seqの両方の解析パイプラインのための優れた環境を構築します。
      conda create -n NGSpipeline
      conda activate NGSpipeline
      conda install bioconda::fastqc bioconda::multiqc bioconda::trim-galore bioconda::bowtie2 bioconda::samtools bioconda::macs2 bioconda:::d eeptools bioconda::p iCard Bioconda::igv
    3. 参照ゲノム配列ファイルをダウンロードし、bowtie2 alignmentのアライメントインデックスを作成します。
      wget https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_mouse/release_M25/GRCm38.p6.genome.fa.gz
      ガンジップGRCm38.p6.genome.fa.gz
      bowtie2-build-s GRCm38.p6.genome.fa GRCm38_bowtie2_index
  2. FastQCでATAC-seqリードおよびChIP-seqリードの品質管理を行い、MultiQCを使用して品質管理レポートを要約することで、シーケンシング結果のGCバイアスとダウンストリーム解析に十分なライブラリの複雑さを確保します。大幅に異なる品質管理結果を持つシーケンスライブラリを破棄します。
    fastqc -o <出力ディレクトリ> ......
    multiqc     <出力ディレクトリ>
  3. 豊富なトリムを使用して、シーケンスアダプターをトリミングします。
    trim_galore -q 20 --phred33 --stringency 3 --length 25 -e 0.1 --paired -j <スレッド番号> -o <出力ディレクトリ> <ペアエンド読み取り 1> <ペアエンド読み取り 2>
  4. トリミングしたリードをデフォルトパラメータを使用してBowtie2でmm10リファレンスゲノムアセンブリにマッピングし、ATAC-seqフラグメントの長さ分布が広いため、ATAC-seqの追加パラメータ(--very-sensitive -X 2000)をbowtie2に渡します。
    1. ATAC-seqの場合:
      bowtie2 -p <スレッド番号> --非常に敏感 -X 2000 -x <ステップ 7.1.3 からのゲノムインデックス> -1 <4.2 から fastq ファイルを read 1> -2 < 4.2 から fastq ファイルを read 2> | samtools view -S -O BAM -@ <スレッド番号> -o
    2. ChIP-seqの場合:
      bowtie2 -p <スレッド番号> -x <ステップ 7.1.3 からのゲノムインデックス> -1 <4.2 からクリーニングされた fastq ファイル 1 > -2 < 4.2 からクリーニングされた fastq ファイル 2 をリード> | samtools view -S -O BAM -@ <スレッド番号> -o <出力 bam ファイル>
  5. アライメントスコアが低いリード(q30)と、ミトコンドリアゲノムと非標準染色体にアライメントされたリードを削除します。
    samtools view -bh -q 30 -f 2 <入力 BAM ファイル> | samtools view -h | grep -v 'chrM' | grep -v 'random' | grep -v 'chrUn' | samtools sort -l 9 -O BAM -o <出力フィルタされた BAM ファイル>
  6. Picard MarkDuplicatesコマンドを使用して、PCR重複読み取りを削除します。
    picard MarkDuplicates I=<入力フィルタリングされた bam ファイル> O= M=<重複レポートファイルを削除> REMOVE_DUPLICATES=true
  7. MACS2 callpeak コマンドにパラメーター -f BAMPE -g mm -B -q 0.01 を指定してピークを呼び出します。
    macs2 callpeak -f BAMPE -t <重複削除 BAM ファイル > -g mm -n <出力プレフィックス> -B -q 0.01
  8. Deeptools BamCoverageコマンドを使用してBigWigファイルを生成します。
    samtools index <重複 bam ファイルの削除> -@ 4
    bamCoverage -b     <重複を削除 bam ファイル> -o -bs 50 -p <スレッド番号> --effectiveGenomeSize2652783500--normalizeRPGC -e -ignoreDuplicates を使用する
  9. IGVゲノムブラウザを使用して、macs2のnarrowPeakファイルおよびDeeptools BamCoverageのBigWigファイルを表示します。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

