げっ歯類の脳微小血管系の超解像マッピングのための超音波局在顕微鏡

サマリー

超音波局在顕微鏡 (ULM) は、最近開発された技術であり、 in vivo で微小血管系をイメージングする際に前例のないレベルの解像度を可能にします。この研究では、前臨床研究用に設計された標準化された機能的超音波イメージングプラットフォームを使用して、げっ歯類の脳微小血管系の超解像画像を取得する方法を詳細に説明します。

要約

超音波局在顕微鏡(ULM)は、従来の超音波の回折限界を超える脳の微小血管構造を in vivo で視覚化できる超解像イメージング技術です。ULMは、静脈内注入されたマイクロバブルが脳血管内を循環するときに検出および追跡することにより、血管密度、流速、および後方散乱信号振幅の高解像度マップを5〜10μmまでの空間スケールで生成します。このプロトコルは、専用の機能的超音波プラットフォームを使用して、動物の準備、プローブの位置決め、画像取得、マイクロバブル注入、データ処理など、げっ歯類でULMイメージングを実行するための完全なワークフローを提供します。マウス(経頭蓋)とラット(頭蓋窓付き)に適応した2つの調製方法が説明され、続いて、統合された脳アトラスを使用したプローブアライメントと解剖学的ターゲティングの詳細な指示が続きます。取得中、超高速超音波シーケンスはマイクロバブルのボーラス注入と同期され、動的フローデータをキャプチャします。その後の再構成ステップには、クラッター フィルタリング、画像補間、マイクロバブル検出、サブピクセル位置特定、および軌道追跡が含まれます。出力には、船舶の占有率を反映する密度マップ、流れのパターンと方向性を明らかにする速度マップ、構造解釈のための追加のコントラストを提供する振幅マップが含まれます。代表的な結果は、完全なコロナ面での取得の成功を示しており、注射品質の低下、モーションアーティファクト、頭蓋骨誘発収差などの一般的な落とし穴を強調しています。このプロトコルは、横断研究と縦断研究の両方と互換性があり、老化、脳卒中、動脈瘤、および神経変性疾患のモデルにおける脳血管の変化の調査に特に適しています。ULM は、深さ浸透、高い時空間分解能、ラベルフリーの血管イメージングを組み合わせることで、前臨床モデルにおける非侵襲的な脳微小循環分析のための強力なツールを提供します。

概要

脳は体の質量のわずか2%を占めていますが、ニューロンの活動を維持するために酸素とブドウ糖の約20%を消費します¹。この高い代謝需要は、大きな動脈や静脈から細動脈、細静脈、毛細血管などの微小血管に至るまで、神経血管結合によって調節される複雑な血管網によって満たされます²。この細かく調整されたプロセスの中断は、広範囲の神経障害に関係しています。たとえば、神経血管の脱共役は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)などの疾患の初期の病理学的特徴であり、多くの場合、アミロイドベータやタウの病理などの神経変性の古典的な特徴に先行します3,4,5,6。したがって、生体内での脳の複雑な性質を画像化することは、生理学的プロセスを理解する必要性の高まりに対処するための主要な関心事となっています。技術の進歩により、脳の機能と活動を直接的および間接的に調査する独自の機能が提供され、精度、解像度、アクセシビリティが向上しました。

ドップラー超音波は、血流を使用して脳活動を機能的に測定するための強力なツールとして登場しました⁷。特に、赤血球(RBC)の動きを検出するように設計されたパワードップラーイメージングは、繰り返しの超音波パルスを血管に送信し、移動する赤血球によって後方散乱された超音波エコーの振幅^{を記録します8}。超高速超音波イメージング、特に機能的超音波 (fUS) の出現は、これまでの限界を克服する上で極めて重要なポイントとなりました。実際、従来の超音波は組織をラインごとにスキャンしますが、脳の微小血管系に典型的な遅い血流は検出できないため、その適用を主要な大脳動脈に限定する逐次アプローチ^です9。より最近のfUS技術は、複数の平面波伝送を使用して毎秒数千フレームを取得し、時間分解能と信号対雑音比(SNR)の両方を劇的に向上させます。重要なことに、fUS は 1 mm/s という低い速度で非常に小さな血管の血行動態の変化を検出でき、細動脈レベルまでの脳活動のリアルタイム機能イメージングをサポートします⁸。

超高速ドップラー法は微小血管イメージングを大幅に改善しましたが、依然として超音波の回折限界分解能によって制約されています¹⁰。fUS と並行して、超音波局在顕微鏡 (ULM) はこの障害を突破し、造影剤と高精度の局在化アルゴリズムを活用して毛細血管レベルでの微小血管構造の視覚化を可能にします¹¹。これにより、血管の形態と機能について前例のない洞察が得られます。より具体的には、ULMでは、直径約1〜3μmの安定化されたガス充填マイクロバブルで作られた造影剤が血流に注入されます。これらは、個々の点源として検出できる強力な音響散乱体として機能します。マイクロバブルは超音波波長よりも大幅に小さいため、空間的および時間的に分離され、システムの点拡散関数 (PSF) として現れます。STORMやPALMなどの光学超解像技術に触発されて、これらのマイクロバブルのサブピクセル局在化は、高精度でそれらの位置をマッピングするデコンボリューション法を使用して達成されます10,12,13,14。これにより、血管構造を5〜10μmの空間分解能で分解することができ、従来の超高速超音波パワードップラーイメージングの回折による限界をはるかに超えています。

