方法論記事

デュアルベクター形質導入細胞の精製のためのロイシンジッパーベースの細胞選別

DOI：

10.3791/68628

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2025年10月24日

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1City of Hope Los Angeles and National Medical Center, 2Lymphoma and Cellular Therapy Services, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 3Department of Hematology and Hematopoietic Cell Transplantation, City of Hope National Medical Center

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、共形質導入されたT細胞の混合物から二重形質導入T細胞を選択的に精製するためのプロトコルについて説明します。このアプローチは、2つのレトロウイルスベクターを組み合わせたもので、それぞれがペアロイシンジッパーベースの細胞選別方法の1つの成分をコードし、デュアルベクター形質導入細胞の選択的免疫磁気精製を可能にします。

要約

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キメラ抗原受容体 (CAR) T 細胞を含む養子 T 細胞療法は、血液悪性腫瘍に対して優れた臨床活性を示しており、固形腫瘍悪性腫瘍の治療に有望であることが示されています。これらの成功にもかかわらず、標的抗原の喪失または発現の弱さ、T 細胞枯渇の発症、免疫抑制腫瘍微小環境の存在など、治療の成功を制限する T 細胞免疫療法に対する耐性の複数のメカニズムが特定されています。これらの耐性メカニズムを克服するために、複数の細胞工学戦略が開発されています。ただし、耐性の複数のメカニズムが同時に発生する可能性があるため、抗腫瘍活性を最適化するには複数の工学戦略を組み合わせる必要があります。ベクターパッケージングの制約により、T細胞への大量の遺伝情報の送達が制限され、複数の改変されたコンストラクトを共発現する際に課題が生じます。ここでは、T細胞を2つのベクターで共形質導入して複数の導入遺伝子をコードし、それによって操作された機能の数を増やすためのプロトコルについて説明します。ジップソートと呼ばれるロイシンジッパーベースの細胞ソーティング方法論を共発現させることにより、2つの異なるベクターを組み込んだ二重形質導入細胞の選択的免疫磁気精製を指示します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CAR T 細胞療法は、B 細胞白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫の治療に革命をもたらしました 1,2。CAR T 細胞は固形腫瘍悪性腫瘍についても研究されています3。しかし、CAR標的抗原分子の発現不良または喪失、T細胞機能障害(枯渇)の発症、腫瘍微小環境による能動免疫抑制、腫瘍微小環境へのT細胞輸送の制限および持続性など、CAR T細胞療法の失敗の再発メカニズムが特定されています3,4,5,6 .これらのCAR T細胞耐性メカニズムのそれぞれを克服しようと試みるために個々の工学的ソリューションが考案されてきましたが3、レトロウイルスおよびレンチウイルスベクターシステムの遺伝子パッケージング能力が限られているため、複数の制御された機能を細胞治療製品に導入して複数の耐性メカニズムを同時に克服することは困難です7。

ベクターパッケージング能力の限界を克服するために、複数のベクターによるT細胞の共形質導入がますます使用されています。ベクター共形質導入は、前臨床試験8、9、10 、およびベクターパッケージングの限界を克服するためにCD19/CD22デュアルCAR T細胞を評価する最近の臨床試験で、論理ゲートおよび薬物制御T細胞工学戦略を研究するために使用されています11。しかしながら、共形質導入は、単一形質導入T細胞および二重形質導入T細胞の組み合わせを含む混合細胞産物を生成し、それが両方のベクターによってコードされる成分に依存する場合、産物の機能を損なう可能性があり、また、単一形質導入T細胞間の競合につながる可能性がある12。

これらの課題を克服するために、ヘテロ二量体化ロイシンジッパー(それぞれが2つの共形質導入ベクターの1つから発現)を使用して、二重形質導入細胞のシングルステップ免疫磁気精製を指示するジップソートと呼ばれる方法論を開発しました13。このプロトコルでは、ジップソート法、レトロウイルス上清の産生と濃縮、T細胞の活性化と共形質導入、および二重形質導入細胞の免疫磁気精製(ジップソート)を組み込んだレトロウイルスベクターを構築する方法について説明します。

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プロトコル

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動物実験は、COH施設動物管理および使用委員会によって承認されたプロトコル#23145に基づいて、シティ・オブ・ホープ(COH)のパービン動物研究所で、およびMSKCC施設動物管理および使用委員会によって承認されたプロトコル#99-07-025に基づいてメモリアル・スローン・ケタリングがんセンター(MSKCC)のビバリウムで実施されました。ヒトT細胞は、シティ・オブ・ホープ献血者センターから入手した白血球減少フィルターからFicoll-Paque精製され、シティ・オブ・ホープ治験審査委員会によって承認されたプロトコル#24427に基づいて使用された、匿名化された末梢血単核細胞(PBMC)から単離されました。すべての手順は、施設のバイオセーフティ基準に従って実施されました。

