口腔内に形成された口腔扁平上皮がん腫瘍を外科的に切除する独自の方法をここに示します。
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この記事について
サマリー
要約
現在、頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)の最も一般的な形態である口腔扁平上皮癌(OSCC)の第一選択治療は外科的切除であり、その後化学放射線療法などのリスク適応治療が行われます。しかし、現在の治療標準やチェックポイントブロッケードなどの新治療法の登場により、進行性再発疾患の生存期間は依然として高いままであり、頭頸部がんの有病率は今後数年間で増加し続けると予測されています。したがって、新規治療法に加えて、現在の標準治療法のさらなる調査が、HNSCC患者に潜在的かつ有望な治療選択肢を翻訳するために必要です。前臨床モデルは、潜在的な治療介入の安全性と有効性を評価するために活用されます。残念ながら、現在の前臨床モデルは、放射線治療、化学療法、免疫療法などの非手術的治療法が中心であるため、多くの患者が受ける外科的手技を完全には反映していません。さらに、既存の外科モデルは、オルトトピック部位に腫瘍を形成するための追加試薬や、腫瘍切除のための顕微鏡手術の必要性によって制約を受けています。これは治療法の調査や局所腫瘍再発および治療抵抗性に関する洞察を得るために、改良・簡素化された前臨床モデルの作成を正当化することを意味します。本記事では、OSCCにおける標準的なケアを再現した、臨床的に関連した新しいシンジェニックなオルソトピックマウスサブコートリ切除モデルについて説明しています。このモデルは既存のモデルを簡素化し、頬粘膜腫瘍の外科的切除後の再発を測定可能にします。このモデルの使用は、OSCC患者の腫瘍再発および治療抵抗性に関する貴重な知見をもたらす可能性があります。この前臨床モデルの確立は、OSCCが切除後の補助療法にどのように反応するかを調査するさらなる研究への道を開き、患者が一般的にその後の治療を開始する臨床的に関連性の高い時期に腫瘍の状態を捉えることを目指します。
概要
喉頭、咽頭、咽下部、鼻腔、唾液腺、口腔に起源を持つ悪性腫瘍は頭頸部がんに分類されます。頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)は、これらの症例の90%以上を占めており、これらの解剖部位を覆う扁平上皮細胞から発生します1。より具体的には、口腔扁平上皮癌(OSCC)は口腔内領域に限定される悪性腫瘍です。2022年、頭頸部がんは世界で6番目に多いがんであり、世界中で推定947,000件の新規症例と年間482,000人の死亡が報告されています。
外科的切除は、OSCCを含む頭頸部がんの第一選択治療法であり、その後に化学放射線療法1,3,4が続くことが多いです。これらの標準治療法は局所的に限定的または初期段階の症例では治療効果が期待できますが、OSCC患者では依然として局所性および遠隔性再発率が高いです。実際、OSCC患者の3分の2未満が5年以上生存し、重大な副作用を経験しています5,6,7。手術中に生じた外傷ストレスが、組織損傷や創傷治癒に関わる生理学的プロセスを引き起こすという証拠が増えています8,9。さらに、外科的切除が免疫機能障害に寄与し、それが再発の可能性に寄与する可能性があることも報告されています。
OSCCの第一選択治療として大多数の患者が外科的切除を受けているにもかかわらず、腫瘍の確立やサブ全切除を標準化し、腫瘍再発の免疫学的メカニズムを保存するOSCCの前臨床オルトトピック切除モデルの必要性が依然として存在し、この分野の研究に重要な文脈を提供する必要があります。11。12、13。これまでに報告された動物切除モデルには、手術の免疫抑制効果を研究するために用いられた4T1乳腫瘍切除モデルがあります14。OSCCでの研究では、マウス側翼における異所性MOC1-OVA腫瘍小全切除モデルの使用が報告されています。オルトトピック部位では、HPV口咽頭SCC細胞株mEERL95を用いて、切除および再発モデルのための精神下腫瘍の確立や、さらに研究のためにドレンリンパ節を未生マウスに外科的に移植するなどが用いられています16。免疫不全マウスを用いた再発を調査した関連するオルトトピック研究も報告されています。