ULMは、毛細血管スケールまでの血管マッピングのための強力で効果的なツールであり、表層に限定された多くの光学的方法の限界を克服します。生きた動物で微小血管イメージングを実行できるため、縦断的および薬理学的研究が可能になることも、脳の固定と染色を必要とする他の技術に対する ULM の重要な利点です。抽出された情報は静的な血管マップを超えて広がり、毛細血管レベルまでの血流の定量的推定値を提供するため、前臨床および臨床応用の両方に有望な道が開かれます。再現性を促進するために、前臨床研究用に設計された標準化された機能的超音波イメージングプラットフォームを使用して実装された、げっ歯類におけるULMベースの脳イメージングの完全なワークフローについて説明します。

プロトコル

この研究で説明されているすべての手順は、2010 年 9 月 22 日の欧州共同体理事会指令 (010/63/UE) に準拠して実施され、地元の倫理委員会によって承認されました (Comité d'éthique en matière d'expérimentation animale number 59, 'Paris Centre et Sud', project #2020-16)。実験は、市販の成体雄C57BL / 6 Rjマウス(生後2か月、20〜30 g)およびSprague-Dawley Rj:Hanラット(200〜300 g)で実施されました。動物は、12時間の明暗サイクルの下でケージごとに4匹のグループで収容され、22°Cの一定温度で、自由に食物と水が提供されました。実験の開始前に、すべての動物は飼育条件に最低1週間の順応期間を経ました。使用する試薬と機器は、材料表に記載されています。

1.動物の準備

1. マウスにおける麻酔と動物調製
   1. マウスをイソフルラン誘導チャンバーに入れ、空気(0.075 L / min)と酸素(0.175 L / min、または医療用空気)で2%イソフルランを投与します。
   2. 麻酔導入の5分間後、動物を定位固定フレームに移し、体温を維持するために37°Cに設定された加熱パッドの上に置き、同じ濃度と流量でマスク を介して イソフルランを連続的に送達します。
   3. しっかりとしたが損傷のない圧力を使用して、つま先や尻尾のつまみに反応した反射がないかどうかを確認し、適切な麻酔深度を確認します。反射がある場合は、イソフルラン濃度をわずかに上げます。続行する前に再評価してください。
   4. 白内障の形成を防ぐために眼軟膏を塗ります。
   5. トリマーを使用してマウスの頭を剃ります。脱毛クリームを塗り、1〜1.5分間放置してから、ぬるま湯ですすぎ、ガーゼで乾かします。すべての毛が取り除かれるまで、必要に応じて繰り返します。脱毛クリームは皮膚に化学的損傷を与える可能性があるため、長時間放置しないでください。
   6. 遠心分離した超音波ゲル(気泡なし、脱気)をヘッドに塗布して、音響結合を確保します。
2. ラットにおける麻酔と動物調製
   1. ラットの体重を量った後、1 mLの注射器を使用して、ケタミン(75 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)の混合物を腹腔内注射します。頭のてっぺんの毛皮を剃り、ヨウ素溶液で皮膚をきれいにします。
      注: ケタミンは多くの国で高度に規制されている物質であり、調達と使用には特別な許可が必要な場合があります。代替麻酔レジメンを使用して、外科的レベルの麻酔を実現できます。
   2. 体温を維持するために37°Cに設定された加熱パッドの上に置かれた定位固定装置に動物を配置します。乾燥や白内障の形成を防ぐために、目にたっぷりの点眼用軟膏を塗ります。
   3. 術中鎮痛のために 1 mL 注射器を使用してメロキシカム (2 mg/kg) を皮下注射します。
   4. しっかりとしたが損傷のない圧力を使用して、つま先のつまみや尻尾のつまみに反応した反射がないかどうかを確認し、適切な麻酔深度を確認します。反射がある場合は、最初の麻酔薬用量の4分の1に等しい追加用量を投与します。麻酔の深さを再評価する前に、約 5 分待ちます。麻酔の外科面が確認された後にのみ続行し、20〜30分ごとに再評価します。
   5. メスを使用して矢状縫合糸に沿って縦方向の切開を行い、頭蓋骨に付着した皮膚と結合組織を含むのに十分な深さの切り口が切れていることを確認します。
   6. 生理食塩水を使用して、手術中は周囲の組織を十分に水分補給してください。
   7. ロータリードリルを使用して、頭蓋骨の表層に印を付けて頭蓋窓の輪郭を軽くなぞります。脳への最適なアクセスのために、窓は頭蓋骨のサイズに応じて、横方向で約14 mm、前後方向で少なくとも2 mmである必要があります。
   8. 骨の抵抗がなくなるまで、アウトラインに沿ってフライス加工を続けます。穴あけ中は、定期的に生理食塩水を数滴垂らして骨を冷却し、熱損傷を最小限に抑えます。細い丸いエッジのヘラは、力を入れずに隙間に簡単に挿入する必要があります。
   9. 短い一方向のリーマストロークを使用して、抵抗がほとんど感じられないまで骨の最後の層を薄くします。
   10. 頭蓋窓の外側の端に、丸みを帯びたエッジを持つ細くてわずかに湾曲したスパチュラを挿入します。
   11. へらをゆっくりと中央に向かって動かし、髄膜から骨をそっと引き離します。抵抗が感じられなくなったら、剥がれた骨片を持ち上げて完全に取り除きます。
   12. 遠心分離した超音波ゲルを硬膜の上に塗布します。実験セットアップの説明を 図1に示します。

