方法論記事

臍帯血前駆細胞の人工多能性幹細胞および割球様幹細胞への定義された異種フリーリプログラミング

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DOI：

10.3791/68613

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2025年8月22日

 ,  , 
1Department of Oncology, Division of Pediatric Oncology and Institute for Cell Engineering, The Johns Hopkins University School of Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、ヒト臍帯血(CB)骨髄前駆細胞の従来のヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)への異種フリー(XF)、フィーダーフリー(FF)、エピソームリプログラミングのための化学的に定義された方法の概要を示しています。これらのXF/FF CB-hiPSC(XF-hiPSC)は、増強分化と種間キメラポテンシャルを持つ割球様タンキラーゼ/PARP1阻害剤調節ナイーブ幹細胞(TIRN-SC)に効率的に戻すことができます。

要約

ヒト臍帯血(CB)骨髄前駆細胞を忠実度の高いヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)状態に再プログラミングすることは、非統合エピソームベクターと間質シグナルを使用して達成できます。これらの従来のプライミングされたCB-hiPS細胞株は、その後、機能的全能性を備えた割球様タンキラーゼ/PARP阻害剤調節ナイーブ幹細胞(TIRN-SC)状態に高効率で化学的に戻すことができます。PARP 調節 TIRN-SC は、高いエピジェネティックな可塑性、安定したエピゲノム インプリントを備えたヒト幹細胞であり、従来の系統プライミング hiPSC よりも優れた分化効力を持っています。ここでは、CD34+ CD33+ CB骨髄前駆細胞を従来のXF/FF hiPSCに効率的に間葉系間質活性化エピソームリプログラミングするために、最適化されたXF/FF法を概説します。TIRN 復帰は、XF/FF の従来の hiPSC を再現性よく増強し、系統プライミング遺伝子発現が減少した切断期のヒト胚細胞の転写、エピジェネティック、および機能的特徴を採用しました。TINNで逆転したCB由来のXF-hiPSCは、遺伝的に独立した背景の幅広いレパートリーにわたって、指向性多系統分化(血液血管系統を含む)に顕著な改善を示すことを検証しました。これらの方法は、臨床グレードのHLA定義の「ユニバーサル」ドナーTIRN-SC(UTIRN-SC)バンク用のcGMP準拠のTIRN-SCラインを生成するための最初のステップとして機能します。CD34+ CD33+ CB 前駆細胞からの分化の多様性が向上した UTIRN-SC 系統の誘導は、再生医療に大きな影響を与える可能性があります。たとえば、UTIRN-SCは、包括的な多系統の「既製」細胞療法のために、HLAが定義され、凍結保存された心臓、血管、および神経ドナー前駆細胞の組織バンクを生成できます。

概要

ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)は、個別化された細胞療法に有望な機会を提供しますが、その臨床応用は、腫瘍原性、免疫原性、表現型および機能的不均一性1などの大きな課題に直面しており、安全性、有効性、費用対効果に影響を与えています。さらに、従来のプライミングされたhiPS細胞株に由来する系統コミットメント前駆細胞は、非常に変動する系統間分化効率2で生成され、限られたin vivo生着と機能を示します。しかしながら、このような制限は、最適化されたリプログラミング方法3または代替幹細胞状態4,5を用いて克服することができる。

皮膚細胞または血液体細胞のhiPS細胞への非ウイルス性エピソーム再プログラミング効率は低い(~0.01%-2%)が6、CB前駆細胞の高度に最適化された4因子リプログラミングを達成でき、間葉系間質幹前駆細胞(MSC)活性化共培養条件で最大50%のバルク効率に達する可能性があります7。このシステムでは、CB骨髄前駆細胞の細胞リプログラミングは、可溶性および接触依存性間質シグナルによって加速されました。間質プライミング (SP) エピソーム CB 由来 hiPSC 系統は、従来の線維芽細胞由来 hiPSC よりも高い効率で血管前駆細胞 (VP) に分化しました 3,5。SP-CB-iPS細胞由来VPは、より本物の胚性VP転写同一性、老化の低下、およびDNA損傷に対する感受性を示しました3,4。SP-CB-iPS細胞由来のVPは、網膜虚血再灌流損傷した成体免疫不全マウスの硝子体への全身または直接移植後、従来のhiPS細胞由来VPよりも堅牢なin vivo生着も示しました3,4。

Zimmerlinらは、プライミングされた従来のヒト多能性幹細胞を、多系統分化能が改善されたTIRN-SC状態に移行する2段階の化学的再プログラミングシステム(「LIF-5i -> LIF-3i」)を確立しました5。分化したTIRN-SC由来の血管前駆細胞は、虚血性網膜の深部神経層への移動および再血管形成能力の向上によって示されるように、より高い機能性、より高いゲノム安定性、および優れたin vivo生着を示しました4。TIRN-SCは、種間キメラアッセイ8で高い寄与をする機能的なハイブリッド割球様状態を取得するために、プロテオゲノムリプログラミングを受けました。TIRN-SCはDNMT1発現を維持し、CpGメチル化ゲノム刷り込み領域の侵食から保護されました。興味深いことに、SP-CB-hiPSCは、代替の効率の低い方法を介して誘導されたhiPS細胞よりも効率的にTIRN-SCに戻されました5,9。

したがって、TIRN-SCは、改善された多系統分化能力と効率的なキメラ寄与を備えた代替幹細胞状態です。のさらなる最適化
定義されたcGMP準拠の培養条件でのTIRN-SCリプログラミングは、治療のための機能的で生着可能な細胞型および組織の幅広い生成を容易にします。費用対効果の高い治療用前駆細胞のニーズに対処するために、これらの方法を適用して、HLA 定義の CD34+ 造血 CB または末梢血前駆細胞を使用して、「ユニバーサル ドナー」TIRN-SC (UTIRN-SC) の cGMP グレード バンクを生成できます。HLA 定義の UTIRN-SC 由来前駆細胞は、複雑な組織の即時の多系統再生を必要とする多数の患者のニーズに応えることができます。

臨床骨髄移植 (BMT) のために開発されたパラダイムは、部分的に HLA が一致した、または国のドナー登録からの HLA-ハプロ同一造血幹細胞からの UTIRN-SC バンクの開発を導く可能性があります。米国を含む18か国の上位10のハプロタイプを合わせた予測的グローバル計算分析により、そのようなhiPS細胞「ハプロバンク」10からの平均患者カバレッジは68.4%になります。定義されたUTIRN-SCバンクは、系統にコミットされた前駆細胞を提供するだけでなく、家畜(ブタなど)内の種間胚盤胞相補システムの治療的TIRN-SCアプリケーションを全臓器生成11,12にサポートし、幅広い遺伝的多様性を持つ集団(米国など)における移植片拒絶反応を減少させるための寛容誘導造血前駆細胞の生成を含む。

