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方法論記事

結膜下注射による標的角膜感覚神経枯渇: 細菌接着と神経免疫相互作用を調査するためのモデル

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DOI：

10.3791/68614

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2025年8月29日

 ,  ,  , 
1New England College of Optometry

この記事について

サマリー

この研究では、ブピバカインを使用した角膜感覚神経枯渇の洗練されたモデルを確立し、角膜神経と細菌の接着への影響を明らかにします。このモデルは神経因性状態をシミュレートし、眼感染症における神経免疫相互作用に関する洞察を提供し、薬物送達、神経保護、免疫調節、遺伝子改変研究への応用を提供します。

要約

角膜感覚神経は、眼表面の完全性と免疫防御機構をサポートする上で極めて重要な役割を果たします。この神経支配の喪失は、微生物の侵入に対する脆弱性の増加と関連していますが、角膜への細菌の付着に対する神経枯渇の正確な寄与は十分に特徴付けられていません。ここでは、長時間作用型ナトリウムチャネル遮断薬であるブピバカインを使用した選択的角膜感覚神経抑制のための再現性があり時間的に制御された方法を提示します。結膜下送達経路と局所送達経路を組み合わせることにより、この二重適用戦略は堅牢で持続的な除神経を実現し、変化した感覚入力が細菌のコロニー形成に対する角膜上皮感受性にどのような影響を与えるかを正確に調査できます。

このモデルを使用して、感覚除神経が、異なる接着メカニズムを持つ3つの臨床的に関連する病原体である黄色 ブドウ球菌、表 皮ブドウ球菌、および緑膿 菌の微生物接着動態にどのように影響するかを調査します。実験室のワイプブロッティング法による標準化された細菌接種により、角膜表面への均一な沈着が保証され、その後細菌の接着が定量的に評価されます。ブピバカイン誘発性神経枯渇は、角膜神経密度の低下および細菌接着の増加と相関しており、感覚枯渇と微生物感受性との間の機能的関連性が確認されています。

このアプローチは、糖尿病性神経障害や神経栄養性角膜炎などの神経障害状態をシミュレートすることにより、眼感染症における神経免疫相互作用を研究するための新しい枠組みを提供します。この結膜下注射戦略は、感染モデルを超えて、眼薬の薬物動態、神経保護介入、免疫調節を調査するための多用途のプラットフォームを提供します。さらに、CRISPR/Cas コンストラクトやウイルスベクターの結膜下送達などの遺伝子改変研究にも適応でき、眼科研究や治療における応用が広がります。

概要

角膜感覚神経支配は、眼表面の完全性と免疫恒常性を維持する上で重要な役割を果たします。角膜は、体内で最も神経支配された組織の1つであり、主に三叉神経の眼科部門によって供給されます1。これらの感覚神経は、侵害受容とまばたき反射を媒介するだけでなく、上皮増殖、創傷治癒、および免疫監視も調節します2,3。したがって、感覚神経支配の混乱は角膜バリアを損ない、眼表面の微小環境を変化させ、微生物感染に対する感受性を高める可能性があります。

角膜感覚機能障害は、糖尿病などの全身状態に関連しており、ドライアイ疾患、糖尿病性角膜症、神経栄養性角膜炎、術後合併症などの眼の病状に寄与します 3,4,5,6,7,8,9,10 .感覚神経障害は、涙液の生成の減少、上皮の菲薄化、および創傷治癒の遅延につながり、これらすべてが細菌のコロニー形成を促進します11,12。しかし、感覚神経の枯渇と細菌の付着の間の正確なメカニズムの関連性は、依然として十分に理解されていません。角膜除神経後の細菌の接着の増加が研究で実証されていますが、この関係を制御された調査を可能にする標準化されたモデルが不足しています。

このギャップに対処するために、永久的な神経損傷を引き起こすことなく臨床神経障害を模倣する長時間作用型ナトリウムチャネル遮断薬であるブピバカインを使用して、角膜感覚神経枯渇の標的モデルを開発しました13,14,15。この薬理学的アプローチは、角膜神経の枯渇と眼表面へのその影響を研究するための制御された再現性のある方法を提供します15。このモデルを細菌接着アッセイと統合することで、糖尿病性角膜症と神経栄養性角膜炎の重要な側面を模倣して、微生物のコロニー形成に対する感覚神経枯渇の影響を体系的に評価できます。