ここに、切除後1週間以内に観察された、免疫能力があり、シンゲニックでオルトトピックのOSCC前臨床モデルを用いた腫瘍切除生存手術および再発の新たに確立されたプロトコルを示します。この手術は、顕微鏡手術を行わず、腫瘍を除去し、腫瘍を確立するために細胞や基底膜マトリックスを追加する必要のないマウス口腔がん腫瘍細胞株(MOC2)を用いることで、既存のモデルをさらに簡素化します。
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プロトコル
以下の処置および動物の飼育・維持は、テキサス大学ヒューストン健康科学センター(UTHealth)の実験動物医療・ケアセンターで、機関の動物福祉委員会と連携して実施されました。関連するプロトコルは、施設動物ケア・利用委員会(IACUC)によって承認されており、米国公衆衛生局の実験動物の人道的ケアおよび利用に関する方針に定められた原則および倫理ガイドラインに準拠しています。以下のセクションに進む前に、地域のIACUCが定めるすべての方針を遵守し、IACUC承認の動物使用プロトコル(または同等のもの)が整備されていることを必ず確認してください。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。
1. 直位性頬粘膜口腔腫瘍の確立
注:この特定のプロトコルでは、腫瘍17を確立するためにMOC2細胞を用いました。しかし、他の細胞株やタイプも用いられることがあります。腫瘍を生 体内 で確立するために必要な腫瘍細胞の数は細胞株に依存し、手術接種前に最適化されるべきです。
- 腫瘍細胞培養が約80%の合流に達すると、培養培地を吸引して廃棄して細胞を採取します。
- 残った血清を除去するには、マグネシウムとカルシウムを含まないリン酸塩バッファー生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄し、結合した細胞で血管(例:フラスコ)表面を完全に覆うほどの容量を保ちます。
- 培養フラスコに0.05%のトリプシンを加え、フラスコの底を十分に覆います。細胞剥離のために37°Cで5%のCO2 を含んで約5分間培養します。
注意:細胞剥離に必要な潜伏期間(2〜15分)は、使用する細胞(すなわち細胞株)によって異なる場合があります。しかし、長期間のトリプシン曝露は細胞に損傷を与える可能性があります。十分な細胞剥離に時間が必要な場合は、定期的に注意深く観察してください。 - 細胞剥離が観察された後、完全な培地で使用されるトリプシンの少なくとも2倍の量で焼き入れ(例:5 mLのトリプシンの場合、少なくとも10 mLの完全な培地で焼き入れ)。
- セル懸濁液を室温で350 x g で5分間遠心分離し、上清液を吸引します。
- 冷たいPBSで再懸眠し、数えるためのアリコートを取る。1.5〜1.6の手順を繰り返し、残ったメディアを除去するために追加の洗浄を行います。
- 追加のPBSを用いて、接種に最適な細胞濃度(例:30μL体積あたり3×10、4 MOC2細胞)を調整します。使用準備が整うまでセルの懸流は氷の上に置いておきましょう。
- マウスを1%〜3%のイソフルランで麻酔し、小動物のチャンバーで1.5L/minの酸素を補給します。
注意:脱毛は必須ではありませんが、接種部位のイメージや接種の一貫性向上のためにこの段階で推奨されます。この段階で取り除く場合は、ステップ3.3-3.5の指示に従ってください。 - 細胞懸濁液を十分に混ぜて細胞の均等な分布を確保し、0.3mLのインスリン注射器に集めます。
- 鎮静されたマウスの後頭部を片手で掴み、マウスの前側がハンドラーに向き、頭が上を向いて口を開けやすくして拘束します。
- 開いた口に、左下顎前庭に向かって下向きの角度で慎重に注射器を挿入します。下部頬粘膜から針を刺し続けます。
- この領域に30μLの細胞懸濁液を投与し、慎重に注射器を取り外し、5秒間そのまま保持し、その後ゆっくりと注射器を抽出して、除去時に追加の細胞懸濁液を追跡しないようにします。
- 接種後、マウスが身体的・行動的に正常であることを確認しましょう。
- マウスの体重と腫瘍の成長をバランスとデジタルキャリパーでそれぞれ監視してください。腫瘍の発生を週2回または指定されたプロトコルに従って定期的にモニタリングしてください。
2. 手術のための材料のセットアップ