TINN対応XF/FF hiPSC株を生成するためのこの修正された再プログラミングプロトコルは、将来のcGMP準拠のUTIRN-SCバンクを開発するための第一歩です。このプロトコルは、従来のXF-hiPS細胞株へのヒトCB骨髄前駆細胞の段階的な間質プライミングリプログラミングと機能検証の概要を示しています。これらのXF-hiPS細胞は、非XF法と同様の効率でTIRN-SCへの容易な復帰を示し、7、(同種遺伝子プライミングXF-hiPS細胞と比較して)整形の系統バイアス低減奇形腫を産生する能力の向上を含む、無制限の機能的多能性を達成しました4,5,9。また、TINNで逆転したXF-hiPSCが血液血管系統への改善された堅牢な直接分化を検証するプロトコルの概要も示します。

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プロトコル

すべてのリプログラミング実験は、全米科学アカデミーおよび国際幹細胞研究学会(ISSCR)が発行したガイドラインに準拠していました。hiPSC の生成については、ドナー細胞採取プロトコルとドナーのインフォームド コンセントが、ジョンズ ホプキンス大学 (JHU) の治験審査委員会 (IRB) の監督によって承認されました。すべての実験は、JHU 機関幹細胞研究監視 (ISCRO) の管轄下で実施され、インフォームド コンセントと出所評価に関する機関の基準に準拠しています。さらに、すべての動物の使用および外科的処置は、JHU Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC) によって承認されたプロトコルに従って行われました。動物処置を含むすべての実験(例: NODの皮下/筋肉内注射。奇形腫分析およびICR偽妊娠マウスへの胚盤胞移植のためのCg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl / SzJ(NOG SCID)マウス(Jackson Labs、Bar Harbor、ME))は、JHU IACUCによってレビューされ、承認されました。これらのレビューには、倫理的犠牲、人道的な住居、動物の不快感を最小限に抑えるための適切な措置に関する考慮事項が含まれていました。

