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方法論記事

Circadian Rave System: あらゆる光ベースの実験に対応する、手頃な価格でオープンソースで構築が簡単なシステム

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DOI:

10.3791/68611

2025年9月26日

この記事について

サマリー

ここでは、複数の複雑な光領域を管理するためのArduinoベースの発光ダイオード(LED)コントローラーであるCircadian Raveシステムを構築、プログラミング、および実行するためのプロトコルについて説明します。

要約

照明の正確な制御は、すべての生物科学に幅広く応用されていますが、概日研究ほど応用できるものはありません。地球上の生命は、24時間太陽日を同調する生理学と行動の内因性調節因子である概日時計を進化させてきました。時計を研究するために、研究者らは概日リズムを同調させるために光または温度の実験的操作に依存しています。現在、ほとんどの研究室では、市販の照明器具または社内で製造された照明器具を使用して、昼と夜の自然なサイクルを模倣したり、中断したりしています。これらのシステムは、プログラマビリティと精度が限られており、標準化が欠けており、場合によっては手頃な価格です。これらの問題に対処するために、複数の独立したライトボックスを正確に制御できる特注のソフトウェアおよびハードウェア パッケージである Circadian Rave System を開発しました。このシステムを使用して将来の研究を標準化できるように、詳細なハードウェアビルドガイドとともにソフトウェアをオープンソース化しました。このシステムの機能と概日実験におけるその有用性を実証するために、さまざまな光パラダイムで ショウジョウバエ の寿命と活動を測定し、光操作による概日同期と混乱を示しました。結論として、当社は、電子工学やプログラミングに関する最小限の予備知識があれば、研究者なら誰でも社内で構築できる、標準化され、スケーラブルで手頃な価格の照明システムを開発しました。

概要

光の正確な制御は、動物が関与するほとんどすべての実験において重要です。このような動物の実験室での飼育のために、複雑な明暗サイクルレジームをプログラミングするための能力が限られている市販のインキュベーターを購入できます。複雑な照明体制をプログラムする能力は、多くの研究分野で必要ですが、概日研究では重要です。太陽日に同調する概日時計は、昆虫から哺乳類への生理機能と行動の変化を調節する内因性振動子です1。このように、概日研究は、発達2、免疫3、ヒト疾患病理学4など、生物学研究の多くの分野に浸透し始めています。概日時計の研究は、タイミング、強度、およびサイクルの正確な制御を通じて時計を操作したり、さらには混乱させたりするために、光または温度を使用することに大きく依存しています5,6。現在、概日実験で使用するために、これらの変数を制御するための、手頃な価格でスケーラブルで標準化されたシステムが必要です。

内因性概日時計の操作に加えて、特定の波長の光を使用して導入遺伝子の発現を制御するさまざまな光遺伝学的ツールが開発されています in vivoおよびin vitro。たとえば、ショウジョウバエの計り知れない遺伝的扱いやすさ ショウジョウバエ 研究者が利用できる多くの光遺伝学的ツールが生まれました。たとえば、Gal4転写因子の光感受性shineGal4変異体は、ブルーライトにさらされると活性化され、多くの研究室で日常的に使用されるツールです7,8,9。研究者は、手動でライトをオンにするか、レーザー誘導を介して光の変化を達成する傾向がありますが、どちらの方法でも、実験設計と実装中にロジスティクス的および技術的な制約が生じる可能性があります。光の開始、停止、特定の波長、サイクル、および強度(線量)をプログラムする機能は非常に有益です。

研究者が照明条件を完全に制御できるように、サーカディアン レイブ システム (CRS) を設計しました。これは、研究者が構築および適応できる代替の手頃な価格の日曜大工 (DIY) システムであり、照明体制を完全にカスタマイズできます。このシステムは、最大 6 つの独立した LED チャネルを制御できる Arduino マイクロコントローラーに依存しているため、システムは手頃な価格でスケーラブルです。Arduinoなどのマイクロコントローラは、その使いやすさのために、多くのDIY実験装置の製造に成功しています101112。このシステムは既存のインキュベーターで使用でき、一般的な実験温度でのテストに成功しており、幅広い機能(4-37°C)を提供します。ユーザーは、複数のオペレーティングシステム用に開発された特注のオープンソースソフトウェアを介してCRSをプログラムできます。このソフトウェアには使いやすいユーザーインターフェイスがあり、複雑な光体制をプログラミングして太陽光のパターンをより厳密に模倣できます。これらのカスタム光レジームを作成して保存し、後でマイクロコントローラにロードできるため、以前に生成された一連の光レジームを使用できるため、実験セットアップの時間を節約できます。一度プログラムされたデバイスは、コンピューターから切断できるため、照明体制を実行するために専用コンピューターを必要とする従来のシステムと比較して拡張性が可能になります。CRSの信頼性をテストするために、CRSが生成したさまざまな光体制にさらされた ショウジョウバエ の寿命と活性分析を実施しました。CRSは、複数の照明体制を数か月間連続して確実に実行することがわかりました。

