マウスにおける最適化された低侵襲経強膜網膜下注射技術

サマリー

網膜下注射は、光受容体およびRPE疾患の治療薬の前臨床開発に不可欠な技術です。術中の成功率を改善し、網膜損傷を最小限に抑えるマウスにおける最適化された経強膜網膜下注射技術について説明します。

要約

マウスの網膜下腔への材料送達の従来の方法では、神経網膜の二重穿孔が伴い、広範な外科的損傷を引き起こします。これは、網膜電図 (ERG) 記録や行動視覚アッセイなどの視覚機能のその後の結果測定にばらつきをもたらし、実験的治療薬の有効性評価を混乱させます。これらの障壁を克服するために、マウスにおける経強膜低侵襲網膜下注射技術を最適化しました。この技術では、カスタムメイドのタングステンワイヤーまぶた鏡を使用して上円蓋にアクセスし、結膜腹切開術と腱切開術を行います。ピンポイントの強膜切開術は、網膜を貫通せずにダイヤモンドナイフを使用して行われ、そこから細いガラス針が浅い角度で慎重に挿入されます。ペイロードは、マイクロインジェクションポンプを使用して網膜下腔に送達されます。光コヒーレンストモグラフィー (OCT) は、注射直後の網膜下水疱のサイズと位置を評価するために使用されます。この技術の結果を、33G 針強膜切開術を備えたバネ仕掛けの注射器を使用して実行された従来の経網膜法と比較しました。ERG記録は、経強膜注射マウスの網膜機能の優れた保存を示し、注射されていない対照マウスの網膜機能の保存に匹敵しました。対照的に、従来の注射コホートでは、かなりの ERG シグナルの減少が観察されました。要約すると、マウスの網膜下注射のための低侵襲技術を最適化しました。この技術は、網膜への解剖学的損傷を最小限に抑え、網膜機能への影響を最小限に抑える、遺伝子治療投与のための堅牢で効率的な方法であることを実証します。この方法は、網膜色素上皮と光受容体の両方を標的とし、幅広い網膜および黄斑疾患を治療する治療法の開発の閾値を下げます。

概要

網膜下注射は、網膜と網膜色素上皮 (RPE) の間の潜在的な空間に材料を送達する眼科外科手術です。硝子体内注射や脈絡膜上注射など、後眼部への薬物送達の他の方法と比較して、網膜下注射は、光受容体と RPE の両方への最も即時のアクセスを実現します。ウイルス遺伝子治療粒子の送達の場合、網膜下注射ははるかに高い光受容体とRPE形質導入率を達成し、ウイルス力価を低減し、ウイルス毒性のリスクを低減します¹。さらに、網膜下腔は解剖学的に限られており、ウイルス粒子の全身拡散を制限し、免疫応答のリスクを低下させます²。ヒトでは、網膜下注射の安全性プロファイルは非常に良好であり、網膜の構造と機能は注射後 1 か月以内にベースライン レベルに回復します ^3,4。網膜下注射は、幹細胞移植や低分子^{ドラッグデリ}バリー2など、多くの用途に使用されており、最も一般的な用途は、網膜疾患の遺伝子治療のためのウイルスベクターの送達です。網膜下注射に関連するウイルス力価が比較的低く、全身曝露が最小限に抑えられ、形質導入の速度と特異性が高いため、網膜下注射は網膜分野で不可欠な技術となっています。網膜下注射は、網膜色素変性症やレーバー先天性黒内障などの遺伝性網膜障害の治療に患者にうまく使用されています ^5,6。

この分野にとっての重要性を考慮すると、マウスに網膜下注射を行う能力は、遺伝性網膜疾患の治療法を調査する前臨床研究にとって非常に重要です。しかし、マウス網膜下注射の現在の方法は失敗率が高く、網膜に外科的損傷を引き起こすことが多く、機能的転帰測定の信頼性と一貫性が制限される可能性があります。従来、げっ歯類の網膜下注射は、針が網膜前部を貫通し、水晶体を通過し、網膜^7,8の2回目の貫通の結果として網膜下腔に入るように、網膜下で行われます(図1A)。この手順では比較的簡単に実行できますが、外科的損傷の程度がさまざまであるため、実験結果に著しい不一致が生じます。これは、行動的および機能的視覚結果の測定を利用する研究では特に制限されます。さらに、水晶体は人間と比較してマウスの方が不釣り合いに大きいです。これにより、経網膜注射中に水晶体が損傷するリスクが大幅に高まり、動物は機能的視力評価に使用できなくなります⁴。