注意:不稔の維持を確実にするために、手術の準備や整理を支援するために、少なくとも1名以上の外科医または手術助手の同席を強く推奨します。
- 閉め可能なドアがあり、通行が制限された清潔な処置室を選びましょう。
- 新しいケージには清潔で乾いた寝具とペーパータオルの巣を入れ、電気ウォーマーの上に部分的に置いて予温めます。
- ビーズ滅菌器を動作温度(250〜265°C)まで温めます。
- イソフルラン誘導室と携帯型麻酔装置を設置し、適切なノーズコーンを備え、イソフルラン、酸素、関連するスカベンジングシステムに接続します。
注意:誘導チャンバーを使用する際は、約3%イソフルランの設定でマウスを麻酔してください。鼻のコーンを使う際は、1%〜2%のイソフルランでマウスに麻酔をかけます。 - 水加熱された手術用パッドを38.9°Cにし、パッドの頭部にイソフルラン源を固定します。
- 作業用の面と手術用パッドは消毒剤で消毒し、作業スペースには清潔なベンチパッドを敷きましょう。
図1:腫瘍切除のための選択された手術器具および材料。 (1) 手術用手袋、(2) ドレープ、(3) ガーゼパッド、(4) 0.3 mLインスリン注射器、(5) タオルドレープ、(6) イソプロピルアルコール綿棒パッド、(7) メス刃、(8) 刃なしメス、(9) ハートマン止血鉗、(10) 蚊用止血鉗、(11) 微小解離鉗子、(12) 微小解離鉗子 (13) ブラウン・アドソン鉗子 (14) 微小解離鉗子、(15) 綿先端のサブリケーター、(16) トリマー (17) 4-0 コーティングビクリル縫合、(18) 0.25% ブピバカイン、(19) 眼潤滑軟膏。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
3. 動物の手術準備
- 処置の24時間前にマウスの体重を測定し、指定されたプロトコルに従って適切な麻酔薬と鎮痛薬の用量を判断してください。
- 誘導室で約2分間麻酔し、その後手術の少なくとも30分前に鎮痛剤を投与します。これはマウスの首の後頭部に皮下注射されます。
- 接種時に行っていなかった場合や、以前に除去された髪が再生し始めた場合は、コットンチップのアプリケーターを使って腫瘍切除部位の髪に直接少量の脱毛クリームを塗り、手術中に切開部に毛が入らないように十分なマージンを保ちます。
- クリームを約10秒置き、乾いた清潔なガーゼで髪を拭き取ります。
- 残ったクリームは、生理食塩水または水で湿らせたガーゼで除去し、その後乾いた清潔なガーゼでその部分を乾燥させます。
注意:電子トリマーによる脱毛は許容されるものの、頭や首の周りの皮膚が薄く繊細なため、あまり好まれない代替方法です。トリマーを使う場合は、目などの敏感な部分を避け、たるんだ皮膚は張っておき、ネズミの怪我を防ぐようにしましょう。 - 全身鎮痛剤を皮下に投与し、切開部には局所鎮痛剤を投与します。
- 麻酔をかけたマウスを温熱パッドの上に置き、前方が上を向いて仰向けに寝かせます。ノーズはノーズコーンカバーのすぐ内側にあるはずです。
- 手技中に目の乾燥を防ぐため、マウスの両目に少量(目を覆う程度の)滅菌潤滑性眼軟膏を塗布します。
- 清潔なコットンチップのアプリケーターを使い、切除部位を70%イソプロピルアルコールで綿棒で拭き取り、その後10%ヨウ素を3回塗り、最後の検査後は70%イソプロピルアルコールでヨウ素を除去することを確認してください。
- 滅菌手袋と適切な個人用防護具(ローブ、ヘアカバー)を着用し、少なくとも18インチW×26インチの無菌フィールドを準備し、適切な道具や材料(滅菌綿ガーゼ、滅菌綿棒、滅菌生理食塩水、イソプロピルアルコールアプリケーター、外科用具)を並べます(図1)。
- マウスを滅菌用のカーテンで覆い、切断部位のすぐ上に殺菌ハサミでアクセス穴を開けます。
4. 確立された口腔腫瘍の外科的切除
注意:手術中、外科医または助手は麻酔下でマウスの呼吸や反射を確認し、適切な酸素供給を確保してください。必要に応じて獣医の指針や機関方針に従ってイソフルランを調整してください。
- 新しい外科用メスを使い、腫瘍のすぐ下、左顎線に沿って下顎下切開を行い、腫瘍の長さに沿って形成します(図2A,B)。
- ハートマン製血抑制器を慎重に使い、腫瘍に向かって開口部を広げてください。必要に応じて、滅菌ガーゼで血を拭き取ってください。
- 腫瘍の位置を特定し、鉗子を使って固定します(図2B)。