1. ジップソートベクターデザイン

  1. 目的の遺伝子組み換え細胞に最適な発現ベクターを選択します。
    注:ジップソート法は、分泌ジッパーとキャプチャジッパーで構成され、どちらも異なるベクターから発現し、細胞内でペアになり、細胞表面にトラフィックして、両方のベクターを組み込んだ細胞の選択的精製を可能にします(図1A-D)13。分泌されたジッパーはベクター1から発現し、アフィニティータグを含んでいます。キャプチャージッパーはベクター2から発現し、分泌されたジッパーを細胞表面に保持します。ブロッキングジッパー修飾は、共有結合した第2ジッパーで構成され、分泌されたジッパーの非特異的な細胞外ジッパーペアリングをブロックします。ブロッキングジッパー修飾は、細長い細胞外ドメイン(通常はショートヒンジドメインよりも大きい細胞外ドメイン)を持つタンパク質にキャプチャジッパーを追加するときに、細胞外ペアリングを防ぐために必要です。
  2. 補足表1および補足ファイル1から分泌ジッパーとキャプチャジッパーのセットを選択して、ベクターをテストおよび構築します。
  3. 標準的な分子生物学技術を使用して、ジッパー配列をペア発現ベクターにクローンします13-2つのベクターのそれぞれは、アフィニティータグ分泌ジッパーまたはキャプチャジッパーのいずれかをコードします(図1D)。
    1. ジッパーコンストラクト配列については、 補足表1 および 補足ファイル1 を参照してください。ジッパー配列は、ポリシストロンメッセージの5'(N末端)に配置され、それらの発現を強化し、それによってソート収量を高めています。後続の導入遺伝子を下流に配置し、自己切断する2Aペプチドで分離します(図1D)。ただし、以前の実験では、高い発現が維持されている場合、ジッパーを3フィート構成で配置することに成功しています。

2. レトロウイルスの産生

  1. トランスフェクションの1日前に、Phoenix-Eco細胞(ATCC CRL-3214、マウス向ウイルス)またはPhoenix-Eco ɑ-V β-3細胞13 (Phoenix-Ecoの接着を強化するように設計されたɑ-V β-3の添加)または293Vec-RD11414 (ヒト向ウイルス)または293Vec-RD114 ɑ-V β-3細胞(293Vec-RD114の接着を強化するように設計されたɑ-V β-3の添加)を調製します。
    注:このプロトコルでは、ɑ-V β-3インテグリンによるパッケージングラインの修飾は必要ありませんが、この修飾により、組織培養フラスコへのこの細胞株の接着性が向上し、レトロウイルス上清の収集が容易になります。
    1. フェニックスまたは293Vec-RD114細胞を含むT175フラスコで細胞を0.25%トリプシン-EDTAと~80%コンフルエンスでトリプシン化します。
      1. 培地を除去し、接着細胞を10 mLのPBSで洗浄し、細胞を乱さないようにしてトリプシンを阻害する血清成分を除去し、5 mLの0.25%トリプシン-EDTAを加え、細胞を37°Cで5分間インキュベートします。
      2. 10%ウシ胎児血清(FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、および1%グルタMAX(完全DMEMと呼ばれる)を添加した5 mLのDMEMに細胞を解離して収集します。
      3. 15 mLのコニカルチューブで、4°Cで5分間340 x g で遠心分離することにより、細胞をペレット化します。 デカントメディア。
    2. 遠心分離ペレット細胞を10 mLの完全DMEMに再懸濁し、約1.5 x 10の10 cm組織培養皿にプレートします。6 Phoenix-Eco細胞、Phoenix-Eco ɑ-V β-3、293Vec-RD114細胞、または293Vec-RD114 ɑ-V β-3細胞を血球計でカウントします。
    3. プレートを軽く振ったり旋回させたりして細胞を均一に分布させ、37°Cで一晩インキュベートして細胞がプレートに付着するようにします。
  2. 約18〜24時間後、細胞が60%〜70%コンフルエントであり、健康で接着した細胞が樹状突起を示していることを確認します。
  3. 以下に説明するように、トランスフェクションキット(材料表)を使用して、レトロウイルスLZRSベクターコンストラクト(Addgene Plasmid #31601、EBNAベースのエピソーム安定トランスフェクション)またはPBベクターコンストラクト13(piggyBacトランスポゾンベースのゲノム安定インテグレーション、補足ファイル1)を使用して、Phoenix-Eco、Phoenix-Eco ɑ-V β-3細胞、293Vec-RD114、または293Vec-RD114 ɑ-V β-3細胞を安定にトランスフェクションします。
    1. トランスフェクション反応ごとに、2 μgのLZRSベクターDNAまたはPBベクターDNAと16 μLのエンハンサー試薬を300 μLのECバッファーに混ぜ合わせます。
    2. PBベクターコンストラクトを安定的に取り込むために、1 μgの高活性piggyBacトランスポザーゼベクターpCMV-hyPBase15 (Sanger Institute)も添加します。
    3. 5秒間穏やかにボルテックスし、室温で5分間インキュベートします。20 μLのトランスフェクション試薬を加え、10秒間ボルテックスし、室温で10分間インキュベートしてDNAミセル複合体を生成します。
    4. 300 μLの完全DMEMをチューブに加え、数回ピペットで完全に混合し、1 mLピペットを使用してプレーティングされたパッケージングラインセルにミセル懸濁液を滴下します。
    5. ミセルが均一に沈着するように、穏やかに旋回させます。24時間後、トランスフェクトされた細胞をトリプシン化し、フローサイトメトリーによって最初のレトロウイルスコードコンストラクト発現を評価します。
    6. トリプシン化細胞を20 mLの完全DMEMを含むT75フラスコに移し、抗生物質耐性遺伝子に応じて2 μg/mLのピューロマイシンまたは10 μg/mLのブラストキジンを加えて、トランスフェクトされた細胞を選択します。細胞が70%〜75%のコンフルエントに達したら、トリプシンを処理し、40 mLの完全DMEMを含むT175フラスコに移します。包装ラインの拡張中に培地中の抗生物質の選択を維持します。
    7. 細胞が80%〜85%コンフルエントになったら、再度トリプシン処理を行い、フローサイトメトリーでコンストラクト発現を確認します。凍結培地(50%完全DMEM、40%FBS、10%DMSO)を使用して細胞のアリコートを凍結し、40 mLの完全DMEMを含む2つのT175フラスコ(1:10-1:12分割比)に細胞を継代します。
  4. 細胞が80%〜85%のコンフルエンシーに達したら、T175フラスコで増殖させた完全に選択された安定した包装ラインからレトロウイルス上清を収集して濃縮します。
    1. 最初の収集の24時間前に、T175の培地を40 mLの新鮮な完全なDMEMに交換することにより、最初の収穫前に培地から抗生物質を除去します。
    2. 培地交換の24時間後に、収集した上清をシリンジフィルター(0.45 μm、ポリフッ化ビニリデン)を取り付けた50 mLシリンジに通すことにより、上清を回収してろ過します。50 mLのコニカルチューブに集めます。
    3. 5x ポリエチレングリコール(PEG)溶液濃縮物(40%(wt/vol)PEG 8,000 MW、2.4%(wt/vol)NaClを含む)をろ過した上清を加え、チューブを数回反転させて完全に混合します(PEG沈殿ステップ)。
    4. 40 mLの完全DMEMを元の採取したT175フラスコに戻し、さらに24時間インキュベートし、さらに連続して2日間毎日ウイルス上清を収集します。
    5. ウイルスを4°Cで1〜2日間沈殿させます。 沈殿したウイルスは、凝集性、浮遊性、または沈殿物として現れます。
    6. PEG沈殿ウイルス懸濁液を2,100 x g で4°Cで15分間遠心分離します。 沈殿していない上清を廃棄します。
    7. 10%FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、1%グルタMAX、1%ピルビン酸ナトリウム、1%非必須アミノ酸、および0.1%β-メルカプトエタノール(完全RPMIと呼ばれる)を添加した500 μLのRPMIに各PEG沈殿ウイルスペレットを再懸濁します。
    8. 再懸濁したウイルスを形質導入にすぐに使用するか、微量遠心チューブに移し、-80°Cで保存します。