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プロトコル

1. CRSの構築

注: CRS は研究者によって社内で構築されるように設計されているため、すべてのコンポーネントは複数のベンダーから市販されています (材料表)。例外は、PCB印刷の専門家によって、または著者に連絡することによって商業的に製造されなければならないプリント回路基板(PCB)です。商用本番環境の場合、ガーバーファイルはGitHubリポジトリ(@Trincatalyst/CRS/Hardware/gerber/microcontroller_PCB)にあります。大学の工学部には通常、PCB 印刷施設があります。以下は、単一のCRSユニットの構築、品質チェック、およびプログラミングの方法に関する詳細な手順です。

  1. 回路の組み立て
    1. 電気部品をマイクロコントローラのPCBにはんだ付けします。Arduino A1コネクタピンは、下部に取り付けられた唯一のコンポーネントです。PCB上のコンポーネントの配置は、PCB上の文字番号のラベルに対応します(表1)。はんだ付けされた接続をマルチメーターでテストします。
    2. A1接続を使用して、組み立てられたPCBの底面にArduinoを挿入します。
    3. LED または LED ストリップを 12 V ケーブル ワイヤ (少なくとも 1 m の長さを推奨) にはんだ付けし、12 V ワイヤのプラス端とマイナスの端を PCB 端子台にねじ込み、ドライバーで所定の位置に固定します。
      注: カスタム LED PCB (@Trincatalyst/CRS/ハードウェア/ガーバー/LED_PCB) は、LED ストリップの代替品として使用できます。各 LED PCB には 1 つの LED が収容されています。これにより、既知の離散発光スペクトルを持つLEDを使用するという利点があります。
    4. 6つのチャンネルのそれぞれについて、手順1.1.3を繰り返します。
      メモ: LED ストリップを使用する場合、各 LED チャネルは最大 400 mA の電流を処理でき、これは最大 20 個の LED (各 20 mA) に相当します。したがって、このシステムは、6つの出力チャネルのそれぞれに最大20個のLEDが取り付けられた5V LEDストリップで使用するように設計されています。
  2. CRSエンクロージャーの構築
    1. 回路の安全性と寿命を確保するために、CRS(PCBおよびArduino)を囲みます。
      注: GitHub リポジトリには、PLA と ABS の両方で正常にプリントされた 3D プリント可能なエンクロージャがあり、デバイス (@Trincatalyst/CRS/ハードウェア/CRS_enclosure) を保護します。
  3. LEDエンクロージャ
    1. LEDをインキュベーターに直接統合して、既存の照明セットアップを置き換えるか、単一のインキュベーターに積み重ねることができる特注の筐体に配置します(図1)。
    2. オーダーメイドのエンクロージャには、拡張性の向上、手頃な価格、スペース要件の削減という利点があります。チップボックスなどの実験用プラスチックをリサイクルすると、コストをさらに削減できます(図1D)。これらのリサイクルされた箱を絶縁テープで「黒く」して、光漏れを防ぎます。ただし、より耐久性のあるソリューションとして、テストに成功したアクリル製のマシンエンクロージャ(@Trincatalyst/CRS/ハードウェア/LED_enclosure)を使用します。
      注意: 漏れにより並行して実行されている他の近くの実験が混乱する可能性があるため、エンクロージャが遮光性であることを必ずテストし、小さな容器で LED ストリップを使用する場合、LED が容器内の温度を上昇させないことをテストしてください。
  4. CRSへのファームウェアのインストール
    1. definition.h ファイルと CircadianRaveSystem.ino ファイルの 2 つのファイルで構成される CRS ファームウェアをダウンロードします。どちらもGitHubリポジトリ(@Trincatalyst/CRS/Software/PCB_firmware)にあります。
    2. www.arduino.cc/software からArduino統合開発環境(IDE)ソフトウェアをダウンロードしてインストールします。
    3. USBリードを介してArduinoをコンピューターに接続し、ArduinoIDE内で正しいArduino通信(COM)ポートを選択して接続を確立します。
      メモ: ファームウェア構成中にArduinoをPCB回路に接続する必要はありません。
    4. 次に、[ ファイル] > [開く] に移動し、definition.h ファイルと CircadianRaveSystem.ino ファイルを含むフォルダーを選択します。
    5. 新しいIDEウィンドウが開いたら、「 検証」 をクリックし、アップロードします。これにより、ファームウェアがArduinoにインストールされます。出力端子には完了出力が表示されます。
    6. Arduinoを取り外し、CRSとして使用する準備が整いました。
  5. CRS の電源オン
    1. 2.5 A の能力を持つ 5 V 電源を PCB 電源バレルに挿入して、CRS に電力を供給します。
      メモ: 各 LED チャネルは、最大 400 mA の電流を処理するように設計されており、これはそれぞれ 20 mA で最大 20 個の LED に相当します。このシステムは、6つの出力チャンネルのそれぞれに最大20個のLEDが取り付けられた5V LEDストリップで使用するように設計されています。PCBには過電圧および過電流保護装置が装備されており、3Aの連続電流でトリガーするか、ユーザーが6.2Vを超える電源電圧を差し込むと電源が遮断されます。
  6. CRSの品質テスト
    1. CRSで実験を実行する前に、CRSに接続された各LED / LEDストリップが少なくとも2日間確実に動作することをテストします。これを行うには、GitHub リポジトリ (@Trincatalyst/CRS/Software/Test/CRS_test_2days.txt) にある CRS_test_profile.txt ファイルを実行するか、CRS ソフトウェア内でライト体制を設計します。プロファイルの読み込み手順 2.6 には、CRS_test_2days.txt ファイルの実行方法に関する手順が記載されています。