注意:この時点でアシスタントが鉗子を使って腫瘍部位へのアクセスを維持する(皮膚を引っ張る)の補助を行うことがあります。 - 外科用ハサミを使い、腫瘍の基部を切り取り、見えるすべての部分を切除します(図2C)。切除した腫瘍部位の皮膚を再配置し、4-0の長持ちビクリル縫合糸を用いて4〜6本の中断縫合で切開を閉じます(図2D)。
注意:皮膚を保護しすぎてネズミを傷つけないように注意し、また後の抜糸時の怪我を防ぐために注意してください。 - 追加の手術を続ける場合は、手術器具の表面を70%イソプロピルアルコールで洗浄し、加熱ビーズ滅菌器に10〜15秒置いてから追加使用を行ってください。同じ器具セットを用いて最大5匹のマウスや、機関のガイドラインや慣行で指定されたマウスの手術にも使用できます。
注:切除腫瘍は、特定の研究計画18,19(図2E)に従い、処理およびさらなる解析(組織学および画像診断のための固定、フローサイトメトリー表現型解析のための組織解離および免疫染色)のために廃棄または持ち出すことができます。
図2:口腔腫瘍は下部頬粘膜を通じて経口から形成され、下顎下アプローチ で 治癒合併症なしで切除可能です。 (A) 口腔内に腫瘍(赤い矢印)が確立されている。(B)腫瘍を露出させる下顎下切開。(C)切除された腫瘍。(D) 複数回中断されたビクリル縫合による創傷閉合。(E) 切除腫瘍。(F)経口接種の概要図。画像はBioRenderで作成されました。 この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。
5. 切除後のケア
- 切開を閉じた後、麻酔流量を0%に切り、マウスが意識を取り戻し始めるまで(5分未満)1.5L/分のO2 のみを継続します。数分間動かず反応しない場合は、獣医介入に関する機関の方針を参照してください。
- ネズミを温めたケージに優しく移します。術後の意識や可動性のモニタリングを継続してください。10分ほどで完全に意識と動きを取り戻すはずです。
- 承認されたプロトコルおよび機関方針に従い、毎日の術後モニタリングを実施してください。
- 手術直後は、水に浸したペレットを手軽な容器(例:プラスチック製の計量船)に直接ケージに入れて、マウスに「柔らかい」餌を提供します。合併症がなければ、次の通常の給餌時に通常の固形食を再開できます。
- マウスは手術後最初の48時間(2日間)は1日2回、手術後最低96時間(4日間)は1日1回モニタリングします。その後、通常のモニタリングスケジュール(週2回)を再開してください。
- 手術後7日目には、麻酔下で縫合糸を外し、マウスを切ったり怪我をさせたりしないように注意してください。
- マウスのモニタリングを継続し、人道的な基準に達したら、承認されたプロトコル安楽死基準およびアメリカ獣医師会に従って動物を人道的に安楽死させてください。
注:腫瘍成長動態および動物生存率の統計的解析は、この方法論において重要な指標です。カプラン・マイヤー生存曲線については、統計解析ソフトウェア を通じて 対数ランク/マンテル・コックス検定を用いた統計解析が行われました。腫瘍成長曲線については、シダークによる二方向ANOVAによる多重比較検定を用いて、未切除群と切除群間の腫瘍大きさを比較しました。P値は0.05未満と有意とされました。
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結果
MOC2マウス頬粘膜からの観察
MOC2細胞株を用いて、マウス口腔内頬粘膜に腫瘍が確立されました(図2A-F)。確立された原発腫瘍は25〜36 mm2の腫瘍大で切除されました。切除後、マウスは通常5〜10分以内に完全な可動性を取り戻しました。その後、マウスは術後のケアのためにモニタリングされ、治癒と回復の確認、腫瘍再発の観察が行われました。この期間中、マウスは縫合の変形の兆候と切開部周辺の軽い赤みを示しました。しかし、術後の回復中に安楽死基準に基づく人道的エンドポイント(すなわち体重20%減少)に到達したマウスはいません。縫合の痕跡は見られたものの、すべての部位は閉鎖されており、すべてのマウスは健康で、追加の傷や感染の兆候はありませんでした。手術後7日目に縫合糸を抜く際、結びすぎた縫合糸は抜きにくく、除去時に動物の怪我のリスクが生まれることが観察されました。切開部で観察されたわずかな...