図1:げっ歯類におけるULM脳イメージングの実験セットアップの概略図。 イメージングシステムは、電動位置決めステージに取り付けられた高周波プローブに接続された超音波取得ユニットで構成されています。マウスとラットの両方が定位固定フレームで示されています:マウスは経頭蓋イメージングのために頭皮を剃ったのが特徴で、ラットは外科的に準備された頭蓋窓を通してイメージングを受けます。両方の種に造影剤注射のために尾静脈カテーテルが留置されます。このセットアップにより、マイクロバブル注入中に高解像度の機能超音波データを安定して取得できます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. 尾静脈カテーテル法
   1. 27 G × 1/2 インチの翼付き輸液セットを 18 G × 1/2 インチの針と 8 インチのチューブに接続して使用します。可能であれば、デッドボリュームを最小限に抑えるためにチューブを短くします。
   2. 動物の尾をそっと90度回転させて、尾の外側静脈を露出させます( 図2を参照)。テープを使用してテールを所定の位置に固定し、安定性を確保し、カテーテル挿入中の不必要な動きを防ぎます。
   3. 尾静脈は、遠位端(尾の先端)から始めて基部に向かって移動することによって識別されます。このステップを容易にするために、尾をぬるま湯で温めて血管拡張を促進し、静脈の視認性を高めることができます。
   4. 指を使って尾の付け根に穏やかな圧力を加え、注射部位に向かってスライドさせます(つまり、血流の方向に逆らって)。この操作により静脈還流が一時的に妨げられ、尾静脈が拡張してより目立つようになり、カテーテルの挿入が容易になります。
   5. 翼付き輸液セットの 27 G × 1/2 インチ針を静脈と平行に挿入し、ベベルが上を向くようにします。
   6. チューブに血液フラッシュバックがないか観察し、針の正しい配置を確認します。
      注:その後の注射中に以前の穿刺による漏れを避けるために、遠位尾端からカテーテル挿入を開始します。尾静脈カテーテル法が困難または失敗することが判明した場合は、代替の中央ルートを検討できます。これらには、眼窩後洞、頸静脈、または伏在静脈が含まれます。

図2:カテーテル挿入のための血管ランドマークを示すげっ歯類の尾の断面解剖学的構造。 主要な血管の相対位置を示す、遠位げっ歯類の尾を通る横断面の概略図。正中線の近くには、上部(背側)領域に位置する背側尾動脈と、尾部断面の下部(腹側)に位置する腹側尾動脈の2つの動脈が存在します。これらの動脈は通常、静脈内処置中に避けられます。動脈の横方向に隣接するのは尾静脈で、両側を対称的に走り、皮膚のすぐ下にあるため、カテーテル挿入やマイクロバブル注射に適したアクセス部位となっています。この解剖学的概要は、特に血管拡張を促進するために加温によって強化された場合に、静脈の正確な位置特定に役立ちます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. IcoScanソフトウェアを使用したプローブの位置決め
   1. 取得プラットフォームで、fUS取得ソフトウェア(例:IcoScan for Iconeus One)を起動し、実験セッションを作成します。超音波プローブの位置を調整します。
      注意: プローブを動物の頭から約1mm上に配置します。イメージングシーケンスを開始する前に、プローブが超音波ゲルに接触していることを確認してください。
   2. ライブビュー取得を開始し、リアルタイム脳血液量(CBV)イメージングを使用して必要に応じてプローブ位置を調整します。脳はイメージを中心にする必要があります。コントラストや圧縮などのイメージングパラメータを最適化して、視覚化の品質を向上させます。
   3. 集録ソフトウェアで Angio3D メニューを開きます。スキャンパラメータ(最初のスライス、最後のスライス、ステップサイズ)を調整し、脳全体をカバーするようにします。取得を開始します。
      注:スキャンパラメータを設定するときは、スキャンが脳の後部、つまり後動脈全体をカバーしていることを確認してください。
   4. 取得ソフトウェアを開いたままにして、データ解析と視覚化のために IcoStudio ソフトウェアを起動します。 Angio3D スキャンをロードします。
   5. Brain Registrationパネルに移動し、完全自動または手動の登録モードを使用して、スキャンをAllen Mouse Common Coordinate Frameworkに登録します。
   6. 登録を .bps ファイルとして保存します。
   7. 次に、 Brain Navigation メニューに移動します。 [アトラス マネージャー ] パネルで、[ 親/子ツリー] ナビゲーター を使用して、Allen Mouse Brain Atlas を参照します。ターゲットの解剖学的領域を選択し、3ビューパネルのスキャンに重ね合わせます。
   8. 対象領域と重なるイメージング平面を選択します。冠状ビューに2つのマーカーを手動で設定して、ターゲットのイメージングスライスを定義します。
   9. Brain Positioning System(BPS)をクリックして、選択した平面をイメージングするためのプローブ位置に対応するモーター座標を抽出します。Angio3Dスキャンから計算された画像プレビューを確認し、BPS座標のコピーをクリックします。
   10. IcoScanソフトウェアに切り替えて、プローブ位置決めパネルを開きます。[BPS 座標の入力] をクリックし、手順 1.4.9 で抽出した値を貼り付けます。プローブは自動的に移動し、選択したイメージングプレーンに位置合わせします。
   11. ライブビュー取得を実行して、現在のイメージングプレーンがステップ1.4.8で予測されたプレーンと一致することを確認します。
       注:同じ空間マーカーを保存して再利用することで、セッション間でイメージング平面を一貫して再定義でき、縦断的研究のための正確なプローブ再配置が可能になります。