1. フィーダーフリーの異種フリーhiPS細胞エピソームリプログラミング

  1. ドナー造血前駆細胞調製
    1. 凍結保存されたCD34+ 造血幹細胞/前駆細胞(例:1x106 新生児CB細胞)を分娩直後に使用するか、凍結バイアルを液体窒素貯蔵タンクに保管します。輸送中および取り扱い中に細胞が凍結状態で継続的に維持されていることを確認してください。
      注:あるいは、凍結保存されていないドナー細胞は、承認されたプロトコルを使用して、収集およびCD34濃縮の直後に利用することもできます。
    2. ウォーターバスで細胞を解凍する前に、バイオセーフティキャビネット内の滅菌済みクライオバイアルをそっと開いて、バイアル内に閉じ込められたガスを放出してから、バイアルをしっかりと閉じます。
    3. バイアルを37°Cの水浴に1〜2分間入れます。氷がほとんど残らなくなるまで、バイアルをそっと回転させます。バイアルを水浴から取り出し、完全に滅菌します(つまり、70%エタノールス プレー)。
      注:すべてのステップには適切な無菌技術が必要であり、滅菌された生物学的安全フードキャビネット内で実行されます。
    4. 細胞を空の50 mL滅菌コニカルチューブに穏やかかつゆっくりと移します。バイアルを1 mLの冷たいゼノフリー造血前駆細胞(XF-HP)増殖培地(表1)で洗浄し、細胞と穏やかに(チューブの端に沿って滴下して)結合して、DMSO凍結保護剤を希釈します。
    5. チューブをラックに30秒間立てたままにし、2 mLの冷たいXF-HP培地をゆっくりと(滴下して)加えます。培地を加えながら、細胞懸濁液を穏やかに旋回させます。このステップを2回繰り返して、4、8、4mLの冷たいXF-HP培地(総容量20mLまで)を順番に加えます。希釈した細胞を100 x g で4°Cで10分間遠心分離します。
      注:凍結保護剤溶液中および希釈ステップ中に細胞を上下にピペッティングしないでください。DMSOが少なくとも10倍に希釈されるまで、XP-HPミディアムを滴下してゆっくりと加えます。DMSO希釈は発熱反応を引き起こすため、低温培地を使用します。
    6. バイオセーフティキャビネット内で無細胞上清を吸引します。細胞ペレットをそっと取り除きます。血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞計数を行うために、2 mLのXF-HP増殖培地に再懸濁します。
    7. 解凍した細胞を超低付着細胞培養マルチウェルプレートに移します(例: 2 mLの細胞/XF-HP培地混合物を6ウェルプレートの1ウェルに移します)。
    8. 低酸素状態を模倣するために、プレートをサランラップでしっかりと包みます。プレートをインキュベーター(37°C、5%CO2、湿潤雰囲気)に移します。または、包装されていないプレートをO2 コントロール(5%O2、 5%CO2、湿った雰囲気)のインキュベーターに入れます。
    9. 造血前駆細胞をXF-HP培地で3日間培養します。
  2. 間葉系幹前駆細胞(MSC)の調製
    1. 凍結保存したアリコートを37°Cのウォーターバスで1〜2分間インキュベートすることにより、低継代(p2〜p3)ヒトMSCのアリコート(0.75〜1x10、6 細胞)を解凍します。氷がほとんど残らなくなるまで、バイアルをそっと回転させます。バイアルをウォーターバスから取り出し、完全に滅菌します(つまり、70%エタノール)。
      注:低継代(p2)ヒトMSCは、確立されたプロトコルを使用してヒト骨髄から購入または調製でき、凍結保存されます。MSCは約7〜10日前に解凍し、核放射の前日にフィーダー層として照射/プレーティングすることができます(図1)。
    2. バイオセーフティキャビネット内の低温異種フリー血清無間葉系幹細胞(XF-MSC)培地(表1)を含む15 mL円錐形チューブに細胞を穏やかかつゆっくりと(チューブの端に沿って滴下)移し、DMSO凍結保護剤を少なくとも10倍に希釈します(たとえば、 1 mLの凍結保存細胞アリコートを9 mL XF-MSC培地に移します)。
    3. 1 mLまたは2 mLの冷たいXF-MSC培地を使用してチューブをすすぎ、コニカルチューブに混ぜ合わせます。希釈した細胞を100 x g で4°Cで5分間遠心分離します。
    4. バイオセーフティキャビネット内で無細胞上清を吸引します。血球計算盤または自動細胞計数器を使用して細胞計数を行うために、細胞ペレットを1 mLのXF-MSC培地に穏やかに再懸濁します。
    5. 解凍した細胞を組織処理した細胞培養マルチウェルプレート(例えば、 5,000〜6,000細胞/cm2 、または6ウェルプレートの1ウェルで約50,000細胞)に移します。プレートをインキュベーター(37°C、5%CO2、湿気)に入れます。バイオセーフティキャビネット内でXF-MSC培地を2〜3日ごとにリフレッシュします。
    6. 核受化の前日に、バイオセーフティキャビネットで無細胞上清を吸引します。MSCをPBS(2 mL /ウェル)で1回洗浄します。PBSを吸引します。1 mL/ウェルの細胞解離試薬(例:1X Trypsin-EDTA溶液)を加えます。CO2インキュベーターで37°Cで5分間インキュベートします。
    7. 1 mLのXF-MSC培地(少なくとも2倍希釈)を添加して解離試薬を中和し、ピペットで単一細胞懸濁液に穏やかに粉砕します。細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに集めます。100 x g で 5 分間遠心分離します。
    8. 上清を吸引します。細胞ペレットを1 mLのXF-MSC培地に再懸濁し、血球計算盤または自動細胞カウンターを使用して細胞計数を行います。
    9. g線またはX線照射器を使用して、間葉系前駆細胞を5継代で照射し、XF-MSC培地中のArg-Gly-Asp(RGD)ペプチドでコーティングされた合成表面6ウェルプレート(2x10、ウェルあたり5 細胞)にプレートします。プレートをインキュベーター(37°C、5%CO2、湿気の多い雰囲気)で一晩保管します。
  3. ゼノフリーのエピソーム再プログラミング
    1. XF-HP増殖培地中の3日齢のCB HP培養物を、バイオセーフティキャビネット内の15 mLコニカルチューブに集めます。200 x g で 5 分間遠心分離します。
    2. バイオセーフティキャビネット内で無細胞上清を吸引します。 細胞ペレットを1 mLのXF-HP増殖培地に穏やかに再懸濁し、血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞計数を行います。
    3. 1x106 個の増殖したHP細胞を100 μLのヒトCD34+ 細胞核フェクション溶液(ヒトCD34+ 細胞核フェクターキット)と組み合わせます。精製濃縮エピソーム(<5 μL)6 μgを加え、Nucleofection Kitのプラスチックトランスファーピペットを使用して、Nucleofector キュベットに慎重に移します。泡は避けてください。キュベットを核管装置に入れ、プログラムU-008を使用します。
      注:エピソームEBNAベースのpCEP4ベクターpEP4 EO2S EM2K(OCT4、SOX2、MYC、KLF4)のストックをTOP10大腸菌のルーチン形質転換によって調製し、プラスミドMaxi-prepキットを使用して精製します。核受化の日、PCR精製キットを使用してプラスミドをクリーンアップして濃縮します 7.
    4. 核フェクションの直後に、500 μLの予熱したXF-HP増殖培地をキュベットに加え、滅菌トランスファーピペットを使用して、1 mLのXF-HP培地中の細胞を超低付着細胞培養6ウェルプレートの1ウェルに移します。
      注:核融合細胞は非常に壊れやすく、通常の1 mLピペットチップからのせん断応力に耐えられません。超低付着培養プレートへの転写は、RGDコーティングされたプレートに最終的に付着する前に、核フェクション後の細胞回復を促進するステップです。
    5. 低酸素状態を模倣するために、プレートをラップでしっかりと包みます。プレートをCO2 インキュベーター(37°C、5%CO2、湿気の多い雰囲気)に入れます。または、包装されていないプレートをO2 コントロール(5%O2、 5%CO2、湿った雰囲気)のインキュベーターに入れます。4〜6時間インキュベートします。
      注:このステップにより、核減持されたHP細胞はMSC単層に転移する前に回復することができます。
    6. 細胞をバイオセーフティキャビネット内の15 mLコニカルチューブに集めます。200 x g で 5 分間遠心分離します。
    7. バイオセーフティキャビネット内で上清を吸引します。細胞ペレットを1 mLのXF-HP増殖培地に再懸濁します。ROCK阻害剤Y-27632(最終濃度10μM)を添加したXF-HP増殖培地(2 mL/ウェル)中のRGDコーティングプレートに、照射されたMSCに約17,500細胞/cm2 の密度で核移害されたHP細胞をプレート化しました。プレートをCO2 インキュベーター(37°C、5%CO2、湿気の多い雰囲気)に入れます。
    8. 核受化の2日後、バイオセーフティキャビネット内の各ウェルに2 mL(等量)のE8培地を加えます。
    9. 培地の量の半分を1日おきにE8培地に交換します。浮遊細胞を15 mLのコニカルチューブに集め、200 x g で5分間遠心分離し、回収した細胞を培養物に戻します。
    10. 21日目に、ビトロネクチンでコーティングされた組織培養処理された6ウェルプレートを調製します。希釈したビトロネクチン溶液1mL(例えば、ビトロネクチン-XFの場合は40 mL/mL)を6ウェルプレートの1ウェルに加え、室温で1時間インキュベートします。
    11. バイオセーフティキャビネット内の倒立顕微鏡を使用して、個々のXF-hiPSコロニーを手動で選択します。ピペットで粉砕し、ROCK阻害剤Y-27632(最終濃度5μM)を添加したE8培地のビトロネクチンコーティングプレートに単一コロニーを移します。プレートをCO2 インキュベーター(37°C、5%CO2、湿気の多い雰囲気)に入れます。
    12. 翌日、培地をROCK阻害剤を補給しないE8培地に慎重に交換します。その後、バイオセーフティキャビネットで毎日E8培地(2 mL /ウェル)を交換します。

2. 定期的なhiPS細胞培養と維持

  1. コロニーが5〜6日後に大きくなったら(つまり、直径0.5〜1 mmまたは約80%の合流点)、バイオセーフティキャビネットで培地を吸引します。
  2. 2 mL/ウェルPBSを加えて細胞を洗浄します。PBSを吸引します。1 mLのEDTAベースの細胞解離溶液を加えます。CO2 インキュベーター(37°C、5%CO2、湿った雰囲気)で5分間インキュベートします。細胞が緩く付着しているか(例えば、光沢のある丸い細胞がプレートに付着している)ことを顕微鏡で確認します。
  3. 細胞を破壊することなく、バイオセーフティキャビネット内の解離溶液を穏やかに吸引します。
  4. ROCK阻害剤Y-27632(最終濃度5μM)を添加した1〜2 mLのE8培地に細胞を収集し、細胞塊を維持するために非活発なピペッティングを行います。細胞塊をビトロネクチンでコーティングされた(セクション1.3.11を参照)6ウェル細胞培養処理プレート(ウェルあたり10コロニーまたは1:10分割に相当)に移します。プレートをCO2 インキュベーター(37°C、5%CO2、湿気の多い雰囲気)に入れます。
  5. EDTAベースの細胞解離液を使用して、5〜7日ごとに継代培養を継続します。
    注:通常、SP-CB-hiPSCの再プログラミングには追加のサブクローニングまたは手動コロニーピッキングは必要ありませんが、hiPS細胞クローンに異常な形態(例えば、線維芽細胞や胚様体形成などの自然分化、異常な非平坦なコロニーの出現)のコロニーが含まれている場合は、バイオセーフティキャビネット内のマイクロピペットと顕微鏡を使用してコロニーを手動で選択するか、異常なクローンを破棄します。hiPSCの非効率的で不安定な再プログラミングは、TIRN-SC復帰と互換性がありません。