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ディスカッション
本記事では、マウスの口腔内口腔粘膜における腫瘍の設立および亜全切除のための簡単な手技について説明します。過去の研究でも、切除腫瘍の下流解析や、局所再発や局所・遠隔転移の調査のためにマウスの舌、頬粘膜、口底を通じて腫瘍を確立する可能性が示されており、それぞれに限界があるとされています(12,13)。しかし、この新たに確立された方法は、外科的モデリングを簡素化する高度なトランスレーショナルな口腔腫瘍切除モデルを提供します。ここでは、マトリジェルや同等の基底膜マトリックスの追加使用を必要としない口腔がん細胞株(MOC2)を用いて口腔内に腫瘍が一貫して確立されます。さらに、過去の研究では、腫瘍浸潤の深さを可視化することで、これらの接種部位における口腔腫瘍の妥当性を確立し、特徴付けてきました。オルトトピック口腔部位における腫瘍接種の確立された手順に従い、このモデルは真に侵襲的な口腔腫瘍が口腔内の接種部位から外側に侵入するという考えに基づいています
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謝辞
この研究は1R21DE034543(NIH-NIDCR)によって資金提供されました。また、UTHealth実験動物医療・ケアセンターの管理、獣医、メンテナンススタッフの皆様にも感謝いたします。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 0.05%トリプシン | コーニング | 25-052-CL | 0.53 mM EDTA、1 × [-] 炭酸水素ナトリウム |
| 0.25%ブピバカイン塩酸注射 | マッケソン | 1077280 | 2.5mg/kg-1mg/kg、ID/SC 20-30uL |
| 0.9%塩化ナトリウム、USP | マッケソン | 161736 | 5 mL/kg、静脈注射、静脈内投与 1.5 mL |
| 23G針 | ベクトン・ディキンソン社[マッケソン] | 402 | |
| 4-0 コーティングされたヴィクリル | マッケソン | 100700 | |
| 50 mL円錐形チューブ | サーモ・サイエンティフィック | 33965 | |
| 吸収性ベンチパッド | VWR | 115-0684 | |
| アルコールスワブ イソプロピルアルコール 70% | ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー [VWR] | 326895 | |
| オートクレーブパウチセルフシール5およびfrac14;”×10" | マッケソン | 960944 | |
| バランス | オハウス [VWR] | 30253019 | |
| バイオクレーブ・ミニ | ベンチマーク・サイエンティフィック | B4000-M | |
| ブラウン・アドソン鉗子 | ロボズ [VWR] | RS-5231 | |
| コットンチップのアプリケーター 滅菌 6インチ | マッケソン | 999736 | |
| ダルベッコのリン酸緩衝塩水/改良型 | シチバ | SH30028.02 | [-] カルシウム、[-] マグネシウム |
| エティカ XRÒ* | フィデリス動物健康 | NDC 86084-100-30 | 3.25 mg/kg(特別投与量) |
| 汎用ドレープ | マッケソン | 68107 | |
| ガラスビーズ滅菌器 | VWR | 75999-324 | |
| ガラスビーズ | VWR | 75999-332 | |
| ハートマン止血器 | ファインサイエンスツールズ [VWR] | 13003-10 | |
| 高品質で携帯可能な麻酔装置 | パターソン獣医 | 07-8915662 | |
| イソフルラン、USP | マッケソン | 803250 | 4-5%の誘導、1-3%の維持 |
| MedLEDÒクローム(ヘッドライト) | KLSマーティン | ML-MC7-HT-HK-X21 | |
| 微小解離鉗子 | ロボズ [VWR] | RS-5174 | |
| マイクロ解剖ハサミ | ロボズ [VWR] | RS-5914 | |
| モノジェクトインスリン注射器 | カーディナル・ヘルス [マッケソン] | 8881600145 | |
| 蚊用止血鉗子 | ロボズ [VWR] | RS-7100 | |
| ネアボディクリーム 脱毛剤 | 教会とドワイト社 | ||
| ニードルホルダー | ロボズ [VWR] | RS-7154 | |
| PVP準備液 10%ポビドンヨウ素 | マッケソン | 911740 | |
| メス | ロボズ [VWR] | RS-9843 | |
| スカルペルブレード カーボンスチールNo.10 | マッケソン | 862685 | |
| 小動物用加熱パッド | K&Hペット製品 [Amazon] | 9 x 12インチ 20W | |
| スモールマウスチャンバー | パターソン獣医 | 07-893338 | |
| スモールノーズコーン | パターソン獣医 | 78909681 | |
| ステリ・ドレープ | マッケソン | 5713 | |
| 滅菌ガーゼパッド 2インチx2」–12プライ | Dukal Corporation [Amazon] | 参考文献:1212 | |
| 滅菌潤滑眼軟膏 | マッケソン | 730979 | |
| 手術用手袋 | マッケソン | 20-2070N | |
| シリンジ 1cc | マッケソン | 1065984 | |
| トレーサブルデジタルカーボンファイバーキャリパー | フィッシャー・ブランド | 15-077-957 | |
| トリマーキット | WAHL【アマゾン】 | ブラヴミニ |
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