この研究では、ブピバカインを使用した角膜感覚神経枯渇の洗練されたモデルを確立し、角膜神経と細菌の接着への影響を明らかにします。このモデルは神経因性状態をシミュレートし、眼感染症における神経免疫相互作用に関する洞察を提供し、薬物送達、神経保護、免疫調節、遺伝子改変研究への応用を提供します。
このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。
この記事について
サマリー
要約
角膜感覚神経は、眼表面の完全性と免疫防御機構をサポートする上で極めて重要な役割を果たします。この神経支配の喪失は、微生物の侵入に対する脆弱性の増加と関連していますが、角膜への細菌の付着に対する神経枯渇の正確な寄与は十分に特徴付けられていません。ここでは、長時間作用型ナトリウムチャネル遮断薬であるブピバカインを使用した選択的角膜感覚神経抑制のための再現性があり時間的に制御された方法を提示します。結膜下送達経路と局所送達経路を組み合わせることにより、この二重適用戦略は堅牢で持続的な除神経を実現し、変化した感覚入力が細菌のコロニー形成に対する角膜上皮感受性にどのような影響を与えるかを正確に調査できます。
このモデルを使用して、感覚除神経が、異なる接着メカニズムを持つ3つの臨床的に関連する病原体である黄色 ブドウ球菌、表 皮ブドウ球菌、および緑膿 菌の微生物接着動態にどのように影響するかを調査します。実験室のワイプブロッティング法による標準化された細菌接種により、角膜表面への均一な沈着が保証され、その後細菌の接着が定量的に評価されます。ブピバカイン誘発性神経枯渇は、角膜神経密度の低下および細菌接着の増加と相関しており、感覚枯渇と微生物感受性との間の機能的関連性が確認されています。
このアプローチは、糖尿病性神経障害や神経栄養性角膜炎などの神経障害状態をシミュレートすることにより、眼感染症における神経免疫相互作用を研究するための新しい枠組みを提供します。この結膜下注射戦略は、感染モデルを超えて、眼薬の薬物動態、神経保護介入、免疫調節を調査するための多用途のプラットフォームを提供します。さらに、CRISPR/Cas コンストラクトやウイルスベクターの結膜下送達などの遺伝子改変研究にも適応でき、眼科研究や治療における応用が広がります。
概要
角膜感覚神経支配は、眼表面の完全性と免疫恒常性を維持する上で重要な役割を果たします。角膜は、体内で最も神経支配された組織の1つであり、主に三叉神経の眼科部門によって供給されます1。これらの感覚神経は、侵害受容とまばたき反射を媒介するだけでなく、上皮増殖、創傷治癒、および免疫監視も調節します2,3。したがって、感覚神経支配の混乱は角膜バリアを損ない、眼表面の微小環境を変化させ、微生物感染に対する感受性を高める可能性があります。
角膜感覚機能障害は、糖尿病などの全身状態に関連しており、ドライアイ疾患、糖尿病性角膜症、神経栄養性角膜炎、術後合併症などの眼の病状に寄与します 3,4,5,6,7,8,9,10
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
プロトコル
動物が関与するすべての手順は、視覚眼科研究協会によって確立された基準に従って実施され、ニューイングランド検眼大学の施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認され、実験動物の人道的なケアと使用に関するPHSポリシーを遵守しました。6〜8週齢の雄と雌のC57BL / 6J(野生型、系統番号000664)マウスをジャクソン研究所から採取し、マウスに正常な概日リズム(12時間の明暗サイクル)で繁殖させ、食物と水を与えました。すべての手順を通じて無菌技術を維持します。
1.結膜下注射のための動物製剤
- 校正された気化器を介して酸素中の2〜3%イソフルランを使用して麻酔を誘発します。つま先を軽くつまむことに対する反射反応がないかどうかをチェックして、麻酔の深さを監視します。
- 動物に重度の不快感や苦痛の兆候がないか継続的に観察してください。
- 苦痛が観察された場合は、5%イソフルランで深部麻酔を誘発し、無反応を確認します。
- 安楽死を確実にするために子宮頸部脱臼を行います。
- それ以外の場合は、下流の解析で湾曲した摘出鉗子を使用してすぐに摘出を実行してください。
2.結膜下注射による角膜神経ブロック
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
結果
特に指定がない限り、すべての実験は3回独立して実施され、各反復にはグループあたり3〜4匹のマウスが含まれていました。
ブピバカイン治療後の角膜神経密度の有意な低下
標的角膜感覚神経枯渇の影響を体系的に評価するために、免疫標識と共焦点顕微鏡を使用して角膜神経密度を評価しました。マウスは、角膜神経の完全性の調節におけるさまざまな送達経路の有効性を比較するために、ブピバカインを単独で、または局所適用と組み合わせて15日間隔日結膜下注射を受けました。結膜下注射は忍容性が高く、出血、漏出、逆流の証拠はありませんでした。注射時に一過性の水疱が観察され、マウス結膜下コンパートメントへの薬物投与が成功したことを示しています。水疱は通常10〜15秒以内に消散し、実験モデルで一貫して観察されているように、この空間に導入された物質が世界中に拡散し、眼周囲組織全体に分布していることが確認されています。
15日目に角膜組織を採取し、神経マーカーであるβ-チューブリンIIIの免疫染色を行い、角膜神経密度を視覚化およ.......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
ディスカッション
角膜感覚神経は、眼表面の完全性の維持、上皮恒常性の調節、免疫応答の調節において極めて重要な役割を果たします。神経変性と炎症を特徴とする角膜神経炎は、糖尿病などの全身疾患で一般的に観察され、慢性高血糖が角膜神経喪失などの末梢神経障害の一因となります。研究によると、糖尿病性神経障害は、角膜感受性の低下、ドライアイ、創傷治癒障害、および神経栄養性角膜症のリスク増加につながることが実証されています 8,9,10,24、持続的な上皮欠損と微生物感染に対する感受性を特徴とする状態25,26。
レプチン欠損(ob/ob)マウスやレプチン受容体欠損(db/db).......