別のオプションは経強膜注射経路であり、針が強膜、脈絡膜、ブルッフ膜、およびRPE^を貫通する後方アプローチを使用して網膜下腔にアクセスすることにより、これらの問題を回避します^4,9(図1B)。このアプローチは、網膜の浸透を完全に回避することにより、網膜の損傷を最小限に抑えます。また、網膜下腔¹⁰からの注入された物質の逆流の減少にも関連しており、これにより、より一貫した結果とより小さな実験コホートが可能になります。マウスにおける経強膜網膜下注射の技術は以前に文献に記載されていますが、その広範な採用は、成功率を妨げる可能性のある技術的な困難さによって依然として制限されています⁴。ここでは、経強膜注射手順のいくつかの改善点について説明し、これにより、実行が簡単かつ迅速になり、実験のばらつきが減り、注射の成功率が向上します。これらの改善には、マウスまぶたの検鏡の開発、アトロピンの術前投与、ダイヤモンドナイフを使用したピンポイント強膜切開術の作成、針のサイズと注射アプローチの最適化が含まれます。この技術は、ERG によって検出可能な外科的影響を引き起こすことなく、光受容体と RPE の優れたウイルス形質導入カバレッジを実現します。

プロトコル

すべての実験は、デューク大学の施設動物ケアおよび使用委員会および視覚および眼科研究協会の眼科および視覚研究における動物の使用に関する声明に従って実施されました。

1.動物の準備

1. 網膜下注射を行う30分前に、1 mg / kgのアトロピン(総量50 μL)の腹腔内注射を投与します。このステップは、注射中の一過性の眼圧上昇によって引き起こされる潜在的に致死的な眼心反射および眼呼吸反射を予防することにより、成功率を大幅に向上させます^11,12。
   注:当社のアトロピン投与量はC57BL / 6マウスに最適化されており、他のマウス系統に合わせて調整する必要がある場合があります。アトロピン投与量に顕著な性別や年齢の違いは観察されていません。
2. 手順全体中、マウスを暖かい表面に置いて、動物の快適さを最大限に高め、冷たい白内障の発症を軽減します。
3. 横臥が観察され、動物がつま先をつまむことに反応しなくなるまで、酸素中で2%吸入イソフルラン(2 L / min)を使用してマウスを麻酔します。局所麻酔のために0.5%プロパラカインを眼に滴下します。
4. 0.2% シクロペントレートと 1% フェニレフリンの混合物を眼に一滴塗布して瞳孔を拡張し、OCT による網膜下水疱の術後イメージングを行います。フェニレフリンは、表在血管を収縮させることにより術中出血を減らすのにも役立ちます¹³。

2.強膜切開術

1. 手順を開始する前に、注入する所望の量の溶液をガラスマイクロニードルにロードします。毛細管現象を打ち消すために補償圧力を 5 ヘクトパスカル (hPa) に設定して、針をマイクロインジェクターに取り付けます。通常、網膜下注射には1 μLの容量を使用します。
2. マウスを解剖実体顕微鏡下に置きます。ステップ2.3〜2.6には20倍の倍率を使用し、ステップ2.7〜3.5には50倍の倍率を使用します。
3. 若いマウスの場合は、手術部位の十分なアクセスと視覚化を提供するために、手術の前に側眼角切開術を実施します。
4. カスタムメイドのミニチュアワイヤー検鏡を使用して、上円蓋を露出させます(図1C)。検鏡を固定して、ハンズフリーで上まぶたを引っ込めることができます。
5. 角度の付いたヴァンナスハサミを使用して、上結膜とテノン嚢の傍輪部切開(輪部の後方~1 mm)を行い、強膜の上3〜4時計時間を露出させます。眼窩後静脈洞に穴を開けないように注意してください。意図した注射部位を覆っているテノンのカプセルの残りを慎重に、しかし徹底的に取り除きます。
6. 結膜腹切開術と腱切開術の前縁をロック歯付き鉗子でつかみ、眼球をそっと下導管して上強膜を露出させます。ロックされた鉗子を固定して、ハンズフリーの侵食を可能にします。
7. むき出しの強膜が乾燥するのを防ぐために、バランス緩衝生理食塩水(BSS)をすぐに目に一滴塗布します。また、BSS液滴によって生成される光学倍率も役立つことがわかりました。
8. ダイヤモンドナイフを使用して、輪部から~12時と~1〜2 mmの位置でピンポイントの強膜切開を行います。強膜に対してブレードを接線面に配置して、強膜切開ができるだけ小さく浅くなるようにします。
   注:これは2つの理由で行われます:(1)小さな強膜切開術によりガラス針がしっかりとフィットし、それによって注射ステップ中の逆流が減少し、(2)網膜の貫通を避けるために浅い強膜切開術が重要です。強膜切開部位に少量の脈絡膜血が現れる場合があることに注意してくださいが、これは処置の結果に悪影響を与えるものではありません。