3. XF-hiPScクローンの表現型検証

  1. XF-hiPSCクローンを、セクション2で説明したように、長期凍結保存および機能研究への応用の前に、初期検証(図2)のために少なくとも5〜7継代で拡張します。凍結保存された各バイアルの通過数を記録します。
    注:低継代XF-hiPScクローンの初期特性評価は、アカリンホスファターゼ活性、TRA-1抗原またはNANOG免疫検出などの複数のアッセイによって確認できます。
  2. アルカリホスファターゼ染色によるXF-hiPSの検証と計数を実行します(図2A、B)。
    注:バルク培養における再プログラミング効率は、3日目にプレーティングされた単一入力細胞あたりの完全に再プログラムされたコロニーの数を列挙することにより、エピソーム核フェクション後3〜5週間のP0で決定できます7,13。
    1. バイオセーフティキャビネット内の吸引培地。
    2. PBS(ウェルあたり2 mL)で細胞を洗浄します。PBSを吸引します。2%パラホルムアルデヒド/ PBS溶液を加えて細胞を固定します。室温で10分間インキュベートします。
    3. パラホルムアルデヒド/PBS溶液は、化学廃棄物の安全ガイドラインに従って除去し、廃棄してください。
    4. PBS(ウェルあたり2 mL)で細胞を洗浄します。PBSを吸引します。1〜2 mLのアルカリホスファターゼ基質を加え、室温でゆっくりと撹拌しながら10〜15分間インキュベートします。
    5. PBSで3回洗浄して反応を止めます。顕微鏡写真と列挙。
      注:過剰なインキュベーション時間や温度は偽陽性染色を引き起こす可能性があるため避けてください。
  3. TRA-1抗原免疫染色でXF-hiPS染色の検証と計数を実行します(図2C)。
    注:エピソームリプログラミングの場合、初期継代中のトランスジェニック発現およびEBNA1ベクターバックボーンの検出は、公開されたプロトコル7を使用して実行する必要があります。ルーチンバリデーションには、Gバンディング(図2D)または全ゲノムアレイベースのカバレッジアッセイによる核型解析が含まれます。基本的な機能的多能性は、奇形腫分化プロトコル(図2E)または非指向性胚様体分化の定量的多遺伝子発現スコアカードを使用してアッセイすることもできます14。
    1. バイオセーフティキャビネット内で、免疫染色は、蛍光色素結合生染色抗体を適切な濃度のE8培地に添加することにより、TRA-1-60またはTRA-1-81抗原のウェルを30分間複製します。
    2. 培地を吸引します。E8培地(ウェルあたり2 mL)で2回洗浄します。
    3. 顕微鏡写真でE8培地またはフェノールレッドフリー培地で列挙します。
      注:あるいは、2%パラホルムアルデヒド/ PBS溶液を室温で10分間使用して細胞を固定し、標準抗体を使用してTRA-1抗原の免疫染色を用いて固定します。
  4. フローサイトメトリーによるXF-hiPSc免疫表現型の検証
    1. バイオセーフティキャビネットで、培地を吸引します。
    2. PBSで細胞を洗浄します(ウェルあたり2 mL)。PBSを吸引します。酵素解離試薬(例:Accutase、ウェルあたり1mL)を追加します。プレートをCO2 インキュベーター(5%CO2、湿潤雰囲気)で37°Cで5分間インキュベートします。
    3. 同量の培地を加えて細胞を採取し、細胞ストレーナー(40〜70μmフィルター)に通します。細胞を200 x g で5分間遠心分離します。
    4. 細胞ペレットを5%FBS(ウェル当量あたり1 mL)でPBSに再懸濁します。血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞数をカウントします。FACSアッセイごとに約100,000〜200,000個の細胞を丸底チューブに分配します(アッセイごとに容量を約100 μLに維持します)。
    5. 細胞外染色の場合、純粋なマウス血清を使用したオプションのブロッキングステップ(アッセイごとに5 μL、室温で5分間添加)の後、製造元の指示に従って蛍光色素結合抗体(TRA-1-81 PE、SSEA4 APCなど)とインキュベートします。3 mL PBSで洗浄します。300 x g で 5 分間遠心分離します。FACSバッファー(例えば、5%FBSを含むPBS)に再懸濁し、FACS装置を使用して取得します。
      注:常に適切なアイソタイプコントロールを使用し、並行サンプルを染色して、免疫検出タンパク質の特異性を検証します。
    6. 細胞内染色(NANOG-PE、OCT3/4-PE、SOX2-PEなど)の場合は、固定/透過処理手順について製造元の指示に従ってください。蛍光色素結合抗体または一致するアイソタイプコントロールとインキュベートします。FACS装置を使用して取得します。

4. XF-hiPScクローンの凍結保存と解凍

  1. XF-hiPSCクローンを少なくとも5〜7継代に拡張して、長期凍結保存および機能研究への適用の前に初期検証を実行します(図2)。凍結保存された各バイアルの通過数を記録します。
    1. バイオセーフティキャビネット内の吸引培地。
    2. PBS(ウェルあたり2 mL)で細胞を洗浄します。PBSを吸引します。 EDTAベースの細胞剥離溶液(ウェルあたり1 mL)を加えて、XF-hiPSCコロニーを細胞塊に解離させます。プレートをCO2 インキュベーター(37°C、5%CO2、湿った雰囲気)で5分間インキュベートします。細胞が緩く付着している(光沢のある丸い細胞など)ことを顕微鏡で確認します。
    3. 細胞単層コロニーを破壊することなく解離溶液を穏やかに吸引し、細胞塊(塊あたり10〜50個の細胞)を維持するために、非活発なピペッティングで細胞を1〜2 mL E8培地に収集します。XF-hiPSCを滅菌15 mLコニカルチューブに集めます。細胞を200 x g で5分間遠心分離します。
    4. バイオセーフティキャビネット内の上清を吸引します。細胞ペレットを凍結溶液に再懸濁します(表2、~1ウェル相当/mL)。
    5. 細胞を長期保存極低温チューブに移します。チューブを緩凍容器に入れ、サンプルを-80°Cの冷凍庫で一晩凍結します。翌日、クライオバイアルを液体窒素冷凍庫に入れて長期保存します。
  2. 解凍の場合は、ビトロネクチンをプレコーティングしてプレートを準備します(セクション1.3.11を参照)。
    1. 凍結バイアルを37°Cの水浴に入れ、細胞を~1〜2分間解凍します。滅菌します(つまり、エタノールスプレー)。
    2. XF-hiPSCを9 mLの解凍培地(表2)を含む滅菌15 mLコニカルチューブにゆっくりと移し、滅菌生物学的安全フードキャビネット内で細胞をゆっくりと10倍に希釈します。
      注意: 激しくピペッティングしないでください。
    3. 200 x g で 5 分間遠心分離します。
    4. 無細胞上清をバイオセーフティキャビネットで吸引します。ROCK阻害剤(最終濃度5 mM)を添加したE8培地(1〜2 mL)に細胞ペレットを再懸濁します。
      注:Y-27632を除外すると、解凍後の回復効率が低下します。
    5. 解凍した細胞を6ウェルプレートの1つまたは2つのビトロネクチンでコーティングされたウェルに移します。翌日、細胞増殖のためにROCK阻害剤を含まない通常のE8培地に培地を変更します。

