ここでは、複数の複雑な光領域を管理するためのArduinoベースの発光ダイオード(LED)コントローラーであるCircadian Raveシステムを構築、プログラミング、および実行するためのプロトコルについて説明します。
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方法論記事
ここでは、複数の複雑な光領域を管理するためのArduinoベースの発光ダイオード(LED)コントローラーであるCircadian Raveシステムを構築、プログラミング、および実行するためのプロトコルについて説明します。
照明の正確な制御は、すべての生物科学に幅広く応用されていますが、概日研究ほど応用できるものはありません。地球上の生命は、24時間太陽日を同調する生理学と行動の内因性調節因子である概日時計を進化させてきました。時計を研究するために、研究者らは概日リズムを同調させるために光または温度の実験的操作に依存しています。現在、ほとんどの研究室では、市販の照明器具または社内で製造された照明器具を使用して、昼と夜の自然なサイクルを模倣したり、中断したりしています。これらのシステムは、プログラマビリティと精度が限られており、標準化が欠けており、場合によっては手頃な価格です。これらの問題に対処するために、複数の独立したライトボックスを正確に制御できる特注のソフトウェアおよびハードウェア パッケージである Circadian Rave System を開発しました。このシステムを使用して将来の研究を標準化できるように、詳細なハードウェアビルドガイドとともにソフトウェアをオープンソース化しました。このシステムの機能と概日実験におけるその有用性を実証するために、さまざまな光パラダイムで ショウジョウバエ の寿命と活動を測定し、光操作による概日同期と混乱を示しました。結論として、当社は、電子工学やプログラミングに関する最小限の予備知識があれば、研究者なら誰でも社内で構築できる、標準化され、スケーラブルで手頃な価格の照明システムを開発しました。
光の正確な制御は、動物が関与するほとんどすべての実験において重要です。このような動物の実験室での飼育のために、複雑な明暗サイクルレジームをプログラミングするための能力が限られている市販のインキュベーターを購入できます。複雑な照明体制をプログラムする能力は、多くの研究分野で必要ですが、概日研究では重要です。太陽日に同調する概日時計は、昆虫から哺乳類への生理機能と行動の変化を調節する内因性振動子です1。このように、概日研究は、発達2、免疫3、ヒト疾患病理学4など、生物学研究の多くの分野に浸透し始めています。概日時計の研究は、タイミング、強度、およびサイクルの正確な制御を通じて時計を操作したり、さらには混乱させたりするために、光または温度を使用することに大きく依存しています5,6。現在、概日実験で使用するために、これらの変数を制御するための、手頃な価格でスケーラブルで標準化されたシステムが必要です。
内因性概日時計の操作に加えて、特定の波長の光を使用して導入遺伝子の発現を制御するさまざまな光遺伝学的ツールが開発されています in vivoおよびin vitro。たとえば、ショウジョウバエの計り知れない遺伝的扱いやすさ ショウジョウバエ 研究者が利用できる多くの光遺伝学的ツールが生まれました。たとえば、Gal4転写因子の光感受性shineGal4変異体は、ブルーライトにさらされると活性化され、多くの研究室で日常的に使用されるツールです7,8,9。研究者は、手動でライトをオンにするか、レーザー誘導を介して光の変化を達成する傾向がありますが、どちらの方法でも、実験設計と実装中にロジスティクス的および技術的な制約が生じる可能性があります。光の開始、停止、特定の波長、サイクル、および強度(線量)をプログラムする機能は非常に有益です。
研究者が照明条件を完全に制御できるように、サーカディアン レイブ システム (CRS) を設計しました。これは、研究者が構築および適応できる代替の手頃な価格の日曜大工 (DIY) システムであり、照明体制を完全にカスタマイズできます。このシステムは、最大 6 つの独立した LED チャネルを制御できる Arduino マイクロコントローラーに依存しているため、システムは手頃な価格でスケーラブルです。Arduinoなどのマイクロコントローラは、その使いやすさのために、多くのDIY実験装置の製造に成功しています10、11、12。このシステムは既存のインキュベーターで使用でき、一般的な実験温度でのテストに成功しており、幅広い機能(4-37°C)を提供します。ユーザーは、複数のオペレーティングシステム用に開発された特注のオープンソースソフトウェアを介してCRSをプログラムできます。このソフトウェアには使いやすいユーザーインターフェイスがあり、複雑な光体制をプログラミングして太陽光のパターンをより厳密に模倣できます。これらのカスタム光レジームを作成して保存し、後でマイクロコントローラにロードできるため、以前に生成された一連の光レジームを使用できるため、実験セットアップの時間を節約できます。一度プログラムされたデバイスは、コンピューターから切断できるため、照明体制を実行するために専用コンピューターを必要とする従来のシステムと比較して拡張性が可能になります。CRSの信頼性をテストするために、CRSが生成したさまざまな光体制にさらされた ショウジョウバエ の寿命と活性分析を実施しました。CRSは、複数の照明体制を数か月間連続して確実に実行することがわかりました。
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1. CRSの構築