2. ULMの取得

1. マイクロバブルの準備
   注:市販のさまざまな超音波造影剤を使用できます。ただし、ガス組成、気泡濃度、直径、安定性は使用する製品によって異なる場合があります。準備と保管については、メーカーの推奨に従ってください。
   1. 滅菌シリンジを使用して、5 mLの0.9%塩化ナトリウム溶液をセプタムからバイアルに注入します。
      注:繰り返しのボーラス投与または持続注入の場合、少量の0.9%塩化ナトリウム溶液を使用して、より濃縮されたマイクロバブル懸濁液を調製できます。意図した用途に基づいて希釈係数を調整します。
   2. バイアルを20秒間激しく撹拌して、マイクロバブルを完全に再懸濁させ、均一な分散を実現します。
2. ULM記録
   1. 超音波シーケンス、フレームレート、合計記録時間などの記録パラメータを事前に定義します。
      注意: 記録の推奨パラメータは、2.5 Hzで5〜10分です。
   2. 注入するマイクロバブルの体積を描き、取得を開始します。取得が開始されたら、マイクロバブル注入に進みます。ラットには200 μL、マウスには100 μLを適切な希釈で注射することをお勧めします。
   3. ライブビュー画像のコントラスト強調を確認します。その直後に、生液をカテーテルに注入して、デッドボリュームに残っているマイクロバブルを洗い流します。マイクロバブル強度プロファイルの典型的な例を 図3に示します。
   4. 取得が完了するまで待って、データを保存します。
   5. 取得の最後に、使用するプロトコルに応じて、次のように進めます。
      1. マウスの場合(非侵襲的プロトコル):イソフルラン投与を中止して麻酔を逆転させ、完全に目覚めるまで暖かい環境で回復中の動物を監視します。
      2. ラットの場合(頭蓋窓を備えた侵襲的プロトコル):制度的および倫理的ガイドラインに従って、ユータソル(ペントバルビタールナトリウム、140 mg / kg)の腹腔内注射によって動物を安楽死させます。

図3:経時的なマイクロバブル信号強度。 (A)冠状脳スライス全体を含む、信号抽出に使用される関心領域(ROI)の図。(B)5分間の取得中のマイクロバブル信号強度の時間経過。マイクロバブルボーラスを30秒で注入したところ、信号振幅が特徴的に上昇しました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. IcoLabソフトウェアを使用した画像再構成

1. IcoLabを開き、画面の左端にあるULMタブをクリックしてULMに移動します。
2. [Compute ULM Maps] をクリックして、処理ワークフローを開始します (図 4 を参照)。
3. 取得したデータを含むソースフォルダを選択します。
4. 処理する特定のスキャンを選択し、必要に応じて処理時間の境界を調整します。
5. [ 次へ ] をクリックして、レポート手順に進みます。[レポート] ステップで、処理されたファイルが保存される出力フォルダー パスを設定します。PowerPoint レポートに含まれる画像の視覚化パラメーターを設定します。
6. 最終画面に表示される選択したオプションの概要を確認します。
7. 準備ができたら、[ 実行] をクリックして処理を開始します。処理が完了すると、局所的なマイクロバブルのすべての座標と、密度、速度、および後方散乱振幅(BSA)のラスタライズされたTIFFファイルを含む.trkファイルが生成されます。
   メモ:5分間の取得には、数時間の処理が必要になる場合があります。この手順は、夜間または専用のワークステーションで実行するのが最適です。
   1. マイクロバブル密度マップの生成:検出されたすべてのマイクロバブルの局所的な位置は、選択した取得時間にわたって蓄積されます。これらの位置を固定解像度の空間グリッドにマッピングします。
      注:結果の密度マップの各ピクセルは、その空間ビン内に局在するマイクロバブルの数を反映しています。最終出力は、ピクセル強度が血管占有に対応するグレースケール画像(TIFF)であり、血管ネットワークの高解像度再構成を可能にします。
   2. 速度マップの生成: ソフトウェアは、連続するフレームにわたって個々のマイクロバブルを追跡して軌道を形成します。各軌道について、ソフトウェアは変位を経過時間で割ることによって速度ベクトルを計算します(mm/s単位の速度ベクトルが得られます)。
      注:2種類の速度マップを生成できます:各ピクセルが通過するマイクロバブルの平均速度の大きさを格納する絶対速度マップと、速度が選択された解剖学的軸(つまり、xまたはz)に沿って分解され、対応する符号付き成分が格納される方向速度マップ。これらのマップは、同じ空間グリッドにラスタライズされ、個々の TIFF 画像として保存されます。
   3. BSAマップの生成:局所的なマイクロバブルごとに、生の超音波信号振幅(後方散乱強度)が表示されます。これらの振幅を空間グリッドに投影し、各ピクセルに信号強度を蓄積します。得られたBSAマップは、マイクロバブルがビームの焦点領域を通過した領域を強調表示し、密度および速度マップ¹⁵を補完するコントラストを提供します。