5. XF-hiPScのゼノフリー血血管分化

  1. 最適化されたゼノフリーの血液血管分化プロトコルを使用してXF-hiPS細胞を区別します(図3)4。
    注:このプロトコルは15から変更されています。
    1. ~40〜50%コンフルエンス(継代後1〜3日)でXF-hiPSCを調製します。
    2. 培地を吸引し、バイオセーフティキャビネットに2 mLの中胚葉測定培地(表2)を加えます。
    3. 2日後、培地を吸引し、バイオセーフティキャビネットに2 mL/ウェルの血管分化培地(表2)を加えます。このステップで多くの死細胞または浮遊細胞が見られる場合は、2 mL PBSで1回洗浄します。
    4. 11日目までバイオセーフティキャビネットで血管分化培地を1日おきに交換します。
      注:細胞密度が高く、pHが低いために培地が黄色に変わった場合は、1 mLの新鮮な培地を追加するか、毎日交換してください。
  2. 血管分化培地で7〜10日間培養した後、磁気ビーズ細胞選別法で接着単層からCD31+ またはCD34+ 血管細胞を精製します。
    注:個々のクローンは、異なる分化動態を示す場合があります。FACS分析により、CD31/CD34発現のピーク時点を決定します(図4A)。磁気ビーズ濃縮前および磁気濃縮後のFACS分析が必要です。造血前駆細胞(HP)は、この段階で上清から回収され、CD34マイクロビーズを使用して濃縮される場合があります。CD34+ XF-hiPSC由来のHPは、メチルセルロースアッセイを使用してさらに検証できます(図4B-C)16。
    1. バイオセーフティキャビネットで、培地を吸引し、PBSで細胞を洗浄します(ウェルあたり2 mL)。PBSを吸引し、酵素解離試薬(例えば、アキュターゼ、ウェルあたり1 mL)を添加することにより、hiPSCコロニーを単一細胞に解離させます。細胞をCO2 インキュベーター(5%CO2、湿潤雰囲気)で37°Cで5分間インキュベートします。
    2. バイオセーフティキャビネットでは、同量の培地を加えて細胞を収集します。細胞を200 x g で5分間遠心分離します。
    3. 細胞ペレットを血管分化培地に再懸濁します(表2)。血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞数をカウントします。直接結合した抗CD31または抗CD34抗体を使用したプレマグネティックビーズ濃縮FACSアッセイのために、約50,000〜100,000個の細胞を確保します。
    4. 残りの細胞を300 x g で5分間遠心分離します。バイオセーフティキャビネット内の磁気ビーズ濃縮バッファー(PBS pH 7.2、0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)、および2 mM EDTA)に細胞ペレットを再懸濁します。
    5. 細胞を細胞ストレーナー(40〜70μmフィルター)に通します。300 x g で 5 分間遠心分離します。60 μLの磁気ビーズ濃縮バッファーに再懸濁します。
    6. 20 μLのFcRブロッキング試薬を加え、次に20 μLのCD31またはCD34マイクロビーズを加え、4°Cで15〜20分間インキュベートします。
    7. バイオセーフティキャビネットと遠心分離機(300 x g、5分)で2 mLの磁気ビーズ濃縮バッファーで細胞を洗浄します。
    8. 細胞ペレットをバイオセーフティキャビネット内の1 mL磁気ビーズ濃縮バッファーに再懸濁します。
    9. LSカラムをバイオセーフティキャビネット内の磁気セルセパレーターの磁場に配置します。3 mLの磁気ビーズ濃縮バッファーでカラムを洗浄します。
    10. セルを列に適用します。 標識されていない細胞を15 mLのコニカルチューブに集めます。カラムを3 mLの磁気ビーズ濃縮バッファーで3回洗浄します。
    11. セパレーターからカラムを取り外し、新しい 15 mL コニカルチューブに置きます。
    12. 3〜5 mLの内皮増殖培地を加えて、磁気標識細胞を洗い流します。200 x g で 5 分間遠心分離します。
    13. バイオセーフティキャビネット内の1 mL内皮増殖培地に再懸濁します。血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞数をカウントします。直接結合した抗CD31または抗CD34抗体を使用したFACS分析による磁気ビーズ濃縮ソート純度のために約50,000細胞を取っておきます。
    14. 単離されたVPは、内皮増殖培地中のフィブロネクチンでコーティングされた(10 μg/mL)組織培養処理されたフラスコプレート上でさらに増殖することができます。

6. XF-hiPSCの機能検証のための実験計画ガイドライン

  1. エピソーム7,17、仙台ウイルス18、mRNA19リプログラミングなどの確立された非統合法を使用して、検証済みのXF-hiPScのストックを最も早い継代で確立します。
    注:非再プログラミング手法の効率と信頼性の比較は、他の場所で提供されています6。エピソームまたは仙台ウイルスのリプログラミング法におけるトランスジェニックマテリアルクリアランスは、PCR法7,20を使用して初期継代中に検証できます。導入遺伝子の保持は、TIRN-SC生成と互換性がありません。
  2. X-hiPSCクローンの正常核型をGバンディングまたは全ゲノムアレイベースのカバレッジアッセイで検証します9。
  3. DNAメチル化および遺伝子発現アレイまたはシーケンシング法5,11,14を使用して、XF-hiPS細胞株の遺伝子発現およびエピゲノム完全性(すなわち、親のインプリント、X活性化)を検証します。
  4. 奇形腫分化プロトコル(図2E)、RT-PCRアレイ14を使用した定量的胚様体(EB)分化アッセイ、または3つの生殖層9に向けた指向性分化アッセイを使用して、基本的な機能的多能性を検証します。
    注:顕微鏡による組織学的特徴付けを使用した奇形腫アッセイの多系統分化能力および系統内増殖指数の定量的方法は、他の場所で提供されています4。中胚葉系統および血血管仕様(図4A-C)に向けた指向性分化のためのプロトコルは、以前に詳述されていました4、5、9、および決定的な内胚葉への指向性分化アッセイ(図4D)5。外胚葉に対する指向性分化アッセイの例は、他の場所で提供されています4,5。

