方法論記事

吸収分子を用いたEx vivo および In vivo イメージングのためのトランジェント光学クリアリング

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DOI：

10.3791/68629

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2025年7月11日

 ,  ,  , 
1Department of Physics, The University of Texas at Dallas, 2Department of Electrical and Computer Engineering, The University of Texas at Dallas

この記事について

サマリー

分子溶液の吸収などの光学的透明化技術は、光散乱を一時的に低減して生物学的イメージングを強化し、深く埋め込まれた臓器に対する生体適合性のある可逆的な in vivo イメージング戦略を提供します。このプロトコルは、詳細な実験手順と高度な画像処理を提示し、生きた動物のリアルタイムダイナミクスのための高品質でダイナミックなイメージングを実現します。

要約

ダイナミックイメージングは生物学や医学の基礎となるツールですが、屈折率のミスマッチによる生体組織での光散乱によって制限され、生体組織への浸透深度と分解能が低下します。これまでの研究では、生体内で強力に吸収する分子を利用して光学的透過性を実現する新しいアプローチが紹介されていました。食品に一般的に使用されるFDA承認の染料であるタルトラジンなどのこれらの吸収分子が水に溶解すると、Kramers-Kronig関係を介して水性媒体の屈折率が変化します。この変調により、異なる屈折率を持つ組織内の別々の成分間の屈折率の不一致を減らすことができ、散乱が軽減されます。この記事では、タルトラジンベースの水溶液を使用した組織透明化技術の詳細な方法論を、 ex vivo サンプルと in vivo サンプルの両方に適用した方法を報告します。このアプローチにより、生きたマウスの体が可視スペクトルで可逆的に透明になり、内部プロセスや構造をより鮮明かつ深くイメージングできるようになります。次に、高度な画像処理アルゴリズムを使用して、関心のある臓器のコントラストとセグメンテーションを改善しました。さらに、タルトラジンベースの溶液で処理した鶏の胸肉などの ex vivo サンプルでは、高い透明性が示されています。この方法は、さまざまなモダリティにわたるイメージング機能を強化するための汎用性が高くアクセス可能なアプローチを提供し、複雑な生物学的システムの理解を前進させる道を開きます。

概要

生物学的イメージングは、光の散乱によって関心のある構造が不明瞭になることが長い間課題となってきました1。光学的クリアリング技術は、光の散乱を減らし、視覚的な明瞭さを向上させることを目的としており、以前は隠れていた構造の視覚化を可能にします2。これらの技術の開発により、サンプルを物理的に解剖することなく、ex vivo生体組織、さらには動物全体の光学イメージングを改善するように設計されたさまざまな方法が生まれました3。しかし、in vivoアプリケーションのための同様の技術の開発は困難でした。CLARITY Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging / Immunostaining / in situ-hybridization-compatible Tissue hY drogel)などの技術は、高解像度のイメージングを提供しますが、可逆性に欠けるため、生きた動物研究には適していません4。Constantiniらは、ex vivoイメージングの明瞭さと比較して、in vivoイメージングの進行が遅いことを示しましたが、これは、組織の透明性に必要な薬剤の毒性レベルを回避しながら組織の生存率を維持することの複雑さによるものです5。Geninaは、非侵襲的で可逆的な方法に依存する光学組織透明化の未来を強調しています6。近年の研究では、水溶性吸収性色素のin vivo光学的清澄化に有効であることが実証されています。例えば、Millerらは、タルトラジンを局所適用すると、生きたマウス皮膚のOCTおよび光音響顕微鏡(PAM)の両方で、散乱を減少させ、間質組織成分の屈折率を増加させることにより、イメージング深度を有意に向上させることを示した7。Jiaらは、マウスの耳および腹部組織のin vivo PAMイメージングを強化するために15%w/wタルトラジン溶液を使用し、他の方法では不明瞭であった細胞内分解能の微細な微小血管構造を明らかにしました8。Zuoらはさらに、0.6 Mタルトラジンを使用して、生きたマウスの無傷の頭皮と頭蓋骨による脳イメージングを実証し、未処理の組織と比較して4倍高い信号強度と3.5倍の向上した分解能を達成しました9。別のアプリケーションでは、Narawaneらは、タルトラジンを適用することにより、ブタの眼における深部経強膜OCTイメージングを可能にし、以前は強い強膜散乱のためにアクセスできなかった脈絡膜上腔の明確な視覚化を達成しました10。CLARITYやiDISCOのようなex vivo組織透明化法(Immunolabeling-enabled three dimensional imaging of solvent-cleared organs)は、脂質除去や溶媒ベースの清浄化により高い光学的透明性と細胞内分解能を達成しますが、生きた動物を用いたin vivoイメージングには適さないことが多い4,11,12.この制限は、疾患の発生や治療など、生きた動物内の動的プロセスの生物医学的イメージングに重要な動的イメージングに影響を及ぼします。