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
開示事項
著者には宣言すべき利益相反はありません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.5%ブピバカイン塩酸塩溶液 | ファイザー株式会社米国 | NDC 00409-1162-01 | |
| 30G針 | メーカー: BD Biosciences、フランクリン レイクス、ニュージャージー州、米国 | 305106 | |
| 33 G小型ハブ鈍針(ポイントスタイル3) | ハミルトン社、ネバダ州リノ、米国 | 7803-05 | |
| 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩 | サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州ウォルサム | D1306 | |
| ウシ血清アルブミン | Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス | A7906 | |
| C57BL/6J(野生型)マウス | ジャクソン研究所 | .000664 | |
| Cantrifugeローテーター | The Lab Depot, Inc. (米国ジョージア州ドーソンビル) | R2020 | |
| クリアネイルプロテクター | ウェット&ワイルド | 該当なし | |
| 解剖顕微鏡(SMZ-160-TLED三眼ポート付きステレオ(解剖)顕微鏡) | ステラサイエンティフィック(米国メリーランド州ボルチモア) | 1.1002E+12 | |
| エチレンジアミン四酢酸 | Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス | E6511 | |
| ヤギ抗ウサギ IgG Alexa Fluor 488 | サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州ウォルサム | A-11008 | |
| ハミルトン 10-μLシリンジ | ハミルトン社、ネバダ州リノ、米国 | 7635-01 | |
| 高精度解剖マイクロハサミ | サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州ウォルサム | 08-953-1B | |
| イソフルラン | パターソン獣医、米国 | 07-890-8115 | |
| イソフルラン気化器 | Kent Scientific、米国 | VETFLO1205S | |
| 塩酸ケタミン | Dechra Veterinary Products、オーバーランドパーク、カンザス州、米国 | DP00050 | |
| キムワイプ糸くずの出ないティッシュペーパー | Kimberly-Clark Professional、米国ジョージア州ロズウェル | 34155 | |
| 顕微解剖鉗子カーブフロント(摘出用) | Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス | F4142-1EA | |
| マイクロ解剖鉗子ストレートフロント | Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス | F4017 | |
| ペトリ皿(100 mm) | サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州ウォルサム | 263991 | |
| ペトリ皿 (35 mm) | AVANTOR は、VWR International (米国ペンシルベニア州ラドナー) 経由です。 | 25373-041 | |
| リン酸緩衝生理食塩水 | トーマス・サイエンティフィック、米国ニュージャージー州スウェーデスボロ | C987D24 | |
| ProLong ゴールド アンチフェード マウンタント | サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州ウォルサム | P36930 | |
| ウサギ抗&β;-チューブリンIII | Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス) | T2200 | |
| ラウンドカバースリップドイツガラス(8mm) | サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州ウォルサム | 50-949-314 | |
| メスのハンドル | Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス) | S2896-1EA | |
| スライド、顕微鏡 | Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス) | S8902-1パック | |
| スナップキャップ低保持マイクロ遠心チューブ | サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州ウォルサム | 3453 | |
| 卓上遠心分離機RT6000B Sorvall Instruments | サーモフィッシャーサイエンティフィック、米国マサチューセッツ州ウォルサム | 3367898 | |
| 外科用フェザーブレード | ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ(米国フロリダ州サラソタ) | 504169 | |
| トリプシン大豆寒天 | Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス) | 22091 | |
| キシラジン | Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州セントルイス | 1236-20-8 |
参考文献
- Belmonte, C. Pain, dryness, and itch sensations in eye surface disorders are defined by a balance between inflammation and sensory nerve injury. Cornea. 38 (Suppl 1), S11-S24 (2019).
- Müller, L. J., Marfurt, C. F., Kruse, F., Tervo, T. M. T.
アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
再版と許可
タグ