3. 0日目:マウスT細胞の濃縮と活性化

  1. 組織培養処理済みの6ウェルプレートを、2 μg/mLの抗CD3(クローン145-2C11)および2 μg/mLの抗CD28(クローン37.51)を含むウェルあたり1.5 mLのPBSでコーティングします。37°Cで2時間インキュベートします。
  2. ドナーマウスから脾臓を採取し、40μmフィルターを通して細胞を解離し、完全なRPMIで脾細胞を収集します。脾細胞を340 x g で4°Cで5分間遠心分離することにより、脾細胞をペレット化します。
    注:この研究では、6〜8週齢の雌のBALB / cJマウスをドナーマウスとして使用しました。
  3. 上清を捨て、ペレットを穏やかにボルテックスし、1 mLのRBC溶解バッファーを加え、3x〜5xピペットで混合し、室温で1分間インキュベートし、10 mLの完全RPMIで急冷し、4°Cで5分間340 x g で遠心分離して細胞をスピンダウンします。
  4. 上清を廃棄し、0.5%BSAおよび2 mM EDTA(MACSバッファーと呼ばれる)を含む800 μLのPBSを加え、200 μLのマウスCD19マイクロビーズを加えます。ピペットで混合し、4°Cで15分間インキュベートします。
  5. マウス脾臓ごとに1本のLDカラムを調製します。LD 列を MACS 区切り文字に固定します。15 mLの円錐形チューブを下に置き、CD19が枯渇した脾細胞を収集します。カラムを 2 mL の MACS バッファーで濡らします。
  6. CD19マイクロビーズとインキュベートした後、5 mLのコールドMACSバッファーで細胞を洗浄し、4°Cで5分間340 x g で遠心分離して細胞をペレット化し、上清を廃棄します。1 mLのMACSバッファーに再懸濁し、細胞をLDカラムに加えます。懸濁液が通過するのを待ってから、1 mL、次に2 mLのMACSバッファーで洗浄します。
  7. CD19が枯渇した脾細胞のフロースルーを収集して、下流で使用します。LDカラムを廃棄し、CD19が枯渇した脾細胞を340 x g で4°Cで5分間遠心分離することによりスピンダウンします。 上清を廃棄し、18 mLの完全RPMIに再懸濁します。組換えヒトIL-2(rhIL-2)を最終濃度50 IU/mLまで添加します。
  8. 抗体でコーティングされた6ウェルプレートから抗体溶液を廃棄します。3 mLの再懸濁したB細胞枯渇脾細胞を、抗体でコーティングされた6ウェルプレートの各ウェルに加えます。