食品グレードの染料であるタルトラジンなど、高い水性溶解度と明確な吸収バンド形状を持つ吸収分子は、生きた動物で光学的透明性を達成するための有望な利点を提供します13。タルトラジンを特異的に導入することにより、組織は色素のユニークなスペクトル特性により紫外線と青色の波長を選択的に吸収し、その結果、より長い波長での散乱を減らす屈折率プロファイルが修正されます。この直感に反する光学組織透明化技術は、in vivoイメージングに最適化されており、Kramers-Kronigの関係は、タルトラジン14,15のような強力に吸収する分子を使用した場合に観察される透明性の科学的基盤を提供します。in vivoイメージングでは、タルトラジンを加熱したアガロース粒子および水と組み合わせて、皮膚によりよく接着する凝集性溶液を作成します。また、タルトラジンの水溶性により、生きた動物から染料ベースの溶液を簡単に除去でき、染料溶液への長時間の曝露による潜在的な影響が軽減されます。さらに、この方法は、光干渉断層撮影法7,16や光音響イメージング7,9など、イメージングの深さ、解像度、感度を向上させるためのさまざまな生物医学アプリケーションに適応しており、より広範な生物医学イメージングコミュニティの可能性を示しています。

生物医学イメージング17,18における吸収分子の応用への関心が高まる中、このプロトコルは、画像処理および可逆的なin vivoイメージングとともに、ex vivoおよびin vivoアプリケーションのための食品染料の利用の詳細な手順を提示する。このプロトコルは、ex vivoの透明性を示すために鶏の胸肉組織に適用され、その後、マウスのin vivo頭部および腹部イメージング用に改変され、可逆性を示します。in vivoでマウスの皮膚に塗布した溶液は、皮膚や組織の完全性を損なうことなく、一時的で可逆的な透明性を作り出します。この手法は、ノイズ除去を含む画像処理パイプラインと統合して、内臓のin vivo光学イメージングに最適化されたイメージングプロトコルを作成できます。これらの技術を組み合わせることで、生物学的プロセスのリアルタイム観察のためのより優れた非侵襲的な縦断的イメージングが可能になります。可逆性を示すより安全な薬剤を使用することで、従来の制限が克服され、ダイナミックな生物学的イメージングにより適した方法が提供されます。

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プロトコル

実施されたすべての動物実験は、テキサス大学ダラス校の動物管理・使用委員会(IACUC)によって、NIH実験動物の管理と使用に関するNIHガイドに従って承認されました。試薬および使用した機器は 、材料表に記載されています。画像処理コードは Github で入手できます https://github.com/ou-group-utd/JoVE-2025-Image-Processing