注: CRS は研究者によって社内で構築されるように設計されているため、すべてのコンポーネントは複数のベンダーから市販されています (材料表)。例外は、PCB印刷の専門家によって、または著者に連絡することによって商業的に製造されなければならないプリント回路基板(PCB)です。商用本番環境の場合、ガーバーファイルはGitHubリポジトリ(@Trincatalyst/CRS/Hardware/gerber/microcontroller_PCB)にあります。大学の工学部には通常、PCB 印刷施設があります。以下は、単一のCRSユニットの構築、品質チェック、およびプログラミングの方法に関する詳細な手順です。
2. 実験の実行
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CRS の概要
CRSはハードウェアとソフトウェアの組み合わせであり、ユーザーはデバイスごとに最大6つの独立したLEDストリップの複雑な照明体制をプログラムできます(図1A)。ソフトウェアはGitHubリポジトリ(@Trincatalyst/CRS/Software)から簡単にダウンロードでき、ソフトウェアのメインページには、さらに詳細な使用手順があります(図1B)。ハードウェアは手頃な価格で誰でも簡単に構築できるように設計されており、電子機器の事前知識は必要ありません(図1C)。コンポーネントは優先サプライヤーから調達できますが、テストと使用に成功したソースをリストしました (材料表)。市販で購入できない唯一のコンポーネントはマイクロコントローラーとオプションの LED PCB ですが、どちらも商用 PCB 製造サービスで製造できます。ガーバーファイルは、GitHubリポジトリ(@Tr...
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光が生理機能や挙動にどのように影響するかを調べるには、複雑な照明スケジュールが必要であり、通常は複数の条件を並行して実行する必要があります。光への曝露のタイミングと強度を正確に制御することも、これらの概日実験における信頼性と再現性のあるデータの鍵となります。ライトサイクリングは、市販のインキュベーターまたは機械式タイマープラグにリンクされたLEDで実現できます。ただし、これらのシステムは、複雑な光のサイクルパラメータをプログラムする機能が限られているか、まったく提供されておらず、多くの場合、ユーザーは手動で設定を変更する必要があります。CRSは、ショウジョウバエやゼブラフィッシュ(Danio rerio)などのモデル生物の光の同調を可能にするシンプルで低コストのソリューションです。現在、いくつかのシステムが存在するが、それぞれに使用上の利点と欠点がある。例えば、1つのシステムは、広範囲の光波長を制御する機能を提供するが、デバイス17あたりのチャンネル数は限られている。光のサイクルを同時に...
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著者は開示するものは何もありません
DAMシステムとセットアップガイダンスの使用について、Edgar Buhl博士とJames Hodge教授に感謝します。また、CRSの開発におけるポール・マーティン教授の支援と指導にも感謝したいと思います。この研究は、ポール・マーティン教授に授与されたBBSRC助成金BB / T001984 / 1によって支援されました。
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| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.1 & マイクロ;Fセラミックコンデンサ | ファーネル | 2507749 | 数量 = 2 |
| 100k&オメガ;軸方向THT抵抗器 250 mW | ファーネル | 3951804 | 数量 = 6 |
| 100 & オメガ;軸方向THT抵抗器 250 mW | ファーネル | 3496799 | 数量 = 6 |
| 1 & マイクロ;Fセラミックコンデンサ | ファーネル | 2819603 | 数量 = 2 |
| 2.54 mmピッチスルーホールヘッダ水平マウント - FTDI | ファーネル | 3756363 | 数量 = 6 |
| Arduinoヘッダ10ウェイ | ファーネル | 1593417 | 数量 = 1 |
| Arduinoヘッダ3ウェイ | ファーネル | 1593412 | 数量 = 1 |
| Arduinoヘッダ8ウェイ | ファーネル | 1593416 | 数量 = 1 |
| Arduino ウノR3 | Arduino | A000066 | 数量 = 1 |
| バレルジャック | ファーネル | 224959 | 数量 = 1 |
| サーカディアンレイブシステムPCB | マーティンラボ | マーティンラボ | 1 (120 ストリップまたは LED PCB 付き LED コンポーネント 1 個) |
| ダイオード | ファーネル | 4245041 | 数量 = 1 |
| eFuse回路保護 | ファーネル | 4178928 | 数量 = 1 |
| FTDIケーブル | ファーネル | 2419945 | 数量 = 1 |
| LED | RS | 855-5933 | 120 ストリップまたは LED PCB 付き 1 個の LED コンポーネント |
| 電源 15W | ファーネル | 2815857 | 数量 = 1 |
| ネジ端子 | ファーネル | 2314973 | 数量 = 6 |
| ST Microelectronics NチャネルMOSFET STP30NF10 | ファーネル | 9946403 | 数量 = 6 |
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