微生物の接着は、涙液層の組成、上皮表面の特性、および宿主の免疫応答の影響を受ける、角膜感染症における重要な初期イベントです。眼表面にコロニーを形成できる多様な病原体の中で、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、緑膿菌は、異なる接着メカニズムを持つ臨床的に重要な 3 つの細菌を表しています。緑膿菌は、毒性の高いグラム陰性菌であり、線毛、べん毛、および分泌された病原性因子を利用して角膜上皮細胞に急速に付着して侵入し、しばしば重度の潰瘍性角膜炎を引き起こします16,17。対照的に、グラム陽性共生細菌であるS.epidermidisは、主に破壊された上皮表面と涙液層の変化を利用してバイオフィルムを確立し、持続的でしばしば無症候性の感染症に寄与します18,19。これらの種間の接着戦略の違いは、角膜神経の枯渇が細菌のコロニー形成を促進するために眼の微小環境をどのように変化させるかを理解する必要性を浮き彫りにしています。

細菌の接着を研究する際の重要な課題は、適切な接種モデルの選択です。感染研究で頻繁に使用される従来の引っかき傷モデルは、細菌の付着を促進するために上皮欠損を作成します。このアプローチは外傷誘発性感染症のシミュレーションには効果的ですが、過度の組織損傷や誇張された炎症反応などの重大な交絡変数をもたらし、神経因性角膜における細菌のコロニー形成の初期段階を正確に表していません。さらに、機械的損傷のばらつきにより、再現性のある結果を達成することが困難になります。これらの制限を克服するには、より制御された生理学的に関連する細菌接種方法が必要です。

実験室のワイプブロッティング技術は、細菌沈着に対する標準化されたアプローチを提供し、上皮バリアを破壊することなく均一な細菌の付着を保証します20。この方法は、明らかな機械的外傷がない場合に、涙液組成と上皮恒常性が変化した条件下で細菌の接着が発生する現実世界の感受性シナリオを厳密に模倣しています。機械的損傷に関連する変動性を排除することにより、実験室でのワイプブロッティング法は、神経因性角膜における微生物の接着動態をより正確に評価します。さらに、細菌のコロニー形成に対する涙液層の寄与を制御して評価することができ、これは涙液分泌が損なわれている角膜感覚機能障害の場合に特に重要です。

涙液の生成と上皮の恒常性の調節における角膜感覚神経の重要な役割を考えると、感覚神経の枯渇が微生物の接着に及ぼす影響を研究するための再現可能なモデルを確立することが不可欠です。この研究は、長時間作用型局所麻酔薬であるブピバカインを使用した標的角膜感覚神経枯渇のプロトコルを改良し、涙液分泌と細菌癒着に対するブピバカインの効果を評価することを目的としています。結膜下と局所ブピバカインの適用を組み合わせて採用することにより、このアプローチは、ピーク効果の定義された時点で局所的かつ持続的な感覚枯渇を保証します。このモデルを使用して、感覚除神経が黄色 ブドウ球菌、 表皮ブドウ球菌、 緑膿菌の接着ダイナミクスをどのように変化させるかを調査 し、 神経枯渇、涙液層の変化、微生物感受性の関係についての貴重な洞察を提供します。これらの発見は、糖尿病性角膜症や神経栄養性角膜炎などの神経因性疾患における感染感受性を理解する上でより広範な意味を持ち、眼の神経免疫相互作用と治療介入に関する将来の研究の基礎を提供します。

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プロトコル

動物が関与するすべての手順は、視覚眼科研究協会によって確立された基準に従って実施され、ニューイングランド検眼大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認され、実験動物の人道的なケアと使用に関するPHSポリシーを遵守しました。6〜8週齢の雄と雌のC57BL / 6J(野生型、系統番号000664)マウスをジャクソン研究所から採取し、マウスに正常な概日リズム(12時間の明暗サイクル)で繁殖させ、食物と水を与えました。すべての手順を通じて無菌技術を維持します。