1.タルトラジン溶液の調製

  1. ex vivo サンプル用
    1. 色素溶液を調製するには、必要な量の溶液を調製するために必要な色素粉末(タルトラジン)の質量を計算します。次の式を使用します。
      質量(g)=モル濃度(M)×分子量(g / mol)×体積(L)
      注:実際のモル濃度を較正するには、UV-VIS分光計を使用して調製した溶液の吸光度を測定し、ランベルトビールの法則19を適用します。
      注意: 分析天びんを使用して、粉末の正確な量を計量します。染料粉末を扱うときは、白衣、手袋、安全ゴーグルなどの適切なPPE(個人用保護具)を着用してください。吸入や皮膚接触を避けてください。
    2. 染料粉末を清潔なガラスバイアルに移し、容量ピペットを使用して必要量の脱イオン(DI)水を加えて、容量精度を確保します。
    3. 粉末が室温で完全に溶解しない場合は、ガラスバイアルを40°Cに予熱した実験室オーブンまたは炉に入れ、10分間または粉末が完全に溶解するまで加熱します(図1A)。
      注:低モル濃度溶液は室温で完全に溶解し、液体のままですが、高濃度(>0.37M)溶液は加熱が必要です。
      注意: 過度の加熱は水を蒸発させ、溶液の実際の濃度を変化させます。
    4. ボルテックスミキサーで30秒から1分間攪拌し、完全に溶解します。
    5. 0.65M溶液を調製するには、427.5mgのタルトラジン粉末を1mLの脱イオン水19に溶解する。その他の濃度については、 表1を参照してください。
      注意: 未使用の染料溶液と汚染された材料は、標準的な化学廃棄物処理手順に従って廃棄してください。
  2. in vivoサンプル用
    1. 0.4%(4 mg/mL)アガロースハイドロゲル溶液で0.65 M濃度を調製するために、低融点アガロース微粒子とタルトラジンの必要質量を計算します。
      注:すべての試薬を取り扱うときは、ステップ1.1.1で説明されている標準的な安全上の注意に従ってください。
    2. 加重した粉末をきれいなガラスバイアルに移します。メスピペットを使用して単次元水を追加します。
    3. バイアルを75°Cに予熱した実験室のオーブンまたは炉に約10〜15分間、またはアガロース粒子が完全に溶解するまで置きます。
    4. 加熱プロセス中にボルテックスミキサーを使用して混合し、均一に溶解させることがあります。
    5. 溶液を室温まで冷ましてから使用してください。ゲル状に固まった場合は、ボルテックスミキサーで30秒間使用して再液化します。
    6. 0.65 Mハイドロゲル溶液を調製するには、427.5 mgのタルトラジン粉末と4 mgのアガロースを1 mLの脱イオン水に溶解します。他の濃度の溶液を調製するには、アガロース濃度を0.4%(4 mg / mL)に維持し、対応するタルトラジン質量17については表1を参照してください。.

2. ex vivo 組織の光学的透明化

  1. サンプル調製
    1. ex vivo組織を調製するには、鶏の胸肉組織をコラーゲン繊維に平行な厚さにスライスします。
    2. スライスしたティッシュペーパーを水でやさしく洗います。
    3. 2つの清潔な顕微鏡スライドの間に組織を配置して厚さを測定します。スライドをそっと押し合わせ、バーニアキャリパーを使用して、組織の中心にあるスライド間の距離を測定します。
    4. 組織を染料溶液に浸します。
      注意:溶液の量がサンプルの量を超えていること、および組織が完全に水没していることを確認してください。
    5. 容器をオービタルシェーカーに置き、毎分100回転で10分間振とうします。
    6. 組織を室温で60分間、低濃度≤0.4 Mの場合、40°Cで高濃度の場合>0.4 Mの溶液に留置します。
  2. イメージング
    1. 清潔な鉗子を使用して染料溶液から組織を取り除きます。
    2. サンプルを2つの透明なスライドガラスの間に置き、適切な解像度と倍率設定のデジタルカメラまたは科学カメラを使用して画像をキャプチャします。
    3. 外部光の干渉を最小限に抑えるために、制御された光環境でイメージングプロセスを実施します。
    4. 厚さと色素溶液濃度の異なる組織サンプルについて、イメージングプロセスを繰り返します(図2B)。
      注意: バックライトにはLED光源を使用してください。ただし、トップイルミネーション光源でもまったく同じように機能します。
  3. 光伝送測定
    1. 光透過率を測定するには、ニワトリ組織を2つの透明なスライドガラスの間に挟み込み、紫外可視近赤外分光計を使用して透過率を測定します(図2C)。
    2. システムが適切にベースライン化されていること、および染料溶液で処理する前と後に光ビームが組織の同じ領域を通過することを確認して、一貫性を維持します。
      注:中程度のスキャン速度と1.0nmのデータ間隔を使用して、400nm〜2000nmの波長範囲にわたる透過スペクトルを記録します。フルスペクトルスキャンには、サンプルあたり約5分かかります。