初代胆管細胞のクロマチンランドスケープを生成するために、初代胆管細胞の数が少ない(~100,000)低インプットChIP-seqおよびATAC-seqプロトコルを最適化しました。初代胆管細胞のアガロースゲル電気泳動の結果は、1×105 の初代胆管細胞について、0.02 U MNaseを37°Cで5分間行ったところ、モノヌクレオソームが産生されることが示され、これが最適な濃度として同定されました(図1)。

WTまたはPLDマウスの胆管細胞のATAC-seqおよびH3K9ac/H3K9me3低入力ChIP-seq解析の概要
WTおよびPLD胆管細胞のクロマチンアクセシビリティレベルのゲノムワイド解析により、高品質のATAC-seqおよびChIP-seqデータが得られました。ATAC-seqおよび低インプットChIP-seqを含むすべてのシーケンシング実験は、再現性を確保するために2つの生物学的レプリケートで実施されました。FastQCを用いて実施したATAC-seq...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

嚢胞性胆管細胞の状態遷移の根底にあるクロマチン状態動態を系統的かつ包括的にマッピングするために、限られた数の初代胆管細胞に対して低インプットChIP-seqとATAC-seqを最適化することに成功しました。この研究は初代胆管細胞に焦点を当てていますが、このプロトコルは、利用可能性が限られている他の高生存率初代細胞にも適用できると確信しています。同様に、この研究ではH3K9acおよびH3K9me3のChIP-seq解析結果のみを示していますが、このプロトコルは、H3K4me1、H3K4me3、H3K9ac、H3K27acなどの活性化マークや、H3K9me3、H3K27me3、H3K36me3などの抑制マークを含む他のヒストン修飾にも同様に適用できます。実験を成功させるためには、いくつかの重要なステップが不可欠です。

最初の重要なステップは、初代胆管細胞単離の高い生存率を確保することです。ATAC-seqと低インプットChIP-seqはどちらも、生存率の高い細胞を必要とします。したがって、細胞は単離後すぐにカウントして...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は、宣言する利益相反を持っていません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、中国国家自然科学基金会(82402166からR.J.)からの助成金によって支援されました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5 M EDTASolarbioE1170
1 M Tris-HCl (pH=7.5)SolarbioT1140
1 M Tris-HCl (pH=8.0)SolarbioT1150
3 M NaAcBeyotimeST342
8 M LiClSigmaL7026
アガロースゲルBiosharpBS081
ATAC DNAライブラリー準備キットVazymeTD501
CaCl2Sangon BiotechA5013301 M ストック
ChIP DNA ライブラリー 準備キットVazymeND607
DNA クリーンビーズVazymeN411
DNA 抽出試薬SolarbioP1012
EGTASolarbioE8050100 mM (pH = 8) ストック
蛍光光度計InvitrogenQ33226
グリコーゲンThermo ScientificR0561
血球計算器QIUJINGXB。K.25。
Igepal CA-630シグマI889610% ストック
磁気セパレーターPromegaZ5342
MgCl2Sangon BiotechA1002881.5 M ストック
MNaseSigmaN37550.01 U/µL ストック
NaClサンゴン バイオテックA6104765 M ストック
NP40SolarbioN8030
ヌクレアーゼフリー水ライフテクノロジーズAM9937
PCR 機器アプライド バイオシステム4484073
PCR 精製キットQIAGEN28106
プロテアーゼ阻害剤ロシュ04693132001
プロテインGビーズInvitrogen10004D
プロテイナーゼ KTransGenGE201-01
ローテーターKylin-BellQB-528
SDSSolarbioS8010 10%  ストック
デオキシコール酸ナトリウムシグマS1827
サーモミキサー コンフォートエッペンドルフ5355
Triton X-100SolarbioT8200
Tween-20SolarbioT8220
SoftwareCitation (PMID)/CompanyVersionWebsite
Bowtie2223882862.3.5.1https://github.com/BenLangmead/bowtie2
Deeptools27079975 3.4.3 https://deeptools.readthedocs.io/en/latest/
FastQC0.12.1https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
IGV212210952.12.3https://igv.org/
MACS2187989822.2.7.1https://hbctraining.github.io/Intro-to-ChIPseq/lessons/05_peak_calling_macs.html
MinicondaAnaconda4.7.12.1 https://www.anaconda.com/
MultiQC273124111.23https://seqera.io/multiqc/
Picard2.27.5https://broadinstitute.github.io/picard/
samtools335908611.6https://www.htslib.org/
トリムガロア0.6.6https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore/
ズ