1.結膜下注射のための動物製剤

  1. 校正された気化器を介して酸素中の2〜3%イソフルランを使用して麻酔を誘発します。つま先を軽くつまむことに対する反射反応がないかどうかをチェックして、麻酔の深さを監視します。
  2. 動物に重度の不快感や苦痛の兆候がないか継続的に観察してください。
  3. 苦痛が観察された場合は、5%イソフルランで深部麻酔を誘発し、無反応を確認します。
  4. 安楽死を確実にするために子宮頸部脱臼を行います。
  5. それ以外の場合は、下流の解析で湾曲した摘出鉗子を使用してすぐに摘出を実行してください。

2.結膜下注射による角膜神経ブロック

注:結膜下注射とブピバカインの局所適用を含む2段階のプロトコルを実装して、標的を絞った角膜感覚神経の枯渇を達成します。結膜下注射と局所塗布を15分以内に完了し、全身麻酔薬への曝露を最小限に抑えます。

  1. 部位の準備と切開
    1. 30 Gの針を使用して、側頭上輪部領域に小さな(~0.5 mm)切開を作成します。血管を避け、組織の外傷を最小限に抑えます。切開を使用して結膜下腔にアクセスし、薬物送達を制御します。
  2. ブピバカインの注射
    1. 滅菌条件下で0.5%ブピバカイン塩酸塩溶液を調製します。
    2. 5 μL の溶液を、33 G の小型ハブ鈍い針(ポイントスタイル 3)を取り付けたハミルトン 10 μL シリンジにロードします。
    3. 溶液を結膜下腔に15〜20°の角度で注入して、逆流を最小限に抑え、均一な分布を確保します。
    4. 注射部位での水疱形成を観察します。5〜10秒間持続させ、完全に吸収されるまで結膜下ポケット内に分散させます。
  3. 角膜脱感作の局所強化
    1. 結膜下注射の直後に、さらに5 μLの0.5%ブピバカインを角膜中央に直接塗布します。
      注:このステップを使用して、表面神経の脱感作を強化し、局所麻酔効果を延長します。
  4. 対照群
    1. 対照動物に対して、結膜下注射と局所塗布の両方を介して5 μLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を同じ時点で投与します。手順のステップとボリュームを一致させて、注入関連の効果を考慮します。
  5. 治療期間とエンドポイント分析
    1. ブピバカイン治療を隔日で 15 日間投与し、毒性を最小限に抑えながら持続的な感覚神経枯渇を達成します。
    2. 15日目に、校正された気化器を介して酸素中の5%イソフルランを使用して最後のブピバカイン処理の4時間後にマウスを安楽死させ、続いて子宮頸部脱臼を行います。
    3. 免疫組織化学を使用して神経密度の変化を評価するためにマウスの1つのグループ(ステップ5.5を参照)から角膜を直ちに収集し(プロトコルの 図1 およびセクション6を参照)、細菌接着分析のために別のグループから角膜を収集します(プロトコルの 図1 およびセクション5を参照)。

3.細菌接種のための動物準備

  1. 腹腔内ケタミン(80〜100 mg / kg)およびデクスメデトミジン(0.25〜0.5 mg / kg)を投与して、最後のブピバカイン注射の4時間後にマウスを麻酔し、15日目の局所適用を行います。
  2. つま先を挟むことに対する反射反応がないことを確認し、深部麻酔を確認します。
  3. 5 μLの滅菌PBSを含むピペットを使用して眼表面を3回すすぎ、残留涙液と破片を除去し、細菌接着研究のためのきれいな角膜表面を確保します( 図1を参照)
  4. 指定された実験グループでは、実験室の糸くずのないティッシュを使用して、標準化された方法で角膜表面を吸い取ります。
    1. ティッシュペーパーを折りたたんでしっかりと握ります。
    2. 麻酔したマウスの角膜を、角膜中央から始めて、周辺領域を含めるために左右に回転運動を用いて、4回穏やかに拭きます20。
      注: 機械的損傷を避けるために最小限の圧力を加えながら、涙液を効果的に除去して細菌の付着を促進します。