3. 生きた動物における光学的透明性

  1. 動物の調理法
    1. 実験の前に、動物の体重を測定し、一般的な活動レベルを書き留めて、生理学的ベースラインを確立します。
    2. 実験中は、動物の体温を維持するために、温度を37°Cに設定した加熱パッドを使用してください。
      注意: 過熱を防ぐために、動物を継続的に監視してください。
    3. イメージング部位に基づいて生きている動物の光学イメージングのための麻酔を投与します (施設で承認されたプロトコルに従って)。腹部の画像診断には、迅速な回復のために吸入麻酔薬を使用し、脳の画像診断には注射麻酔を使用します。
    4. 吸入麻酔の場合は、イメージング実験の前にイソフルランを1.5%〜3%、流量0.8 L / minで約5分間誘導し、実験全体を通して1%〜2%に維持します。.
      注意: 動物の呼吸パターンと深さを継続的に監視してください。人員への麻酔薬の曝露を最小限に抑えるために、換気の良い場所を使用してください。
    5. 注射麻酔の場合は、ケタミンHCL(16 mg / mL)とデクスメデトミジンHCL0.2 mg / mLを含むカクテルを準備します。.動物の体重と承認された施設のプロトコルに従って投与します。
    6. 目的のイメージング領域から小さな動物のバリカンを使用して毛皮をトリミングします。
    7. トリミングした皮膚領域に脱毛クリームを60秒未満塗布して、残留毛を取り除きます。.すぐにクリームを取り除き、アルコールワイプを使用して皮膚をきれいにして、皮膚の炎症を防ぎます。
    8. 実験後の注射麻酔の逆転薬としてアチパメゾールを使用してください。.回復中の動物を監視し、通常の呼吸と可動性に戻ることを確認してから、自宅のケージに戻ります。
  2. 組織を透明にする手順
    1. 低体温症を防ぐために、動物の下37°Cに設定された加熱パッドを配置して、イメージングセットアップを準備します。光源とカメラの位置を合わせて画像をキャプチャします。
    2. 0.65 Mタルトラジンヒドロゲル溶液に0.3%-0.4%アガロースゲルを混合して適用します(ステップ1.2)。
    3. スポイトを使用して溶液を皮膚(実験の性質に応じて腹または頭)に塗布し、数秒間放置して吸収を開始します(図3A)。
    4. 綿棒を使用してその部分をやさしくこすり、染料溶液が均一に分散し、皮膚吸収を促進します。
    5. 清潔な綿棒でその部分を優しくマッサージし、皮膚が透明になり始め、内臓が見えるまでさらに溶液を塗布します。吸収中、皮膚は最初にオレンジ - 赤の点の外観を示し、それは徐々に均一な色に融合します。この色の変化は、適切な染料の浸透と光学的クリアリングの開始を示す重要な視覚的指標です。
      注意:溶液が塗布領域で結晶化しないようにしてください-結晶化は皮膚の通路を塞ぎ、皮膚での色素分子の吸収を妨げる可能性があります。色素分子が十分に吸収されると、肌の色がオレンジレッドに変わります。
    6. 皮膚が透明になり始め、内臓が見えてくるまで、その部分を優しくマッサージし続けます。このプロセスは通常、小さな領域でのマッサージに約3〜5分かかりますが、動物のサイズや皮膚の厚さによって持続時間が異なる場合があります。
    7. 位置合わせされたカメラを使用して画像をキャプチャします。フォーカス、露出、ホワイトバランスを調整して、画質を最適化します。
    8. スライドガラスまたはカバースリップを肌にそっと置くと、輝きを最小限に抑え、反射を減らして、より高品質の画像が得られます。
      注意: すべての化学溶液は、適切な個人用保護具(白衣、手袋、目の保護具)で取り扱い、使用済みの材料は機関の化学廃棄物処理プロトコルに従って廃棄してください。