7. XF-hiPSCの化学的TINN適応

  1. 公開されたプロトコル9,21に従って、CF1またはCF1 x DR4ハイブリッドE13.5マウス胚から社内で低継代MEFフィーダーを購入または調製します。TIRN適応ステップの少なくとも1日前に、糊化(水中0.1%ゼラチン、ウェルあたり1 mL)組織培養処理された6ウェルプレートにウェルあたり200,000MEFフィーダーをプレートします(詳細なTINNプロトコルは他の場所で提供されています4,5,9)。
  2. フィーダーフリー培養システム(例えば、E8培地、社内製剤については 表1 を参照)で、検証済みの正常核型で導入遺伝子フリーのXF-hiPSc培養を維持および増殖します。
  3. E8培地をLIF-5i培地(ウェルあたり2 mL; 表1)XF-hiPSC培養がバイオセーフティキャビネット内で~50%のコンフルエンスに達した後(つまり、最初のプレーティングの3〜5日後)。
  4. 翌日、培地を吸引し、バイオセーフティキャビネット内でLIF-5i適応XF-hiPScをPBS(ウェルあたり2 mL)で1回洗浄します。上清を吸引し、各ウェルに1 mLの酵素細胞解離試薬を加えます。CO2インキュベーターで37°Cで5分間インキュベートします。
  5. ピペットでバイオセーフティキャビネット内の単一細胞懸濁液に穏やかに粉砕します。LIF-5i培地(ウェルあたり1mL)で中和します。細胞懸濁液を滅菌15mLコニカルチューブに集めます。 200 x g で 5 分間遠心分離します。
  6. バイオセーフティキャビネット内の上清を吸引します。細胞ペレットを2 mLのLIF-5i培地に再懸濁します。
    注:可能であれば、細胞計数のためにアリコートを取ります。阻害剤や成長因子を補給することなく、LIF-5i/LIF-3i培地で酵素活性を中和することが可能です。
  7. MEFプレートをPBSで2回洗浄し(6ウェルプレートでウェルあたり2 mL)、細胞(LIF-5i適応細胞の1ウェル相当を2 mLのLIF-5i培地中のMEFフィーダーの1ウェルに)を加えます。
    注:個々のXF-hiPSCラインごとの初期プレーティング密度の最適化はオプションです。前のステップで細胞をカウントした場合は、ウェルあたり最低1x106 個の細胞をフィーダーにプレートします。 プレートをCO2 インキュベーター(37°C、5%CO2、湿潤雰囲気)に移します。
  8. XF-hiPSCをCO2 インキュベーター(37°C、5%CO2、湿潤雰囲気)のMEF上のLIF-5iで3〜5日間培養し、維持します。LIF-5i 培地を毎日交換してください。
  9. ドーム型のTIRN-SCコロニーが形成されたら(フィーダーで3〜5日間培養した後)、バイオセーフティキャビネットで培地を吸引します。各ウェルを2 mLのPBSで洗浄します。
  10. PBSを吸引します。各ウェルに1 mLの細胞剥離溶液(アキュターゼなど)を加えます。CO2 インキュベーター(5%CO2、湿潤雰囲気)で37°Cで5分間インキュベートします。
  11. バイオセーフティキャビネット内の各ウェルに1 mLのLIF-3i培地(表1)を加えて、解離試薬を中和します。細胞を穏やかに粉砕し、15 mLの円錐形チューブに集めます。200 x g で 5 分間遠心分離します。
  12. バイオセーフティキャビネット内の上清を吸引します。LIF-3i培地(ウェルあたり1 mL)に再懸濁し、血球計算盤または自動セルカウンターを使用して細胞計数を行います。バイオセーフティキャビネット内の糊化6ウェルプレート内の照射されたMEFに、ウェルあたり2 mLのLIF-3i培地に~5 x 105 細胞をプレートします。
    注:後続のすべてのパッセージについて、手順7.12 5o 7.16を繰り返します。 最初のLIF-5i適応培養に続いて、LIF-3i培養を低密度(2x105 細胞/ウェル)でプレートし、3〜4日ごとに継代します。
  13. 機能研究または凍結保存に使用する前に、LIF-3i 培地中で少なくとも 6-7 連続継代の継代 TIRN で XF-hiPSC を継代します。異種フリープライミング培地(E8など)またはLIF-5i/LIF-3i TINN培地のいずれかで継代数を記録します。
    注:高継代(例:>p40)XF-hiPSC系統のTINN復帰は非効率的であり、推奨されません。継代性の高い株には染色体または染色体下の欠陥があることが多く、効率的なTINN復帰とは互換性がなく、復帰効率が低下し、培養安定性が制限されます。また、LIF-3i培地で15回を超える継代を経たTINN培養物の使用は、機能研究には推奨されません。XF-hiPSCのTINN復帰の機能的影響は、LIF-3i培地の7〜15継代の間で最も顕著です。

8. XF/FF hiPSC由来のTIRN-SCの指向性分化のための実験計画ガイドライン。

  1. XF/FF hiPSC由来のTIRN-SCを「リプライミング」ステップなしで確立された指向性分化プロトコルに直接利用します(つまり、 指向性分化アッセイで使用する前に、TINN幹細胞を従来の「プライミング」条件に戻す必要はありません)。
  2. XF-hiPSCに対するTINNの影響の機能評価のために、兄弟同種遺伝子培養を同等の継代数で並行してセットアップします。プライミング/TINN兄弟同種遺伝子XF-hiPSC培養をそれぞれの培地で並行して維持します(例えば、ビトロネクチン上のE8 とMEF上のLIF-3i)、同時に奇形腫アッセイ(図5)を実行するか、同一の胚様体または指向性分化プロトコルと材料を使用して分化します(図6)。
  3. 可能であれば、末端分化系統の機能評価を実施します。たとえば、血管前駆細胞は、タンパク質発現、DiI結合アセチル化低密度リポタンパク質(LDL)取り込みアッセイ、およびマトリゲルチューブアッセイによって評価できます(図7)。
    注:CB-hiPSCおよびTIRN-SC由来VPの追加の機能アッセイ(すなわち、DiI-Ac-LDL取り込み/老化/増殖/遊走アッセイ、in vitroマトリゲルチューブアッセイ、動物マトリゲルプラグアッセイ、異種移植アッセイ)については、他の場所で詳しく説明します3,4。
  4. 各分化アッセイで、個々のXF-hiPScクローンごとに初期プレーティング密度と動態(図6)を調整および最適化します。
    注:TINNで戻されたXF-hiPS細胞は、プライミングされたXF-hiPS細胞よりも指向性分化アッセイにおいてより堅牢な増殖および分化能力を持っています。TINN培養は通常、E8培養よりも低い初期プレーティング密度を必要とし、クローン生存率を高めるために抗アポトーシスサプリメントを使用する必要はありません。