4. 細菌接種物の調製と角膜接種

  1. 細菌培養と準備
    1. 黄色 ブドウ球菌 ATCC 25923、表 皮ブドウ球菌 ATCC 12228、および 緑膿菌 O1をトリプシン大豆寒天培地(TSA)で培養し、湿度を維持するためにインキュベーターに入れられた滅菌水で37°Cでインキュベートします。
    2. 個々のコロニーを収穫し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)に懸濁します。懸濁液を5,000 × g で5分間遠心分離して、死んだ細胞と代謝副産物を1回除去します。
    3. 細菌ペレットをPBSに再懸濁し、濃度を~10¹¹ CFU/mLに調整して、接着研究のための高い細菌負荷を確保します。
  2. 角膜接種プロトコル
    1. 調製した細菌懸濁液の5μLアリコートを、持続麻酔下で1時間に1回、角膜表面に4時間塗布します。
    2. 流出を防ぎ、接種物への一貫した曝露を確保するために、マウスをわずかに傾斜させてください。
    3. 臨床感染シナリオに関連する持続的な細菌曝露を模倣するために、時間間隔で接種を繰り返します。
  3. 接種後の安楽死と細菌接着の評価
    1. 4時間後、ケタミン(80〜100 mg / kg)とキシラジン(5〜10 mg / kg)の腹腔内注射を投与して、深い麻酔を確保します。
    2. マウスを人道的に安楽死させるために子宮頸部脱臼を行います。
    3. 汚染を防ぐために厳格な無菌状態を維持しながら、滅菌された湾曲した先端鉗子を使用して目を核出します。
    4. ペトリ皿で滅菌済みの2 mLのPBSで眼表面を5〜6回すすぎ、穏やかに振とうして、付着していない細菌を完全に除去します。
    5. 機械式組織ホモジナイザーを使用して、1 mLの滅菌PBSで摘出された眼を均質化し、一貫した細菌回収を確保し、汚染を防ぐために無菌状態を維持します。
    6. 滅菌PBS中でホモジネートを連続6倍希釈します。
    7. 各希釈液のアリコートをTSAプレートにプレートし、コロニーの増殖を可能にするために37°Cで一晩インキュベートします。
    8. コロニー形成単位(CFU)をカウントし、定量的比較のために角膜あたりの対数CFUとして結果を表現します。

5. 免疫組織化学

  1. 治療後15日目に子宮頸部脱臼を介してマウスを安楽死させます。
  2. 慎重に目を摘出し、室温で穏やかに回転させながらPBSで一度すすぎます。
  3. 構造的完全性を維持するために、摘出された目を2%パラホルムアルデヒド(PFA)で1時間固定します
  4. 固定された目を1 mLのPBSで3 x 10分間洗浄し、室温で穏やかに回転させます。
  5. 前述の角膜郭清プロトコルに従ってください21,22
    1. 最小限のPBSで満たされた幅35mmのペトリ皿内で角膜を解剖します。
    2. 直刃鉗子を使用して摘出された眼を安定させ、手術用ハサミを使用して球体の後面に小さな切開を作成します。
    3. 小さな切開点を使用して、後方に沿って360°慎重に切断します。
    4. マウス網膜、視神経、水晶体、虹彩色素、および角膜以外の追加の組織構造を廃棄します。
    5. 直刃鉗子を使用するか、角膜を無傷のままに手術用ハサミで慎重に切開して、余分な組織を取り除きます。
    6. 解剖した角膜を、室温で穏やかに回転させながら微量遠心チューブに入れた1 mLのPBSで3 x 10分間洗浄します。
  6. 角膜を1 mLのブロッキング溶液(PBS中の3%BSA + Triton X-100)で室温で連続回転させながら1時間インキュベートします。
  7. 角膜を1mLの20%EDTAで同じ条件下でさらに1時間インキュベートすることにより、組織透過性を高めます。
  8. 角膜を4°Cでウサギ抗β-チューブリンIII一次抗体とともに室温で穏やかに回転させて一晩インキュベートします。
  9. 翌日、組織をAlexa Fluor 488結合ヤギ抗ウサギIgG二次抗体およびDAPIと共にインキュベートし、暗所で4°Cで2〜3時間核染色します。
  10. 角膜を PBS で 3 x 10 分間、穏やかな回転で洗浄します。
  11. 前述の角膜フラットマウントプロトコルに従ってください21,22
    1. スライドの端に角膜を置き、余分な液体を除去することにより、染色された角膜をスライドガラスに平らに取り付けます。
    2. 顕微鏡スライドの中央に角膜を、上皮側を下に向けてスライド表面に接触させて再配置します。
    3. 外科用フェザーブレードを使用して、周辺端から中心に向かって4つのまっすぐな切開(長さ1〜2 mm)を行い、半象限を作成します。
    4. 20 μLの封入剤を塗布し、8 mmのガラスカバーガラスを角膜の上に置きます。
    5. カバーガラスをそっと押し下げて気泡を取り除き、角膜のしわを防ぎます。
    6. サンプルを室温で暗所で保管して乾燥させます。
    7. カバーガラスの端を透明なネイルプロテクターで密封して自然乾燥を防ぎ、イメージングの準備が整うまでスライドを暗所に保管します。