4. 画像処理による臓器の視認性向上

  1. 画像処理の手順
    1. 画像処理には、OpenCVを使用したPythonが使用されます。OpenCV、numpy、matplotlib、PyWavelets をインポートします。
    2. 元の画像をロードして 正規化 します。元の高ビット深度.tif画像を読み込みます。ピクセル値が 255 を超える場合は、すべてのピクセルを [0, 255] の範囲に正規化します。
    3. 関心領域 (ROI) をトリミングします。OpenCV の ROI セレクターを呼び出して、臓器領域の周囲に境界ボックスを描画します。後続のすべてのステップでは、トリミングされたバージョンのみを使用して続行します。
      注意: バウンディングボックスが、関連する構造物を切断することなく、ターゲット領域をしっかりと囲むことを確認してください。
    4. LABチャネルに分割します。トリミングされたカラー画像をLAB色空間に変換し、L(明度)、A、Bチャネルに分割します。
      注:画像はカラーで処理されているため、ラボの色空間は、ピクセル強度が配置されているLチャネルにのみ画像処理技術を適用して使用しました。
    5. ピクセル強度分布を解析します。L チャネルのヒストグラムをプロットして、コントラストと強度の広がりを評価します。
      注:ヒストグラムを使用して、コントラスト強調が必要かどうかを確認し、コントラスト強化のパラメータ選択をガイドします。ヒストグラムを [0, 255] に分散させる必要があります。
    6. CLAHE(Contrast Limited Adaptive Histogram Equalization)を適用して、局所的なコントラストを強化します。clipLimit = 5.0 および tileGridSize = (16,16) の CLAHE オブジェクトを作成します。L チャネルで CLAHE を実行し、CLAHE 拡張 L チャネルを元の A チャネルと B チャネルにマージします。必要に応じて、CLAHEをLABからRGBに変換して視覚化します。
      注: ヒストグラムに過度に増幅されたノイズ (スパイク) が示されている場合は、'clipLimit' または 'tileGridSize' を調整して再適用し、バランスの取れたローカル コントラストを実現します。
    7. コントラスト強調画像のノイズを除去します。正規化された CLAHE L チャネル (スケーリング [0, 1]) で 2 レベルの離散ウェーブレット分解をソフトしきい値 0.1 で実行します。ノイズ除去された L チャネルを再構築し、[0, 255] にスケール バックして、ノイズ除去された L チャネルを元の A チャネルと B チャネルにマージします。元のトリミングされたカラー イメージとウェーブレットでノイズ除去された結果を表示します。
      注: ウェーブレットのノイズ除去は、均一な領域でフォアグラウンドと誤って解釈される可能性のある小さな変動を減らします。
    8. Otsuの適応閾値処理による関心器官のセグメント化。ノイズ除去された L チャネル上の Otsu のしきい値を計算します。しきい値からバイアス 15 を減算して、低強度の臓器領域を含めます。
      1. バイアス値を使用してバイナリしきい値を適用し、臓器ピクセルのマスクを取得します。マスクを元のAチャンネルとBチャンネルとマージし、RGBに変換して表示します。
        注:バイアス調整により、血管の下に臓器領域が強制的に含まれます。必要に応じて、別のデータセットでバイアスを再調整します。
    9. 必要に応じて解析に進みます。