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結果

このプロトコルは、エピソームベクターおよび間質シグナルを使用して、高忠実度プライミング多能性状態への効率的な骨髄前駆細胞再プログラミングのための公開された方法を最適化します7。このプロトコル(図1)は、ヒトCB CD34+ 前駆細胞のXF-hiPSCへのXF/FF間質プライミングエピソームリプログラミングのための定義された方法を概説し、指向性血液血管仕様 を介して それらの機能を検証する方法を指示し、その後、LIF-3i/MEF条件で割球様TIRN幹細胞にTINNを復帰させます。

この最適化されたプロトコルを使用して、hiPSCコロニーは高頻度(>7%)で2〜3週間で出現しました(図2A、B)。他の統合フリーのリプログラミング法6 (仙台ウイルス、mRNAトランスフェクションなど)と比較して...

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ディスカッション

ザンビディスグループは当初、精製されたエピソーム発現細胞で最大50%に達するバルク効率で、系統にコミットしたCB骨髄前駆細胞をCB-hiPScに再プログラミングするための高度に最適化された4因子エピソーム法を報告しました7。本稿では、XF/FF間質プライミング条件における元のヒトCB前駆細胞エピソーム再プログラミングプロトコルの修正版を提示した。この方法は、系統にコミットされたCD33 + CD45 + CD34- 骨髄細胞の拡張リプログラミング能力を採用し、可溶性および接触依存性間葉系間質細胞シグナルへの曝露後に迅速かつほぼ完全な非統合リプログラミングを達成しました。

再生アプローチのための従来のhiPS細胞株の使用は、分化効率の変動が非常に大きく、下流の前駆細胞のin vivo機能が低いことによって妨げられています。従来のhiPS細胞の機能的多能性に影響を与える重要な変数の1つは、...