図4:ULMマップ再構成のための処理パイプラインのフローチャート。 この図は、生の超音波データからULMマップを生成するために分析ソフトウェアで実行される順次処理ステップを示しています。複合フレーム(n = 200)から始めて、ステップ1は特異値分解(SVD)クラッターフィルタリングを適用して、組織のバックグラウンドからマイクロバブル(MB)シグナルを分離します。ステップ2では、MB信号がランチョス補間を受け、前処理された画像スタックが生成されます。ステップ3では、局所的な最大値検出を実行し、これらをシステムの点拡散関数(PSF)と関連付けて、マイクロバブルの候補位置を特定します。ステップ4では、サブピクセルの定位(重心検出)と粒子追跡を使用してマイクロバブルの軌跡を抽出し、そこから速度と後方散乱振幅のマップを計算します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. IcoStudioソフトウェアを使用したデータの視覚化

1. IcoStudioに.trkファイルをロードして、データ探索を開始します。
2. 右側のパネルでコントラスト、圧縮、カラーマップなどの視覚化パラメーターを調整して、データ表現を絞り込みます。
3. メインビューの下部にあるダブルスライダーを使用して、開始フレームと終了フレームを定義することで、積分時間を設定します。
4. [ 密度] タブを開いてマイクロバブルの発生を表示し、[ 絶対密度 ](ピクセルあたりの数)と [方向密度 ](軸方向の重み付け)から選択します。
5. 速度タブを使用して、マイクロバブル速度を複数のモード(絶対、指向性、軸方向、および横方向)でmm/秒単位で表示します。コントラスト、圧縮率、速度のしきい値を調整して、視覚化を強化します。
6. BSAタブを調べてマイクロバブルの反射率を視覚化し、微小血管構造と面外の動きを強調する代替コントラストメカニズムを提供します。高解像度のPNGスクリーンショットをエクスポートしたり、カスタマイズ可能なピクセルサイズとデータ型設定を使用して定量分析用のTIFFファイルを生成したりできます。

結果

図5の代表的な例は、200μLのマイクロバブルボーラス注入後、10μmの分解能で1分間にわたって記録されたラット脳のULMデータの典型的な例を示しています。

図5:1回のマイクロバブル注入後に開頭したラットから得られた代表的なULM出力。 マイクロバブル(MB)密度(左)、速度(中央)、および後方散乱振幅(右)のマップの例は、マイクロバブルの200 μLボーラス注入後に1分間にわたって記録された完全な冠状脳スライスについて示されています。スケールバー:2mm。ズームインセットは、左皮質微小血管系を強調表示します(スケールバー:0.5 mm)。密度マップはMB発生の空間分布を反映し、血管網の構造を明らかにします。速度マップは、個々のMBの流速と方向性を示し、容器の種類を区別することができます。振幅マップは、MBからの後方散乱超音波信号を示し、血管の形態と面外運動の視覚化を強化する追加のコントラストメカニズムを提供します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

得られたマップは、脳微小血管系の3つの補完的なビュー、つまりマイクロバブル(MB)密度(左)、速度(中央)、および後方散乱振幅(右)を示しています。各マップは脳の完全な冠状スライスに対応し、ズームインセットは左皮質微小血管系を強調表示します(スケールバー:それぞれ2 mmと0.5 mm)。

密度マップは、視野全体の MB オカレンスの空間分布を示します。血管の形態は回折限界をはるかに下回って分解され、大きな血管と微細な毛細血管構造の両方が明らかになります。このタイプのマップにより、深部皮質領域でも、分岐や分岐パターンを含む血管ネットワークトポロジーを明確に視覚化できます。

速度マップには、軸方向(z)方向に沿って投影された個々のMBの流速が表示されます。この投影法は符号付き速度値を生成し、負の速度は皮質への上向きの流れを反映し、正の値は下向きの流れを反映します。げっ歯類の大脳皮質では、血管構造は非常にステレオタイプ化されており、貫通する細動脈は軟膜表面から皮質層に下降し、細静脈は皮質から表面に上昇して脱酸素化された血液を排出します¹⁶。この一貫した解剖学的配置により、方向速度測定を使用して血管の種類を区別することができ、通常、正の軸速度は動脈の流れを示し、負の速度は静脈ドレナージを示します。全体として、ULM で測定された速度値は、文献^10,17 で以前に報告された範囲と一致しており、貫通細動脈の 10-20 mm/s から主要な頭蓋内動脈の秒速数センチメートルの範囲です。これらの発見は、流れるマイクロバブルが赤血球のレオロジー挙動を厳密に模倣しているという以前の観察結果と一致しており¹⁸、ミクロスケールでの生理学的血流ダイナミクスを定量化するためのULMの使用を検証しています。