3.経強膜網膜下注射

1. 注射の準備として、外科用スポンジを使用して、目の表面からすべてのBSSをそっと取り除きます。
2. 針を強膜に対して浅い角度で斜めに持ち、先端をゆっくりと慎重に強膜切開術に導入して網膜下腔にアクセスします。網膜への貫通を避けるために、これは比較的浅い角度で、強膜切開口部を0.5〜1 mmクリアするのに十分な深さで行います。
   注:脈絡膜送達の可能性を最小限に抑え、前進する針先で網膜に穴を開ける可能性を減らすために、針の斜角は下向きに配置されます。
3. 針を安定した位置に保持しながら、フットペダルを使用して500 hPaで注入を開始し、15秒間途切れることなく圧力を維持します。
4. 注射を終了するには、針が強膜切開術から完全に外れるまで注射圧力を維持します。針が網膜下腔にまだある間に圧力が時期尚早に停止されると、注入されたペイロードの大部分が毛細管現象によってすぐに目から針に戻ることができます。
5. 針が抜かれたら、強膜切開部位を通る注入された溶液の部分的な逆流に気づきます。これは、成体マウスでも1μLの体積が網膜下腔の容量を超えることを考えると予想されます。逆流がない場合は、不注意による脈絡膜または硝子体内送達による注射の失敗を示している可能性があります。
6. ロック鉗子とまぶたの検鏡を目から取り外します。地球儀に圧力をかけると、注入された溶液がさらに逆流する可能性があるため、注意してください。
7. 注射直後に、十分な潤滑剤の眼軟膏を目に塗布して、OCT¹⁴までに網膜下水疱を視覚化できるようにします。
8. 局所エリスロマイシン軟膏を目に塗布し、動物に一般的な術後ケアを提供します。

結果

この経強膜技術を使用した注射が成功すると、注射手順の直後にOCTで観察可能な網膜下水疱が生成されます(図2A)。この技術の技術的課題を考えると、注射に成功した動物を特定するにはイメージングステップが不可欠です。遺伝子治療実験にこの技術を使用する予定の研究者には、蛍光レポーター遺伝子を保有するアデノ随伴ウイルス(AAV)粒子による練習注射を行うことをお勧めします。この技術を使用して送達されたAAV粒子は、RPE(図2B)、光受容体(図2C、D)、またはそれらの組み合わせ(図2E、F)の非常に大きな形質導入領域を達成します。形質導入された領域は通常、鋸歯口から視神経乳頭を越えて下に伸びています。他の網膜下注射技術と同様に、形質導入効率は通常不均一に分布し、水疱の中心の領域でピークに達し、中心から離れると徐々に減少します(

ディスカッション

ここで説明する技術は、前述の経強膜注射アプローチ⁴ にいくつかの改善をもたらし、手順の信頼性を高め、眼への外科的損傷をさらに軽減します。そのような改善点の 1 つは、検鏡を使用して上まぶたを引っ込めることであり、安定して、邪魔にならず、ハンズフリーで目にアクセスできるようになります。市販の鏡は、成体のマウスであっても最適化が不十分であることが多く、幼体にはまったく利用できません。この障害を克服するために、私たちは特注の鏡を設計しました(図1C)、その小さな直径と顕著な剛性を考慮して、市販の細いタングステンワイヤーを使用して製造しました。これにより、処置の実行が容易になり、成功率が向上し、注射ごとに費やす時間と労力が大幅に削減されます。同様に、ロック歯付き鉗子を使用して眼球を下に導き込み、安定したハンズフリーの方法で注射部位を露出させます。上まぶたの検鏡とロッキング鉗子の組み合わせにより、外科医は強膜切開術と注射を両手で行うことができ、この繊細な処置の成功を最大限に...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.9%塩化ナトリウム注射、USP	ホスピラ	PAA130066
1% 硫酸アトロピン点眼液、USP	アコーン	NDC 17478-215-05
30&度;ダイヤモンドナイフ	カテナ	K2-6560
AmScope 6W LEDデュアルグースネックイルミネーター	アムスコープ	LED-11CR
アングルドヴァンナスハサミ	ロボズ	RS-5618
BSS滅菌灌漑ソリューション	アルコン	289010-0902
シクロミドリル拡張点眼薬	アルコン	0065-0359-02	0.2%シクロペントレート、1%フェニレフリン
epT.I.P.S. MicroloaderTMピペットチップ	エッペンドルフ	5242 956.003
FemtoJet 4iマイクロインジェクター	エッペンドルフ	E5252000021	生産終了品
GenTeal Tears 潤滑眼軟膏	アルコン	16027802
ガラス製マイクロインジェクション針	クランベリーサイエンティフィック	B100-58-50	30&度;斜面。直径:50&マイクロ;m アウター、29 & マイクロ;M インナー
イソフルラン溶液	コベトラス	29405
画像誘導OCT付きMICRON IV網膜イメージング顕微鏡	フェニックス	該当なし
実体顕微鏡 SteREO Discovery.V8	ツァイス	495015-0001-000
Stern-Castroviejoロッキング歯付き鉗子	カテナ	K5-2552
歯付き鉗子	ロボズ	RS-5172
23sゲージ針用タングステンクリーニングワイヤー	ハミルトン	18306
ウルトラセルPVAアイスピア	BVIメディカル	40400-8
Ultra-Fine2015インスリン注射器	BDの	328438	3/10 mL、8 mm (5/16インチ)、31G