4. 1日目:マウスT細胞のレトロウイルス形質導入

  1. 非組織培養処理の6ウェルプレートを、2 μg/mLの抗CD3(クローン145-2C11)、2 μg/mLの抗CD28(クローン37.51)、および20 μg/mLのレトロネクチンを含むウェルあたり1.5 mLのPBSでコーティングします。
    注:非組織培養プレートは、メーカーの推奨に従って、RetroNectinコーティング中に使用されます。
  2. 37°Cで2時間インキュベートします。 コーティング液を廃棄するか、再利用のために保存してください(一度再利用できます)。ウェルあたり2%BSAを含む1 mLのPBSでプレートをブロックし、37°Cで10分間インキュベートし、ブロッキング溶液を廃棄します。
  3. その間に、PEG沈殿したウイルス上清を37°Cの水浴で解凍します。
    注:T175フラスコから生成された各共形質導入PEG濃縮レトロウイルス500 μLは、ウェルあたり最大2 x 106 活性化T細胞を20%の二重形質導入効率で二重形質導入するのに十分>はずです。
  4. 所望の条件に従って共形質導入ウイルス上清を6ウェルプレートウェルに加え、完全なRPMIおよび50 IU / mL rhIL-2で最終容量を少なくとも2 mLまで上げ、2,100 x g および32°Cで1時間スピンします。
  5. ウェルあたり0.5-2 x 106 個の活性化T細胞を加え、32°Cで10分間340 x g でプレートをスピンします。 細胞が接着していない場合は、32°Cでさらに10〜20分間、340 x g でスピンを繰り返します。 37°Cで一晩インキュベートします。

5. 2日目:ベクター発現評価とオプションの再形質導入

  1. フローサイトメトリー用の形質導入プレートから条件ごとに100〜200 μLの接着細胞を破壊します。ユーザーは、個々のベクターおよびアフィニティータグごとにフローサイトメトリーで検出可能なマーカーを特定し、それらを使用して、フローサイトメトリーを使用してベクターのシングルベクター形質導入効率、ダブルベクター形質導入効率、およびアフィニティータグの提示を評価する必要があります。
  2. 以下に説明するように、共形質導入された細胞に対してフローサイトメトリーを実行します。
    1. ベクター1とベクター2のベクターレポーターを表示するように、取得パラメータ軸を設定します(図1C)。
    2. 4つのベクター1およびベクター2発現象限のそれぞれについて、アフィニティータグジッパー染色(FLAGまたはCD34など)のヒストグラムをプロットして、アフィニティータグ染色がベクター1およびベクター2形質導入レポーターを共発現する細胞に限定されるようにします。
  3. 細胞が十分に二重形質導入され、下流の実験に十分な細胞が確保されている場合(通常は20%以上の二重形質導入)、次の手順を実行します。
    1. T細胞刺激を維持するために、2 μg/mLの抗CD3および抗CD28抗体を含むPBSで各T細胞株を形質導入するために使用される初期ウェルの数を2倍にコーティングします。37°Cで2時間インキュベートします。
    2. 50 IU/mL rhIL-2 を含む完全な RPMI で細胞を新しいウェルに移します (T 細胞刺激を維持します)。
  4. 細胞が十分に二重形質導入されておらず、下流の実験に十分な細胞を確保するのに十分な細胞(通常は20%の二重形質導入<)は、次の手順を実行します。
    1. 1日目と同じプロトコルを使用して形質導入を再導入しますが、T細胞増殖を説明するために最初に使用されたウェルの数の2倍に増やします。
    2. 37°Cで一晩インキュベートします。24時間後にフローサイトメトリーを繰り返します。
      注:アフィニティータグジッパーを含むベクターエンコードコンストラクトは、最初の形質導入の2日後に最大発現を示します。

6. 3日目:T細胞免疫磁気選択(ジップソート)