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Perugorria, M. J., et al. Polycystic liver diseases: Advanced insights into the molecular mechanisms. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 11 (12), 750-761 (2014).
  2. Olaizola, P., et al. Genetics, pathobiology and therapeutic opportunities of polycystic liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 19 (9), 585-604 (2022).
  3. Masyuk, T. V., Masyuk, A. I., Larusso, N. F. Polycystic liver disease: Advances in understanding and treatment. Annu Rev Pathol. 17, 251-269 (2022).
  4. Masyuk, T. V., Masyuk, A. I., Larusso, N. F. Therapeutic targets in polycystic liver disease. Curr Drug Targets. 18 (8), 950-957 (2017).
  5. Caballero-Camino, F. J., et al. Synthetic conjugates of ursodeoxycholic acid inhibit cystogenesis in experimental models of polycystic liver disease. Hepatology. 73 (1), 186-203 (2021).
  6. Masyuk, A. I., Masyuk, T. V., Trussoni, C. E., Pirius, N. E., Larusso, N. F. Autophagy promotes hepatic cystogenesis in polycystic liver disease by depletion of cholangiocyte ciliogenic proteins. Hepatology. 75 (5), 1110-1122 (2022).
  7. Meng, Y., et al. Epigenetic programming defines haematopoietic stem cell fate restriction. Nat Cell Biol. 25 (6), 812-822 (2023).
  8. Perino, M., Veenstra, G. J. Chromatin control of developmental dynamics and plasticity. Dev Cell. 38 (6), 610-620 (2016).
  9. Zhang, B., et al. Allelic reprogramming of the histone modification h3k4me3 in early mammalian development. Nature. 537 (7621), 553-557 (2016).
  10. Brind'amour, J., et al. An ultra-low-input native chip-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations. Nat Commun. 6, 6033(2015).
  11. Liu, Z., Zhang, L., Chen, Y. Epigenomic, cistromic, and transcriptomic profiling of primary kidney tubular cells. J Biol Methods. 11 (2), e99010015(2024).
  12. Buenrostro, J. D., Giresi, P. G., Zaba, L. C., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. Transposition of native chromatin for fast and sensitive epigenomic profiling of open chromatin, DNA-binding proteins and nucleosome position. Nat Methods. 10 (12), 1213-1218 (2013).
  13. Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. Chromatin accessibility profiling by atac-seq. Nat Protoc. 17 (6), 1518-1552 (2022).
  14. Ji, R., Qing, B., Chen, J., Zhao, Z., Zhang, L. Isolation and culture of primary cholangiocytes from mice with polycystic liver disease using a two-step digestion method. J Vis Exp. (219), e68202(2025).
  15. Spirli, C., et al. Cyclic amp/pka-dependent paradoxical activation of raf/mek/erk signaling in polycystin-2 defective mice treated with sorafenib. Hepatology. 56 (6), 2363-2374 (2012).
  16. Lin, T. C. Runx1 and cancer. Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (3), 188715(2022).
  17. Spirli, C., et al. Mammalian target of rapamycin regulates vascular endothelial growth factor-dependent liver cyst growth in polycystin-2-defective mice. Hepatology. 51 (5), 1778-1788 (2010).
  18. Ji, R., et al. Multi-omics profiling of cholangiocytes reveals sex-specific chromatin state dynamics during hepatic cystogenesis in polycystic liver disease. J Hepatol. 78 (4), 754-769 (2023).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

Low input ChIP seqATAC seq ProtocolChromatin AccessibilityHistone ModificationsPrimary CholangiocytesEpigenetic ProfilingMicrococcal NucleaseTn5 Transposase
動画は近日公開

関連記事