6. イメージング

  1. 20x/1.00 NAの水浸漬対物レンズを備えた正立2光子共焦点顕微鏡を使用して共焦点顕微鏡を実行します。
  2. フラットマウントされたサンプルを顕微鏡ステージに置き、20x/1.00 NA水浸対物レンズをセットアップします。
  3. 部屋の照明を暗くし、顕微鏡を不透明な黒い布で覆い、イメージング中の外部光の干渉を最小限に抑えます。
  4. Alexa Fluor 488 nmレーザーチャネルを使用して角膜神経を視覚化し、DAPI 405 nmレーザーチャネルを使用して細胞核を検出します。
  5. フレームサイズを1,536 x 1,536に、ピンホールを1エアリーユニット(AU)に、スキャン速度を1.02μsに設定します。双方向スキャンを有効にし、2倍平均化を適用します。
  6. マスターゲイン(~750 V)を調整し、レーザー出力強度を最小限に抑えて、光退色や光毒性を防ぎながら、鮮明な画像キャプチャを確保します。
  7. Zスタックイメージングを実行して、角膜の全厚をキャプチャします。 最初の 焦点面をサンプルの最前方に設定し、 最後 焦点面を最も後方の側面に設定します。
  8. Zスタックを 0.8 μm または 1.0 μmのステップ間隔で取得し、サンプルあたり合計 約60〜80 スタックをキャプチャします。
  9. 角膜神経密度評価
    1. Imaris ソフトウェアを使用して角膜神経密度を分析します。
    2. ボリュームの寸法を確認して、画像全体の厚さを確認します。
    3. ボリュームレンダリングオプションを有効にして、3D再構成を生成します。
    4. 最大強度投影法を作成して、Zスタックを2Dビューに変換して、視覚化と定量化を行います。
    5. 客観的な評価を確実にするために、盲検評価者によって角膜神経密度を 0-10 スケールで等級付けします。

7. 統計分析

  1. Shapiro-Wilk 検定と Kolmogorov-Smirnov 検定を使用してデータ分布を評価します。
  2. データの大部分が正規分布に従う場合は、結果を平均±標準偏差 (SD) として表示します。
  3. 2 つのグループ間の比較には、スチューデントの t 検定を適用し、3 つ以上のグループを含む分析には、一元配置分散分析とそれに続く Tukey の多重比較検定を使用します。
  4. 統計的に有意な 0.05 < p 値とします。

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結果

特に指定がない限り、すべての実験は3回独立して実施され、各反復にはグループあたり3〜4匹のマウスが含まれていました。

ブピバカイン治療後の角膜神経密度の有意な低下
標的角膜感覚神経枯渇の影響を体系的に評価するために、免疫標識と共焦点顕微鏡を使用して角膜神経密度を評価しました。マウスは、角膜神経の完全性の調節におけるさまざまな送達経路の有効性を比較するために、ブピバカインを単独で、または局所適用と組み合わせて15日間隔日結膜下注射を受けました。結膜下注射は忍容性が高く、出血、漏出、逆流の証拠はありませんでした。注射時に一過性の水疱が観察され、マウス結膜下コンパートメントへの薬物投与が成功したことを示しています。水疱は通常10〜15秒以内に消散し、実験モデルで一貫して観察されているように、この空間に導入された物質が世界中に拡散し、眼周囲組織全体に分布していることが確認されています。

15日目に角膜組織を採取し、神経マーカーであるβ-チューブリンIIIの免疫染色を行い、角膜神経密度を視覚化およ...