後方散乱振幅(BSA)マップは、各MBによって返される超音波信号強度の空間表現を提供します。MBが焦点領域を通過すると後方散乱エネルギーが最大化されるため、このマップは標高位置に基づいてコントラストを提供します。特に深さや焦点エッジ近くで、面外の動きや低振幅の血管を特定することで、セグメンテーションを改良するのに役立ちます。BSAマップは、深度関連の信号減衰を検出したり、焦点アライメント¹⁵の不一致を特定したりするのにも価値があります。

Brain Positioning Systemによる平面ターゲティングの再現性を実証するために、 図6A は、同じ冠状面を標的として、0日目(第1週)と7日目(第2週)に麻酔下で同じマウスで取得されたULM血管密度マップを示しています。両方のマップのオーバーレイは、血管信号の強い空間的対応を示しており、前に示したように、平面再配置の精度と縦断的実験の信頼性を確認します¹⁹。

定量分析は、これらの出力のいずれかに適用できます。たとえば、ユーザーは強度しきい値またはクラスタリング アルゴリズムを使用して血管をセグメント化し、血管密度、平均流速、血管半径、平均長さ、枝の数、血管ネットワークのその他の構造記述子を含む形態計測パラメーターなどの地域統計を抽出できます。皮質領域または実験群(例えば、薬物注射と対照)間の比較は、これらのマップ上で直接、または一般的に識別される血管^20,21の派生パラメトリック統計を通じて実行することができる。このような分析の例として、左体性感覚皮質(S1BF、図6B)および左視床(図6C)の血管パラメータの局所定量化を実施しました。密度マップは最初に二値化され、スケルトン化され、ユークリッド距離変換を使用して血管半径が推定されました。流速はMB軌道から直接得られ、流量は以前に詳述したようにポアズイユの法則を使用して容器半径から導き出されました²¹。その研究で説明されているのと同じ方法論がここでも適用されました。ウィスカープロットは、d0とd7の容器半径、速度、および流量の分布を示し、セッション間で良好な再現性を示しています。これらのマルチモーダル ULM 出力を組み合わせることで、脳の微小血管ネットワークの包括的な特性評価が可能になり、解剖学的および動的洞察の両方が前例のない解像度で提供されます。

図6:平面ターゲティングの縦方向の再現性と、Brain Positioning Systemを使用した血管定量化の例。 (A) 脳ポジショニング システム (スケール バー = 1 cm) を使用して同じ冠状面を標的として、0 日目 (第 1 週) および 7 日目 (第 2 週) に同じ麻酔マウスから取得された ULM 血管密度マップ。両方のマップのオーバーレイは、血管信号の強い空間的対応を示しており、セッション間での平面位置の再現性を示しています。(B、C)左体性感覚皮質 (S1BF、 B) と左視床 (C) の 2 つの関心領域から抽出された血管パラメーターの代表的な定量化。各領域について、d0 での血管密度マップ (スケールバー = 0.5 cm) と、d0 および d7 での血管半径 (μm)、流速 (mm/s)、および流量 (mm³/s) の分布を示すウィスカー プロットを表示します (中央値、25-75 パーセンタイル、ウィスカー = 1.5×IQR、外れ値は個別にプロット)。これらの結果は、ULMデータから形態計測および血行動態の指標を抽出するパイプラインの能力を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

超音波局在顕微鏡 (ULM) は、超音波イメージングにおける革新的な進歩を表しており、従来の回折限界を超えた微小血管系の超解像視覚化を可能にします。このディスカッションでは、ULM プロトコルの重要なステップに焦点を当て、潜在的な変更とトラブルシューティング戦略に対処し、この方法の限界を探り、代替イメージングモダリティと比較したその重要性を評価し、生物医学研究におけるその重要性と潜在的な応用を検討します。

ULMプロトコルの重要なステップ

ULMの実装を成功させるにはいくつかのステップが重要であり、その影響を 図7に示します。濃度と送達品質の両方がイメージング結果に直接影響するため、最も重要なステップの 1 つはマイクロバブルの投与です。空間分解能と検出可能性のバランスをとるには、最適な濃度が必要です。カテーテルの配置が不十分であったり、血管外漏出が不十分であったりすると、 図7Bに示すように、血管信号が非常に低くなり、再構成が不完全になり、血流に到達するマイクロバブルの数はまばらです。通常はキロヘルツ範囲の高フレームレートイメージングは、マイクロバブルの急速な動きを捉え、フレーム間で信頼性の高い追跡を可能にするために不可欠です。呼吸によってもたらされる動き、固定不良、麻酔不足など、取得中の不安定性は、位置特定精度を低下させる可能性があります。この例を 図7Cに示しており、取得中の過度の動きにより、密度マップがぼやけて使用できなくなります。