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結果

ex vivoニワトリ胸肉組織における光学的透明性の実証
ex vivo組織を介した光の伝播を調べるために、厚さ1.5 mm、2.5 mm、および3.5 mmの生の骨なし鶏胸肉のスライス片を使用しました(図2B)。組織はコラーゲン繊維と平行に切断され、筋線維の配向が一貫しています。画像は、メッシュグリッドパターンと、異なる溶液濃度で処理する前と後で組織の下に「UT Dallas」ロゴの両方を使用して撮影しました(図2B)。撮影には、焦点距離3.5mm、絞りf/1.4のレンズと組み合わせたCMOSカメラを使用し、サンプルのバックライトにはLED光源を使用しました。次に、各組織の対応する透過データを、UV-VIS-NIR分光計を使用して測定しました(図2C...

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ディスカッション

この研究は、吸収分子、特にFDA承認の食用色素タルトラジン(医療用途ではなく食品での使用が承認されている)を利用して、生体組織で光学的透明性を達成するための包括的で再現性のあるプロトコル法を示しています。この方法は、組織の微小環境内の屈折率を変化させることにより、組織内の内因性散乱を効果的に最小限に抑え、光透過性を高めます。この研究では、 ex vivo イメージングと in vivo イメージングの両方を通じて、この方法の有効性が実証されました。 ex vivo イメージングでは、異なる濃度のタルトラジンが鶏の胸肉組織に及ぼす影響を、異なる厚さの生物学的サンプルで調査しました。結果は、タルトラジンの最適な濃度が鶏の胸肉組織を肉眼で透明にすることができることを示しています。透過率の分光学的測定は、入射光が550nm未満でほぼ完全に吸収されるにもかかわらず、組織を通る光の透過率は、可視スペクトルの波長が長いほど、および近赤外領域に著しく増加することをさらに明らかにしています。これらの波長は深部組織イメージングで一般的に...

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開示事項

すべての著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

ZOは、テキサス大学ダラス校からの支援に感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
分析天びんHZKのFA220S型
動物麻酔機RWDライフサイエンス株式会社太治家吸入麻酔薬
アティパメゾールHCL注射液5mg/mLコバータス82124注射用麻酔
CMOSカメラトールラボCS165CU/M、ゼルックス
デクスメデトミジンHCL注射液5mg/10mLコバータス72960注射用麻酔
ファイバーライトイルミネーターRWDライフサイエンス株式会社76301トップイルミネーション用光源
スライドガラスクラビティサイコ0303-2122スーパーグレード顕微鏡スライド
恒温ブランケットRWDライフサイエンス株式会社69027動物用温度調節器
画像処理オープンCVニシキヘビソフトウェア
インスリンシリンジ 0.5 mL 29 gコンフォートポイント26028注射用麻酔
イソフルランコバータスSKU 029405吸入麻酔薬
ケトミンHCL注射液 100 mg/mLデクラ20042240注射用麻酔
LED光源GGE株式会社TLB-01トップイルミネーション用光源
レンズトールラボMVL4WA型焦点距離3.5mm、絞りf/1.4
ナイル教会&ドワイトL 1224脱毛クリーム
PBS pH 7.4 (1x)ギブコ2902869注射用麻酔
綿棒ピューリタン医療製品会社806-WC病院
シープラークアガロースロンザ50101ケミカル
タルトラジンミリポアシグマCAS番号:1934-21-0ケミカル
移送ピペットフィッシャーブランド13-711-9午前
UV-VIS-NIR 分光光度計島津製作所ソリッドスペック-3700i楽器
バイアルコルパック242633
容積式ピペットエッペンドルフのリサーチプラス3123000063100-1000&マイクロ;L
浄水システムアビディティ科学ソロS楽器

参考文献

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