  1. 同じ共形質導入条件を使用して生成された細胞のウェルを15 mLのコニカルチューブにプールします。
  2. 細胞を340 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を廃棄し、1 x 107 細胞あたり30 μLのマイクロビーズ(DYKDDDDK(FLAG)またはヒトCD34)を含む500 μLのMACSバッファーで細胞を4°Cで30分間インキュベートします。
  3. インキュベーション後、5 mLのコールドMACSバッファーで細胞を洗浄します。細胞を340 x g で4°Cで5分間遠心分離します。 上清を廃棄し、ペレットを1 mLのMACSバッファーに再懸濁します。
  4. 以下に説明するように、LSカラムを使用して形質導入されたT細胞をポジティブに選択します。
    1. カラムを 2 mL の MACS バッファーで濡らします。磁気スタンドのLSカラムに細胞懸濁液を塗布します。
    2. MACSバッファー(1 mL、2 mL、3 mL)で順次洗浄します。カラムを磁気スタンドから取り外し、5 mLの完全RPMIをカラムに加え、セルプランジャーを挿入して、カラムから保持細胞を溶出します。
    3. 15 mLのコニカルチューブまたはT25フラスコで直接細胞をキャプチャします。50 IU/mL rhIL-2 で完全な RPMI で 0.5 x 106 細胞/mL で細胞を平衡化します。
    4. 20%<デュアルトランスダクションから開始する場合は、オプションで細胞を2番目のLSカラムに溶出してシーケンシャルポジティブセレクションを行い、ソート後の純度を高めます。
  5. T25またはT75フラスコでCAR T細胞を約0.5 x 106細胞/ mLの完全RPMIおよび50 IU/mL rhIL-2で培養します。
  6. オプション:T細胞をin vivo実験に使用する場合は、最初の培養期間に遭遇したCAR T細胞強直シグナル伝達誘発性機能障害を弱めるために、1μMダサチニブで培養することを検討してください13,16。
  7. 事前ソートおよびポストソートされたT細胞に対して、上記のステップ2.1および2.2に従ってフローサイトメトリーを実行し、ジップソート後の収量と純度(二重形質導入%)を評価します。
    収量 = 100 x 回収された二重形質導入細胞の総数 / 事前ソート集団に存在する二重形質導入細胞の総数)

7. 4日目:T細胞培養の継続

  1. 新鮮な完全RPMIと50 IU/mLのrhIL-2を培養量全体に加えて、T細胞濃度を0.5-1 x 106 細胞/mLに維持します。
  2. オプション:T細胞を in vivo 実験に使用する場合は、新鮮な1μMダサチニブを追加します。

8. 5日目:ジップソートT細胞の特性評価

  1. オプション:フローサイトメトリーを使用して、ジップソートベクターによってコードされたCARまたはその他のタンパク質産物を検出するために、抗体で染色された条件ごとに100〜200 μLのT細胞懸濁液を調製します。
  2. CAR T細胞を用いた in vitro または in vivo 実験を行う。
  3. オプション: T 細胞を in vivo 実験に使用する場合は、細胞を洗浄してダサチニブを除去します。施設のガイドラインに従って、眼窩後または尾静脈注射に必要な濃度で細胞を再懸濁します。

9. 0日目:ヒトT細胞の精製と刺激

  1. 凍結保存されたヒト末梢血単核球(PBMC)のバイアルをウォーターバスですばやく解凍します(または、新たに単離されたPBMCを使用します)。解凍したPBMCを5 mLのMACSバッファーを含む15 mLコニカルチューブに加え、計数用のアリコートを調製し、4°Cで5分間340 x g で遠心分離して細胞をペレット化します。
  2. 上清を廃棄し、MACSバッファーに細胞を再懸濁します(1 x 10 7細胞あたり40 μLのバッファーを使用します)。製造元の指示に従って、ヒトのPan T細胞分離キットを使用してT細胞単離を進めます。
    1. 簡単に言えば、合計1 x 107 細胞あたり10 μLのPan T細胞ビオチン抗体カクテルを追加します。4°Cで5分間インキュベートします。
    2. 合計1 x 107 細胞あたり30 μLのMACSバッファーを追加します。合計1 x 107 細胞あたり20 μLのPan T細胞マイクロビーズカクテルを追加します。
    3. 4°Cで10分間インキュベートします。 MACSバッファーを使用して細胞懸濁液の容量を少なくとも500 μLまで満たします。
    4. LSカラムを使用して磁気細胞分離に進み、濃縮された(手つかずの)T細胞を含むフローを収集します。
  3. 4°Cで340 x g で5分間遠心分離することにより、T細胞収量とペレット細胞をカウントします。 上清を捨てます。ヒトT細胞を1 x 106 細胞/mLの完全RPMIに、rhIL-2を50 IU/mLで再懸濁します。
  4. 2 mLのPBSを含む15 mLのコニカルチューブに、T細胞の増殖と活性化に必要な量のDynabeads Human T-Activator CD3/CD28(1 x 106 細胞あたり25 μLビーズ、1:1のビーズとT細胞の比率を使用)を加え、340 x g で4°Cで5分間スピンダウンしてビーズを洗浄します。上清を捨てます。
  5. 再懸濁したT細胞を洗浄したビーズと混合し、培養のためにT25フラスコに移します。

10. 3日目:ヒトT細胞のレトロウイルス形質導入

  1. 非組織培養6ウェルプレートを、20 μg/mLのレトロネクチンを含むウェルあたり1.5 mLのPBSでコーティングします。
  2. 37°Cで2時間インキュベートします。 コーティング液を廃棄するか、再利用のために保存してください(一度再利用できます)。
  3. その間に、PEG沈殿したウイルス上清を解凍して、37°Cのウォーターバスで共形質導入します。
  4. 所望の形質導入条件に従って、レトロネクチンでコーティングされた6ウェルプレートのウェルに共形質導入ウイルス上清を加え、所望の量のT細胞(通常は0.5〜2 x 106 T細胞/ウェル)をカウントして添加し、rhIL-2を含む完全なRPMIで最大3 mLの容量にし、32°Cで340 x g で45分間スピンします。
  5. 24時間後、T細胞を50 IU / mL rhIL-2で完全なRPMIで1 x 106 細胞/ mLに維持します。
  6. T細胞の所望の濃度を維持するために必要な容量が6ウェルプレートの容量を超える場合は、6ウェルプレートからT25フラスコに細胞を移します。