2. 実験の実行

  1. 次の手順に従って、複雑な照明体制のプログラミング、実行、およびチェックを可能にする CRS ソフトウェアをインストールします。
  2. CRSソフトウェアのインストール
    1. CRSソフトウェアをGitHubリポジトリ(@CRS/CRS_software)から直接ダウンロードします。
      メモ: このソフトウェアは徹底的にテストされており、次のオペレーティングシステムと完全に互換性があります。
      Windows 10および11の場合は、@Trincatalyst/CRS/Software/bin/Circadian-Rave-System-v1.2-win.zipをダウンロードします。
      macOS Venturaの場合は、@Trincatalyst/CRS/Software/bin/Circadian-Rave-System-v1.2-win.zipをダウンロードします。
    2. ダウンロードしたCRSソフトウェアを見つけて開きます。これによりインストールが開始され、完了すると使用できるようになります。
      メモ: ソフトウェアの場所をよりアクセスしやすいフォルダに変更することをお勧めします。
  3. CRSデバイスへの接続
    1. CRS の電源を入れます。
    2. Future Technology Devices International(FTDI)ケーブルを使用して、CRSソフトウェアがプリインストールされたコンピュータにCRSデバイスを接続します。
    3. CRSソフトウェアを開き、[表示]タブの[ポートの選択]ドロップダウンメニューをクリックしてCRSを選択すると、接続時に6つのLEDテーブルがすべて更新されます。実験が実行されている場合は、各プロファイルがそれに応じて更新されます。これで、各CRS LEDをプログラムする準備が整いました。
  4. CRSのプログラミング
    注: CRS は概日実験を念頭に置いて設計されており、可能な限り多くの関連機能が追加されています。たとえば、典型的な複雑な実験では、数日間にわたる光の同調、その後数日間暗く、さらに再同調する必要がある場合があります。
    1. 実験の前に、CRSで実験を完全にプログラムします。LEDタブ1〜6を使用して、6つの出力チャネルのそれぞれでそれぞれLED/LEDストリップを個別にプログラムします(図1B)。各 LED タブ内でプログラムされた照明体制をグラフィカルに表現し、プログラミング中の参照として使用します。
    2. 照明体制は 3 つの異なるステップに分割されており、それぞれに光の強度と持続時間を設定できます。ステップ1と3はサイクルを行い、異なるLEDチャンネル間の同期ステップとして機能し、異なる時間にサンプルをLEDエンクロージャにロードできるようにします。通常、24時間にまたがるようにプログラムされているサイクリングトグルを使用して、手順2を繰り返します。
    3. T1、T2、T3、T4 の光の強度と持続時間を切り替えることで、複雑な光の領域が作成されます。T1 と T3 は中間体として機能し、光の強度の増減を可能にし、自然の日と光のサイクルをより厳密に模倣します。プログラムを設定したら、保存して実行します。
      注:プログラムされたライトレジームが実行されている場合、グラフィカルレジームはそれに応じて更新され、[ 表示 ]タブが更新されます。
  5. 軽量プロファイルの保管と積み込み
    1. 実験間で繰り返される光領域の場合は、[ 保存] ボタンを使用してプロファイルを保存すると、プロファイルがCRSで読み取り可能なtxtファイルに変換されます。
    2. [ ロード] ボタンを使用して、以前に保存したプロファイルをCRSにロードし、今後のプログラミングを迅速化します。
  6. プロファイルのロードと実行
    1. テストのために、各 LED ストリップのテスター プロファイルを同時に実行します。 LED タブに移動し、 ロードプロファイルをクリックして、 CRS_test_profile.txtをクリックします。
    2. [ プログラム(Program )] をクリックして、プロファイルを CRS にアップロードします。グラフは、プロファイル統計とともに更新されます。
    3. [開始] をクリックすると、グラフが実行の進行状況に合わせてライブで更新されます。6つのLEDプロファイルすべてに対してこれを繰り返します。
  7. CRSハードウェアからの切断
    1. [表示] タブにある [切断] ボタンを使用して切断します。次に、FTRI リード線を安全に取り外します。
  8. 実験の進行状況を確認する
    1. CRS の実行中にライトレジームのステータスを確認するには、CRS ソフトウェアを開き、[ 表示 ] タブで [ ポートの選択 ] ドロップダウン メニューをクリックして、CRS を選択します。[表示] タブには、6 つの LED タブすべての現在の情報が表示されます。前述のように切断します。