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ディスカッション

角膜感覚神経は、眼表面の完全性の維持、上皮恒常性の調節、免疫応答の調節において極めて重要な役割を果たします。神経変性と炎症を特徴とする角膜神経炎は、糖尿病などの全身疾患で一般的に観察され、慢性高血糖が角膜神経喪失などの末梢神経障害の一因となります。研究によると、糖尿病性神経障害は、角膜感受性の低下、ドライアイ、創傷治癒障害、および神経栄養性角膜症のリスク増加につながることが実証されています 8,9,10,24、持続的な上皮欠損と微生物感染に対する感受性を特徴とする状態25,26。

レプチン欠損(ob/ob)マウスやレプチン受容体欠損(db/db)...

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開示事項

著者には宣言すべき利益相反はありません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5%ブピバカイン塩酸塩溶液 ファイザー株式会社米国NDC 00409-1162-01
30G針メーカー: BD Biosciences、フランクリン レイクス、ニュージャージー州、米国305106
33 G小型ハブ鈍針(ポイントスタイル3) ハミルトン社、ネバダ州リノ、米国7803-05
4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州ウォルサムD1306
ウシ血清アルブミンSigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイスA7906
C57BL/6J(野生型)マウス ジャクソン研究所.000664
CantrifugeローテーターThe Lab Depot, Inc. (米国ジョージア州ドーソンビル)R2020
クリアネイルプロテクターウェット&ワイルド該当なし
解剖顕微鏡(SMZ-160-TLED三眼ポート付きステレオ(解剖)顕微鏡)ステラサイエンティフィック(米国メリーランド州ボルチモア)1.1002E+12
エチレンジアミン四酢酸Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイスE6511
ヤギ抗ウサギ IgG Alexa Fluor 488 サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州ウォルサムA-11008
ハミルトン 10-μLシリンジハミルトン社、ネバダ州リノ、米国7635-01
高精度解剖マイクロハサミサーモフィッシャーサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州ウォルサム08-953-1B
イソフルランパターソン獣医、米国07-890-8115
イソフルラン気化器Kent Scientific、米国VETFLO1205S
塩酸ケタミンDechra Veterinary Products、オーバーランドパーク、カンザス州、米国DP00050
キムワイプ糸くずの出ないティッシュペーパーKimberly-Clark Professional、米国ジョージア州ロズウェル34155
顕微解剖鉗子カーブフロント(摘出用)Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイスF4142-1EA
マイクロ解剖鉗子ストレートフロントSigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイスF4017
ペトリ皿(100 mm)サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州ウォルサム263991
ペトリ皿 (35 mm)AVANTOR は、VWR International (米国ペンシルベニア州ラドナー) 経由です。25373-041
リン酸緩衝生理食塩水 トーマス・サイエンティフィック、米国ニュージャージー州スウェーデスボロC987D24
ProLong ゴールド アンチフェード マウンタントサーモフィッシャーサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州ウォルサムP36930
ウサギ抗&β;-チューブリンIIISigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス) T2200
ラウンドカバースリップドイツガラス(8mm)サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州ウォルサム50-949-314
メスのハンドルSigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス) S2896-1EA
スライド、顕微鏡Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス) S8902-1パック
スナップキャップ低保持マイクロ遠心チューブサーモフィッシャーサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州ウォルサム3453
卓上遠心分離機RT6000B Sorvall Instrumentsサーモフィッシャーサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州ウォルサム3367898
外科用フェザーブレードワールド・プレシジョン・インスツルメンツ(米国フロリダ州サラソタ)504169 
トリプシン大豆寒天Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス) 22091
キシラジン Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス1236-20-8

参考文献

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