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開示事項

宣言する開示はありません。

謝辞

この研究は、NIH/NEI (R01EY032113;ETZ)、メリーランド幹細胞研究基金 (2023-MSCRFV-5995、2024-MSCRFV-6248、2025-MSCRFV-0005、2025-R2-MSCRFV-0004 (ETZ)、およびリサ・ディーン・モーズリー財団 (ETZ)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アマクサ・バイオシステムズ・ヌクレオフェクターIIロンザAAB-1001型
抗CD143(BB9)抗体、APC結合 BDバイオサイエンス55792910-20 & micro を使用します。アッセイあたりの L (FACS)
抗CD144抗体、PE結合 BDバイオサイエンス56041010-20 & micro を使用します。アッセイあたりの L (FACS)
抗CD146抗体、PE結合 BDバイオサイエンス55031510-20 & micro を使用します。アッセイあたりの L (FACS)
抗CD184/CXCR4抗体、APC結合 BDバイオサイエンス55597610-20 & micro を使用します。アッセイあたりの L (FACS)
抗CD31抗体BDバイオサイエンス550389免疫蛍光アッセイ用のブロッキング溶液で1:100に希釈します。
抗CD31抗体、APC結合 eバイオサイエンス17-0319-422 & micro を使用します。アッセイあたりの L (FACS)
抗CD34抗体、APC結合 BDバイオサイエンス5558245 & micro を使用します。アッセイあたりの L (FACS)
抗CD45抗体、PE結合 BDバイオサイエンス55548310-20 & micro を使用します。アッセイあたりの L (FACS)
抗NANOG抗体, PE結合BDバイオサイエンス56048310-20 & micro を使用します。アッセイあたりの L (FACS)
抗OCT4抗体、PE結合R&DシステムIC1759P10 & micro を使用します。アッセイあたりの L (FACS)
抗SOX17抗体、Alexa488結合 BDバイオサイエンス5622055 & micro を使用します。アッセイあたりの L (FACS)
抗SOX2抗体, PE結合R&DシステムIC2018P10 & micro を使用します。アッセイあたりの L (FACS)
抗SSEA-4抗体、APC結合 R&DシステムFAB1435A5 & micro を使用します。アッセイあたりの L (FACS)
抗SSEA-4 GloLIVE抗体、NL493 標識型R&DシステムNLLC1435G1:50希釈で使用(生免疫染色および固定免疫染色)
抗TRA-1-60 A488共役キットサーモフィッシャーサイエンティフィックA25618
抗TRA1-60抗体、PE結合BDバイオサイエンス56019310 & micro を使用します。アッセイあたりの L (FACS)
抗TRA-1-60 GloLIVE抗体、NL557抱合型 R&DシステムNLLC4770Rat を使用します。1:50希釈(生免疫染色および固定免疫染色)
抗TRA-1-60 StainAlive抗体、DyLight 488 標識型ステムジェント09-00681:100希釈で使用(生免疫染色および固定免疫染色)
抗TRA1-81抗体、PE結合BDバイオサイエンス56016110 & micro を使用します。アッセイあたりの L (FACS)
抗TRA-1-81 StainAlive抗体、DyLight 488 標識型ステムジェント09-00691:100希釈で使用(生免疫染色および固定免疫染色)
CD31 MicroBead Kit, ヒトミルテニー・バイオテック130-091-935
CD34 MicroBead Kit, ヒトミルテニー・バイオテック130-046-702
CD34+ 混合ドナー、 臍帯血、100万個の細胞すべてのセルCB, CR, CD34+, ミックス, PS, CS10, 1M代替の細胞源には、胎児の肝臓、成人の骨髄、動員された末梢血が含まれます
CF1マウスチャールズ川023
CHIR99021R&DシステムL5283DMSOで100 mMで再構成
Corning Costar組織培養処理6ウェルプレートコーニング3506
Corning Synthemax II-SC 基質、10 mg バイアルコーニング35355 & mu で使用します。Corning 3978の代替品としてg/cm2
Corning Synthemax-R 6ウェルプレートコーニング3978廃止され、3535に置き換えられました
Costar 6ウェルクリアフラットボトム超低アタッチメント6ウェルプレートコーニング3471
伯爵夫人 細胞計数チャンバースライドサーモフィッシャーサイエンティフィックC10228
Countess自動セルカウンターサーモフィッシャーサイエンティフィックAMQAX1000
クライオストア CS10幹細胞技術100-1061
DII-AC-LDLサーモフィッシャーサイエンティフィックL34845-15 & microで使用します。グラム/ミリットル
DMEM(ダルベッコの修飾イーグル培地) サーモフィッシャーサイエンティフィック11995065
DMEM/F-12、グルタMAXサプリメントサーモフィッシャーサイエンティフィック10565018
DMEM/F-12、HEPESサーモフィッシャーサイエンティフィック11330032
DMSO(ジメチルスルホキシド)シグマ・アルドリッチD2650型
DR4 マウスジャクソン研究所3208
エッセンシャル8(E8)培地幹細胞技術5940
ウシ胎児血清(FBS)サーモフィッシャーサイエンティフィックSH30071.03
修正&PERM細胞透過処理キットサーモフィッシャーサイエンティフィックガス004
フォルスコリンステムジェント04-0025DMSOで100 mMで再構成
ゼラチン(ブタ)シグマ・アルドリッチG1890-100G水に再懸濁し、オートクレーブで滅菌します
ヒトCD34+細胞ヌクレオフェクター キットロンザVPA-1003
アイソタイプマウスIgG1 PE結合BDバイオサイエンス554680
アイソタイプマウスIgG2a PE結合BDバイオサイエンス558595
アイソタイプラットIgG2b PE結合R&DシステムIC013P
ノックアウト血清交換サーモフィッシャーサイエンティフィック10828-028
L-アスコルビン酸ミリポアシグマA8960
L-グルタミン (100X)サーモフィッシャーサイエンティフィック25030-081
LS 列ミルテニー・バイオテック130-042-401
マトリゲルコーニング356237200 & マイクロを使用します。48ウェルプレートのL/ウェル
MEM非必須アミノ酸(MEM NEAA)(100X)サーモフィッシャーサイエンティフィック11140-050
メソカルトSF H4436幹細胞技術04436
MidiMACSセパレータミルテニー・バイオテック130-042-302
mTeSR1 培地幹細胞技術85850
Nalgene極低温バイアルサーモフィッシャーサイエンティフィック5000-0020
パラホルムアルデヒド溶液、PBS中4%サーモフィッシャーサイエンティフィックJ19943です。K2PBSを使用して必要な濃度に希釈します
PD0325901シグマ・アルドリッチPZ0162DMSOで100 mMで再構成
ペニシリン/ストレプトマイシン(10,000 U/mL)サーモフィッシャーサイエンティフィック15140-122
pEP4 E02S EM2Kエピソームアドジーン20923プラスミドはTOP10 E. で増殖しました。大腸菌(Invitrogen)を投与し、QIAGENプラスミドMaxiキットで精製しました。
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)生物産業02-023-1A
Poietics ヒト間葉系幹細胞 ロンザPT-25012代の750,000セルは、使用前に1〜2代のメーカーの指示に従って解凍および拡張することができます。
プルモルファミンステムジェント04-0009DMSOで10 mMで再構成
組換えアクチビンAペプロテック120-14EAT&NBSPを一時停止します。(100 & マイクロ;g/mL)滅菌PBS、0.1%ヒトまたはウシ血清アルブミン
組換えヒトFGF2ペプロテック100-18BAT&NBSPを一時停止します。(100 & マイクロ;g/mL)滅菌PBS、0.1%ヒトまたはウシ血清アルブミン
組換えヒトFGF-basic(bFGF)ペプロテック100-18B100 & マイクロで再接続します。PBS中の0.1%ウシ血清/ヒトアルブミン中のg / mL
組換えヒトFLT3リガンドR&Dシステム308-FKHBまたは 308E-GMP型AT&NBSPを一時停止します。(100 & マイクロ;g/mL)滅菌PBS、0.1%ヒトまたはウシ血清アルブミン
組換えヒトインスリンバイオジェム10-365
組換えヒトキットリガンドR&DシステムBT-SCF または BT-SCF-GMPAT&NBSPを一時停止します。(100 & マイクロ;g/mL)滅菌PBS、0.1%ヒトまたはウシ血清アルブミン
組換えヒトLIFペプロテック300-05100 & マイクロで再接続します。PBS中の0.1%ウシ/ヒト血清アルブミン中のg / mL
組換えヒトTGF&β;1ペプロテック 100-21100 & マイクロで再接続します。PBS中の0.1%ウシ/ヒト血清アルブミン中のg / mL
組換えヒトトロンボポエチン&NBSP;R&Dシステム288-TPNまたは288E-GMPAT&NBSPを一時停止します。(100 & マイクロ;g/mL)滅菌PBS、0.1%ヒトまたはウシ血清アルブミン
組換えヒトトランスフェリンミリポアシグマT3705
共生ヒトBMP4ペプロテック120-05AT&NBSPを一時停止します。(100 & マイクロ;g/mL)滅菌PBS、0.1%ヒトまたはウシ血清アルブミン
SB431543セレックケムS1067DMSOで10 mMで再構成
SIGMAFAST, アルカリホスファターゼ基質, 発色, 錠剤ミリポアシグマB56551錠を精製水10mLに溶かす
亜セレン酸ナトリウムミリポアシグマS5261
溶液中のステム分子 Y27632ステムジェント04-0012-02溶液中のROCK阻害剤(10 mM)
StemPro Accutase 細胞解離試薬サーモフィッシャーサイエンティフィックA11105-01
ステムプロ MSC SFM ゼノフリー (XF-MSC)サーモフィッシャーサイエンティフィックA10675015 mL StemPro MSC SFM XenoFree Supplement と 500 mL StemPro MSC SFM 基礎培地を混合して、XF-MSC 培地を調製します。分注された培地は、-20°Cで凍結保存できます。
ステムスパンSFEM幹細胞技術9600
サーモサイエンティフィック ミスター フロスティ冷凍容器サーモフィッシャーサイエンティフィック5100-0001
Ulex Europaeus 凝集素 I (UEA-1)、バイオチニル化ベクター研究所B-1065-2蛍光アッセイ用のブロッキング溶液で1:200に希釈します
ベジフペプロテック100-20AT&NBSPを一時停止します。(100 & マイクロ;g/mL)滅菌PBS、0.1%ヒトまたはウシ血清アルブミン
Verseneソリューションサーモフィッシャーサイエンティフィック15040066
ビトロネクチンXFマトリックス幹細胞技術718040&マイクロで希釈します。CellAdhere 希釈バッファー中の L/mL
XAV939シグマ・アルドリッチX3004DMSOで100 mMで再構成
β-メルカプトエタノールサーモフィッシャーサイエンティフィック21985-023感光性

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