マイクロバブルの位置特定と追跡は、個々の気泡を検出し、サブピクセルの位置特定を実行し、サブ回折精度で軌道を再構築する高度な画像処理アルゴリズムに依存しています。適切な取得と処理を行ったとしても、頭蓋骨による収差などの解剖学的要因は依然として画質に影響を与える可能性があります。経頭蓋イメージング、特に高齢のマウスでは、頭蓋骨の肥厚により音響歪みが生じる可能性があります。これにより、 図7Dに示されているように、矢状縫合糸の下に特徴的なシャドーイングアーティファクトが発生し、マイクロバブルは検出されません。このような収差は、信号対雑音比を低下させ、適応フィルタリングまたはプローブの配置を改良することによって補正しない限り、血管構造を不明瞭にする可能性があります。

すべてのステップが正常に実行されると、 図7Aに示すように、高品質のULMマップが達成可能であり、経頭蓋アプローチによって高密度で十分に分解された血管ネットワークが再構築されます。

図7:マウスのULMイメージング品質の参照例とトラブルシューティング例。 パネル(A)は、若年成体マウスで取得された高品質の経頭蓋ULMマイクロバブル(MB)密度マップを示しており、冠状面全体にわたる血管マッピングの成功を示しています。パネル(B)は、マイクロバブルの血管外漏出または不十分な静脈アクセスによる血管信号の低下の例を示しており、その結果、MBの検出がまばらになります。パネル(C)は、過度の動物の動きの影響を受け、ぼやけて解釈不可能な密度マップを生成する取得を示しています。パネル(D)は、高齢のマウスで一般的に観察される頭蓋骨誘発性音収差を強調しており、矢状縫合糸の下のシャドーコーンとして見えますが、S/N比の低下によりMBは検出されません。これらの例は、ULM イメージングにおける一般的な実験的アーティファクトを特定して対処するための視覚的な参照として役立ちます。スケールバー:1mm。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

メソッドの限界

ULM には多くの利点があるにもかかわらず、その適用性に影響を与える固有の制限があります。面外血管バイアスは、イメージング面の外側に伸びる血管が適切に再構築されず、不完全な血管マップにつながるため、2D イメージングでは重大な問題です。この制限は、体積(3D)イメージングアプローチ²²に移行することによって軽減できますが、これにより計算の複雑さが増します。静脈内カテーテル挿入の課題も、特に小動物モデルではハードルとなり、一貫したマイクロバブル送達を達成することが技術的に厳しい場合があります。マイクロバブルの安定性も、特に長時間のイメージングセッション中に制限要因となります。マイクロバブルは循環半減期が短いため、取得期間を通じて適切なコントラストを維持するために、繰り返しのボーラス注射または持続注入プロトコルが必要になる場合があります。モーションアーティファクトは、特に覚醒している被験者にとって依然として重大な懸念事項であり、小さな不随意の動きでも超解像画像が劣化する可能性があります。最後に、ULM の深さ浸透は、超音波減衰によって本質的に制限されます。これは一般に、高周波(15 MHzなど)でのげっ歯類のイメージングには問題ありませんが、豚やヒト以外の霊長類などの大型動物ではより困難になります。このような場合、十分なイメージング深度を達成するために低周波プローブが必要になる場合がありますが、これには空間分解能が低下するという代償が伴い、ULM をより大規模な前臨床モデルに変換する際に考慮しなければならない深さと詳細の間の重要なトレードオフが強調されます。

既存の方法と比較したULMの意義

超音波局在顕微鏡 (ULM) は、特に微小血管イメージングの文脈において、従来のイメージング モダリティに比べて大きな利点を提供します。その最も注目すべき強みは、従来の超音波の回折限界を超え、二光子顕微鏡などの光学技術に匹敵する空間スケールでのサブ回折イメージングを実現できることです。ただし、これらの光学的方法とは異なり、ULMはより深い組織浸透を提供し、他の方法では非侵襲的に視覚化することが困難な脳領域へのアクセスを可能にします。

ULMは機能的なイメージング機能も提供し、血流速度、灌流ダイナミクス、血管リモデリングの定量的評価を可能にします。これらの特徴により、神経血管ネットワークの生理学的プロセスと病理学的変化の両方の調査に非常に適しています。MRI や PET と比較して、ULM は費用対効果が高く、重いインフラストラクチャを必要とせず、毒性リスクが知られている造影剤の使用を回避し、代わりに良好な安全性プロファイルを備えたガスで満たされたマイクロバブルに依存しています。

高い空間分解能と時間分解能の組み合わせにより、ULMはさまざまな研究用途に特に価値があります。これは、従来のモダリティでは不十分なことが多い微小血管構造や脳深部核を標的とした研究で特に強力です。さらに、組織の固定と染色を必要とする組織学的アプローチとは異なり、ULM は生きた動物のリアルタイム イメージングを可能にし、縦断的なデザインや薬理学的課題などの動的介入をサポートします。

ULM は、静的な血管マッピングを超えて、脳血流ダイナミクスを優れた空間的および時間的精度でキャプチャすることにより、高解像度の機能イメージングも可能にします。最近の進歩により、げっ歯類における全脳機能神経画像の実現可能性が実証され、分散した脳ネットワーク全体の毛細血管レベルでの血流の刺激誘発および自発的な活動依存性の変化が明らかになりました²。これにより、ULM は機能研究のための強力なツールとして位置づけられ、メソスケールの血行動態イメージングとニューロン活動マッピングの間のギャップを効果的に埋めます。