11. 6日目:ジップソーティングヒトCAR T細胞

  1. アフィニティータグベースの免疫磁気精製(ジップソート)の前にT細胞からダイナビーズを除去して、磁気カラムでのダイナビード関連の滞留を回避し、フローサイトメトリーの前にフローサイトメトリー分析への潜在的な干渉を回避します。
  2. 短時間ボルテックスしてダイナビーズを解離し、T細胞を15 mLのコニカルチューブに移し、ダイナビードマグネットに挿入します。チューブを数回反転させ、ダイナビーズが磁石に結合するまで5分間待ちます。
  3. ダイナビーズを使用せずに細胞懸濁液をピペットで吸引して、新しい15 mLコニカルチューブに慎重に移します。回収された細胞濃度をカウントし、体積を使用して総細胞収量を計算します。
  4. 上記のマウス形質導入プロトコルに従って、フローサイトメトリーを使用してCAR発現を評価します。
  5. 4°Cで340 x g で5分間遠心分離して細胞をスピンダウンし、1 x 107 細胞あたり30 μLのマイクロビーズ(DYKDDDDK(FLAG)またはヒトCD34)を含む500 μLのMACSバッファーでインキュベートします。
  6. ステップ6.3〜6.5に従って、ジップソートされたヒトCAR T細胞を取得します。
  7. トリパンブルー除外を使用した血球計算器生存率チェックにより、ソート後の生存率を評価します。選別前の生存率は80%>と予想されます。これは、Zipソート後に80%を下回る可能性がありますが、4〜5日で回復します。
  8. ヒトT細胞を50 IU/mL rhIL-2で完全なRPMIで増殖させ、T細胞濃度を約1 x 106 細胞/mLに維持します。ソート後のT細胞の増殖と維持は、ユーザーの標準的な増殖および使用プロトコルに従って調整できます。
  9. キリングアッセイ、サイトカイン産生、T細胞を用いた in vivo 分析などの下流の実験試験を、一般的に8日目以降に実施する。

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結果

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このプロトコルでは、2つの異なるレトロウイルスベクター(ジップソートと呼ばれる、図1)13で二重形質導入されたT細胞の共形質導入およびシングルステップ免疫磁気選択を実証します。各ベクターは、二重形質導入T細胞の表面に選択的に表示されるヘテロ二量体化ロイシンジッパーペアの一部をコードします(図1A)。アフィニティータグ分泌ジッパーはベクター1から発現し、ベクター2から発現した膜結合キャプチャジッパーと細胞内で対になります。ここでは、短いヒンジスペーサー(図1A-B)とThy1.1、EGFR、PD-1、CD200Rなどの大きく細長いスペーサー(図1B)を備えたジップソートキャプチャジッパー設計を評価しました。短いヒンジスペーサーを備えたキャプチャジッパーは、分泌されたジッパーと細胞外でかなりペアになりません。しかし、細長いス...

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ディスカッション

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ここでは、ジップソートベクターセットの生成、レトロウイルスの作製、マウスとヒトのT細胞の共形質導入、および二重形質導入細胞の免疫磁気精製(ジップソート)のためのプロトコルについて説明しました。上記のプロトコルは、レトロウイルスベクターおよびマウスおよびヒトT細胞用に最適化されました。ジップソート法は他のベクターシステムでは評価されていませんが、原則として、十分に高い表面発現が達成されていれば、レンチウイルス17、トランスポゾン18、または部位特異的相同性指向修復テンプレート統合19など、他のベクターシステムは互換性がある可能性があります。より大きな梱包サイズを必要とするユーザーは、それぞれのベクターシステムの報告された最大貨物容量に基づいて、これらの代替梱包戦略の使用を検討することができます7。その結果、ジップソート法では、アフィニティータグのジッパーを低密度または高密度の細胞に表...

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開示事項

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A.R.、S.C.、S.E.J.、M.V.D.B.は、Zipソート技術に関連する特許出願の共同発明者です。A.P.B.は、アッヴィとブリストル・マイヤーズ スクイブのコンサルティングを提供しています。MVDBは、Seres Therapeuticsから研究支援を受け、Seres TherapeuticsとThymoFoxからストックオプションを受けています。彼はWolters Kluwerから印税を受け取っています。彼は、Seres Therapeutics、Vor Biopharma、Rheos Medicines、Frazier Healthcare Partners、Nektar Therapeutics、Notch Therapeutics、Ceramedix、Lygenesis、Pluto Therapeutics、GlaskoSmithKline、Da Volterra、ThymoFox、Garuda、Novartis (配偶者)、Synthekine (配偶者)、Beigene (配偶者)、Kite (配偶者)、MustangBio (配偶者)、および Cellectar (配偶者) の顧問、謝礼を受け取った、または諮問委員会に参加しました。彼はSeres TherapeuticsとJuno TherapeuticsのIPライセンスを取得しています。彼はDKMS(非営利団体)の財団理事会で受託者の役割を担っています。また、Smart Immuneの科学諮問委員会の委員長も務めています。