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結果

CRS の概要
CRSはハードウェアとソフトウェアの組み合わせであり、ユーザーはデバイスごとに最大6つの独立したLEDストリップの複雑な照明体制をプログラムできます(図1A)。ソフトウェアはGitHubリポジトリ(@Trincatalyst/CRS/Software)から簡単にダウンロードでき、ソフトウェアのメインページには、さらに詳細な使用手順があります(図1B)。ハードウェアは手頃な価格で誰でも簡単に構築できるように設計されており、電子機器の事前知識は必要ありません(図1C)。コンポーネントは優先サプライヤーから調達できますが、テストと使用に成功したソースをリストしました (材料表)。市販で購入できない唯一のコンポーネントはマイクロコントローラーとオプションの LED PCB ですが、どちらも商用 PCB 製造サービスで製造できます。ガーバーファイルは、GitHubリポジトリ(@Tr...

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ディスカッション

光が生理機能や挙動にどのように影響するかを調べるには、複雑な照明スケジュールが必要であり、通常は複数の条件を並行して実行する必要があります。光への曝露のタイミングと強度を正確に制御することも、これらの概日実験における信頼性と再現性のあるデータの鍵となります。ライトサイクリングは、市販のインキュベーターまたは機械式タイマープラグにリンクされたLEDで実現できます。ただし、これらのシステムは、複雑な光のサイクルパラメータをプログラムする機能が限られているか、まったく提供されておらず、多くの場合、ユーザーは手動で設定を変更する必要があります。CRSは、ショウジョウバエやゼブラフィッシュ(Danio rerio)などのモデル生物の光の同調を可能にするシンプルで低コストのソリューションです。現在、いくつかのシステムが存在するが、それぞれに使用上の利点と欠点がある。例えば、1つのシステムは、広範囲の光波長を制御する機能を提供するが、デバイス17あたりのチャンネル数は限られている。光のサイクルを同時に...

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開示事項

著者は開示するものは何もありません

謝辞

DAMシステムとセットアップガイダンスの使用について、Edgar Buhl博士とJames Hodge教授に感謝します。また、CRSの開発におけるポール・マーティン教授の支援と指導にも感謝したいと思います。この研究は、ポール・マーティン教授に授与されたBBSRC助成金BB / T001984 / 1によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.1 & マイクロ;Fセラミックコンデンサファーネル 2507749数量 = 2
100k&オメガ;軸方向THT抵抗器 250 mWファーネル 3951804数量 = 6
100 & オメガ;軸方向THT抵抗器 250 mWファーネル 3496799数量 = 6
1 & マイクロ;Fセラミックコンデンサファーネル 2819603数量 = 2
2.54 mmピッチスルーホールヘッダ水平マウント - FTDI ファーネル 3756363数量 = 6
Arduinoヘッダ10ウェイファーネル 1593417数量 = 1
Arduinoヘッダ3ウェイファーネル 1593412数量 = 1
Arduinoヘッダ8ウェイファーネル 1593416数量 = 1
Arduino ウノR3Arduino A000066数量 = 1
バレルジャックファーネル 224959数量 = 1
サーカディアンレイブシステムPCBマーティンラボマーティンラボ1 (120 ストリップまたは LED PCB 付き LED コンポーネント 1 個)
ダイオード ファーネル 4245041数量 = 1
eFuse回路保護ファーネル 4178928数量 = 1
FTDIケーブルファーネル 2419945数量 = 1
LEDRS 855-5933120 ストリップまたは LED PCB 付き 1 個の LED コンポーネント
電源 15Wファーネル 2815857数量 = 1
ネジ端子 ファーネル 2314973数量 = 6
ST Microelectronics NチャネルMOSFET STP30NF10ファーネル 9946403数量 = 6

参考文献

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