使いやすさ、効率、再現性に関する考慮事項

このプロトコルで説明されているULMワークフローは、さまざまな実験セットアップでの実装の容易さと再現性のために最適化されています。FDA および EMA 承認のマイクロバブルや標準的なげっ歯類麻酔手順など、市販のコンポーネントを使用することで、幅広いアクセスが保証されます。また、専用ソフトウェア(IcoLab)に処理パイプライン全体を統合することで、マイクロバブルの定位や軌道再構成、マップ生成などの複雑なステップを自動化し、ユーザビリティを大幅に向上させます。この合理化されたインターフェイスにより、カスタム コードの必要性が減り、ユーザーの介入が最小限に抑えられ、ユーザーと実験全体で一貫した結果がサポートされます。高解像度のULM処理は、特に長時間の集録やボリュームデータの場合、計算量が多くなりますが、バッチ処理ツールとGPUアクセラレーションにより、解析時間が大幅に短縮されます。このプロトコルのモジュラー設計は再現性もサポートしており、研究者は堅牢な分析フレームワークを維持しながら、取得および処理パラメータを微調整することができます。このプロトコルには、IcoScanとIcoStudioを使用したプローブの位置決めに関する専用セクションも含まれており、ユーザーはセッション間でまったく同じイメージングスライスでプローブを約100 μmの精度で確実に再配置できます。この機能は、経時的な血管の変化を追跡するために正確な空間的一貫性が不可欠な縦断的研究に特に価値があります。これらの機能は、新規ユーザーの参入障壁を総合的に下げ、探索的および縦断的イメージング研究の両方におけるULMのスケーラブルな展開をサポートします。

結論

このプロトコルは、げっ歯類の脳イメージングに超音波局在顕微鏡(ULM)を実装するための完全なワークフローを示し、前臨床研究用に最適化された標準化された取得および分析プラットフォームを使用した外科的準備、マイクロバブル投与、画像取得、および高解像度血管マッピングをカバーします。ULMは生物医学イメージングの大きな進歩を表しており、前例のない詳細で微小血管系の超解像in vivo視覚化を提供します。既存のイメージングモダリティと比較して、ULMは高い空間分解能、機能的流量定量化、アクセシビリティのユニークな組み合わせを提供し、血管発達、神経血管結合、疾患の病態生理学の研究に特に適しています。技術が成熟し続けるにつれて、ULM は前臨床研究、そして最終的には臨床神経画像アプリケーションの両方の基礎となる態勢が整っています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
動物体温計(加熱プレートと直腸プローブの組み合わせ)	物理温度	TCAT-2DF
アチパメゾール	オリオン・ファーマ、フランス	アンティセダン	5 mg/mL 注射液
C57BL/6マウス	ジャンヴィエ研究所	SC-C57J-M	C57BL/6Rjオスのマウス、生後8週
歯科用ドリル	フォアダム、アメリカ	K.1070高速回転マイクロモーターキット
除毛クリーム	ヴィシー政権	該当なし
眼軟膏	TVM、イギリス	オクライジェル
ヘアトリマー	フィメプ	ISIS GT 421 アスクラップ
IcoLab 処理ソフトウェア(v 1.2.0.0)	イコネウス、フランス	IcoLab
Iconeus One Xpand構成	イコネウス、フランス	IconeusOne Xpand
IcoPrime 15MHzプローブ	イコネウス、フランス	IcoPrime-15MHzプローブ
IcoScan取得ソフトウェア(v1.9.0)	イコネウス、フランス	IcoScan
IcoStudio解析ソフトウェア(v2.2.0)	イコネウス、フランス	IcoStudio(アイコスタジオ)
ヨウ素溶液	ミラン、フランス	該当なし
イソフルラン麻酔ステーション	フランス、エステルネ県ミネルヴ	該当なし
ケタミン	フランス、ヴィルバック	ケタミン1000	100 mg/mL 注射液
メロキシカム	ベーリンガー・インゲルハイム	メタカム	0.5 mg/mL 注射液
針	フランス、テルモ	AN*1838R1	18 G x & frac12;”8インチの針チュービング
塩水	ギルベール・フィジオドーズ研究所、薬局、フランス	該当なし
メス	DREXCOメディカル、フランス	80011
SonoVueマイクロバブル	ブラッコイメージング	SonoVue 8ul/ml
ヘラ	フランス、フィメド。	K.1070高速回転マイクロモーターキット
スプラグ・ドーリー RJ:ハン・ラット	ジャンヴィエ研究所	RN-SD-M	RjHan:SD - スプラグ・ドーリーオスラット、200-300g
立体定向フレーム	デイビッド・コップ(トゥフンガ、アメリカ)	900-WA	マウスアダプターの使用(参考文献:922)および破れない耳棒(参照:922)およびnbsp;
注射器	DREXCOメディカル、フランス	2058
超音波ジェル	DREXCOメディカル、フランス	メディ・ジェル
ウィングドインフュージョンセット	フランス、テルモ	SV*27EL
キシラジン 2%	フランス・バイエル	ロンプン	20 mg/mL 注射液