謝辞

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サウスカロライナ州はドイツ研究財団(リサーチフェローシップ;Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG)。S.E.J.は、NCIからキャリア開発賞(賞番号K08-CA252157)の支援を受けています。SEJ は、米国臨床腫瘍学会 (若手研究者賞)、全米骨髄ドナー プログラム (エイミー プログラム賞)、およびパーカーがん免疫療法研究所 (ブリッジ奨学生賞) からも支援を受けました。van den Brink ラボでの研究は、国立がん研究所の賞 P01-CA023766、R35-CA284024、R01-CA228308 によってサポートされています。国立心肺血液研究所賞 R01-HL164902、国立老化研究所賞 P01-AG052359。この研究は、ディアナ・アンド・スティーブ・キャンベル・チーフ・フィジシャン・エグゼクティブ・ディスティングイッシュド・チェアの寄付金によって部分的に支援されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
腫瘍細胞株関連
C1498ATCCのTIB-49
BM185-CD19参照 13
BM185-CD20参照 13
4D-NucleofectorコアユニットロンザAAF-1003B
4D-Nucleofector X ユニットロンザAAF-1003X型
Lonza SFバッファーキット
ウイルス産生
10cm組織培養(TC)処理細胞培養皿コーニング353003
50 mLコニカルチューブサーモサイエンティフィック339652
エフェクテンキアゲン301425
pENTR1aプラスミドアドジーン17398
LZRS-Rfaアドジーン31601
PB MMLV puro(マウスT細胞用ウイルスベクター)参照 13
PB SFG blastR(ヒトT細胞用ウイルスベクター)参照 13
pCMV-ハイPBアーゼサンガー研究所
フェニックスエコATCCのCRL-3214
フェニックスエコアルファVベータ3参照 13Phoenix-Ecoは、より高い結合力を持つ培養フラスコに接着するように改質されました
PB-EF1a イントロン WPRE mCD4 P2A MCS インテグリン ベータ 3参照 13オプションで、包装ラインセルと培養フラスコの接着性を高めることができます。
PB-EF1a イントロン WPRE hCD8a 2A インテグリン アルファ V参照 13オプションで、包装ラインセルと培養フラスコの接着性を高めることができます。
ビオベック-RD113ビオベックファーマ
Biovec-RD113 α V ベータ 3ビオベックファーマこの研究では、α V ベータ 3 ベクターをトランスフェクトしました。
Millex-HVシリンジフィルター(0.45 &m)ミリポールSLHVR33RRS
ポリエチレングリコール8000(PEG)フィッシャーサイエンティフィックBP233-1
塩化ナトリウムフィッシャーサイエンティフィックS271-500
ピューロマイシンサンタクルーズバイオテックSC-108071B
ブラストチジンサンタクルーズバイオテックSC-204655
T175 TC処理フラスコ コーニング353112
トリプシン-EDTA(0.25%)、フェノールレッドギブコ25200056
細胞培地
2-メルカプトエタノールギブコ21985023
RPMI1640ギブコ11-875-119
DMEMのギブコ11-965-118
FBSのシグマF2442
グルタマックスギブコ35050061
MEM非必須アミノ酸ギブコ11140050
ペニシリン-ストレプトマイシンギブコ15140-163
ピルビン酸ナトリウムギブコ11360070
<強>T細胞刺激・形質導入
15 mLコニカルチューブサーモサイエンティフィック339650
6ウェル非TCプレートギブコ351146
6ウェルTCプレートギブコ353046
抗CD19マイクロビーズ ミルテニー・バイオテック130-121-301
InVivoMab 抗マウス CD28 (クローン 37.51)バイオエックスセルBE0015-1
InVivoPlus 抗マウス CD3&イプシロン;(クローン145-2C11)バイオエックスセルBE0001-1
ウシ血清アルブミンシグマ・アルドリッチA4737-1G
ダサチニブケイマンケミカル11498
Dynabeads ヒト T アクチベーター CD3/CD28ギブコ11131D
EDTA(0.5 M)、pH 8.0、RNaseフリーインビトロゲンAM9260G
HybriMax RBC溶解バッファーシグマR7757-100MLの
LDカラムミルテニー・バイオテック130-042-901
Pan T細胞分離キット、ヒトミルテニー・バイオテック130-096-535
Dynamag-15 マグネットインビトロゲン12301D
リン酸緩衝生理食塩水(1X)コーニング21040CV
レトロネクチンタカラT100B
rhIL-2プロロイキン(アルデスロイキン)
T25細胞培養フラスココーニング353109
Zipソート
&マイクロ;MACS DYKDDDDK絶縁キットミルテニー・バイオテック130-101-591
CD34 MicroBead Kit, ヒトミルテニー・バイオテック130-046-702
クアドロMACSミルテニー・バイオテック130-090-976
MACSマルチスタンドミルテニー・バイオテック130-042-303
LSカラムミルテニー・バイオテック130-042-401
フローサイトメトリーおよび細胞モニタリング
抗CD90.1 Thy1.1 APC(クローンOX-7)BDバイオサイエンスカテゴリ# 561409;RRID:AB_10683163
抗V5タグ抗体、(クローン4C12E11)iFluor 488ジェンスクリプトカタログ# A01803、RRID:AB_2925231
マイクPE細胞シグナル伝達技術カタログ#2233;RRID:AB_823474
マイクアレクサ647細胞シグナル伝達技術カタログ#2233;RRID:AB_823474
APC アンチ DYKDDDK タグ(クローン L5)バイオレジェンドカテゴリ#637307;RRID:AB_2561496
マウス抗CD34抗体、Alexa Fluor 647、(クローンQBEnd/10)ノバスバイオロジカルズカタログ# NBP2-34713AF647;RRID:AB_2925234
ストレプタグFITC製ジェンスクリプトカタログ# A01736;RRID:AB_2622221
Incucyte SX5ザルトリウス
ペンテオンフローサイトメーターアジレント

参考文献

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  1. June, C. H., Sadelain, M. Chimeric Antigen Receptor Therapy. New Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
  2. Mikkilineni, L., Kochenderfer, J. N. CAR T cell therapies for patients with multiple myeloma. Nat Rev Clin Oncol. 18 (2), 71-84 (2021).
  3. Labanieh, L., Mackall, C. L. CAR immune cells: design principles, resistance and the next generation. Nature. 614 (7949), 635-648 (2023).
  4. Berger, T. R., Maus, M. V. Mechanisms of response and resistance to CAR T cell therapies. Curr Opin Immunol. 69, 56-64 (2021).
  5. Labanieh, L., Majzner, R. G., Mackall, C. L. Programming CAR-T cells to kill cancer. Nat Biomed Eng. 2 (6), 377-391 (2018).
  6. Fucà, G., Reppel, L., Landoni, E., Savoldo, B., Dotti, G. Enhancing Chimeric Antigen Receptor T-Cell Efficacy in Solid Tumors. Clin Cancer Res. 26 (11), 2444-2451 (2020).
  7. Ghosh, S., Brown, A. M., Jenkins, C., Campbell, K. Viral Vector Systems for Gene Therapy: A Comprehensive Literature Review of Progress and Biosafety Challenges. Appl Biosafety. 25 (1), 7-18 (2020).
  8. Hyrenius-Wittsten, A., et al. SynNotch CAR circuits enhance solid tumor recognition and promote persistent antitumor activity in mouse models. Sci Transl Medi. 13 (591), eabd8836(2021).
  9. Tousley, A. M., et al. Co-opting signalling molecules enables logic-gated control of CAR T cells. Nature. 615 (7952), 507-516 (2023).
  10. Li, Y., et al. KIR-based inhibitory CARs overcome CAR-NK cell trogocytosis-mediated fratricide and tumor escape. Nat Med. 28 (10), 2133-2144 (2022).
  11. Ghorashian, S., et al. CD19/CD22 targeting with co-transduced CAR T-cells to prevent antigen negative relapse after CAR T-cell therapy of B-ALL. Blood J. , (2023).
  12. Qin, H., et al. Preclinical Development of Bivalent Chimeric Antigen Receptors Targeting Both CD19 and CD22. Mol Ther Oncol. 11, 127-137 (2018).
  13. James, S. E., et al. Leucine zipper-based immunomagnetic purification of CAR T cells displaying multiple receptors. Nat Biomed Eng. 8 (12), 1592-1614 (2024).
  14. Ghani, K., et al. Efficient Human Hematopoietic Cell Transduction Using RD114- and GALV-Pseudotyped Retroviral Vectors Produced in Suspension and Serum-Free Media. Human Gene Ther. 20 (9), 966-974 (2009).
  15. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proc Natl Acad Sci U S Am. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  16. Weber, E. W., et al. Transient rest restores functionality in exhausted CAR-T cells through epigenetic remodeling. Science. 372 (6537), eaba1786(2021).
  17. Bulcha, J. T., Wang, Y., Ma, H., Tai, P. W. L., Gao, G. Viral vector platforms within the gene therapy landscape. Signal Transduct Targeted Ther. 6 (1), 1-24 (2021).
  18. Kahlig, K. M., Saridey, S. K., Kaja, A., Daniels, M. A., George, A. L., Wilson, M. H. Multiplexed transposon-mediated stable gene transfer in human cells. Proc Natl Acad Sci. 107 (4), 1343-1348 (2010).
  19. Shy, B. R., et al. High-yield genome engineering in primary cells using a hybrid ssDNA repair template and small-molecule cocktails. Nat Biotechnol. 41 (4), 521-531 (2023).
  20. Liu, Z., et al. Systematic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in a polycistronic vector. Sci Rep. 7 (1), 2193(2017).
  21. Cui, Z., Yuan, P., Zhao, Z., Zhao, F., Lu, L. Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro. J Vis Exp. (213), e66966(2024).
  22. Montini, E., et al. The genotoxic potential of retroviral vectors is strongly modulated by vector design and integration site selection in a mouse model of HSC gene therapy. J Clin Invest. 119 (4), 964-975 (2009).

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