Method Article

同時ラベルフリー自家蛍光多高調波顕微鏡

DOI:

10.3791/68637

⸱

August 29th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Beckman Institute for Advanced Science and Technology, University of Illinois Urbana-Champaign, 2Department of Bioengineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 3Department of Electrical and Computer Engineering, University of Illinois Urbana-Champaign, 4NIH/NIBIB Center for Label-free Imaging and Multiscale Biophotonics, University of Illinois Urbana-Champaign

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、レーザー光源の生成方法、組織サンプルの調製方法、イメージングの実施方法、およびデータの分析方法の詳細を含む、同時ラベルフリー自家蛍光多重高調波(SLAM)顕微鏡技術のステップバイステップガイドを提供します。SLAMは、組織微小環境を調査するために4つの相補的なラベルフリーコントラストを測定することにより、非線形顕微鏡を進歩させます。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

非線形光学顕微鏡は、超短レーザーパルスと内因性分子との非線形相互作用からの信号を検出することにより、生体試料を画像化します。この方法により、標識またはタグフリーの非破壊的な方法で細胞内分解能で化学的および構造的同定を迅速に行うことができ、それによって細胞や組織を調査するための強力なアプローチが可能になります。これらの特徴的な非線形コントラストには、多光子励起自家蛍光と高調波発生が含まれます。これらのコントラストにはそれぞれ独自の利点と制限があるため、それらの組み合わせと時空間の共登録により、非線形光学顕微鏡の分析能力を強化する補完的なコントラストパレットが提供されます。そこで、私たちのグループは、生体試料の異なる形態学的、代謝的、機能的特徴を特定することを目的として、同時に生成される4つ以上の非線形光信号を測定するイメージング技術である同時ラベルフリー自家蛍光多重高調波(SLAM)顕微鏡法を開発しました。ここでは、レーザー光源、パルス圧縮、顕微鏡などの技術の重要なコンポーネントに焦点を当てて、組織のSLAMイメージングのプロトコルを紹介します。さらに、サンプルの調製について説明し、SLAMデータのデータ処理パイプラインの概要を説明します。提示されたワークフローは、外因性標識に依存することなく、ヒトと動物の両方の組織の代謝状態、配置、細胞応答、および組成を調査するのに適しています。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

非線形光学顕微鏡は、強い光放射(電界が3 × 103 V / cmを超える光)に対する標本の応答を利用して画像のコントラストを導き出し、誘導偏光(したがって生成される信号)は入射強度1,2,3に非線形に依存します。これらの複数のコントラストはそれぞれ異なる光と物質の相互作用によって媒介されるため、非線形顕微鏡は、試料1,2,3の形態と化学的景観の両方に関する固有の情報への同時アクセスを提供します。照明光との線形相互作用を伴う従来の顕微鏡技術は定量的イメージングも可能になりますが、非線形顕微鏡はよりマルチモーダルなアプローチを可能にし、多くの場合、イメージング深度と光学セクショニングを改善しながら、サンプルへの光損傷も少なくします4。組織の術中組織学様評価などの生物医学的応用の文脈では 5,6、この技術により、天然生体分子の直接プロービングが可能になり、外部マーカーや修飾を必要とせずに生細胞のシームレスな調査が容易になります。このアプローチは、タグ、ラベル7、外因性分子、遺伝的に発現した蛍光タンパク質、またはナノ粒子の使用を回避し、これらは多大な労力を必要とするだけでなく、標本の本来の生化学を破壊し、標的細胞または組織に悪影響を与える可能性があります8,9,10.したがって、非線形顕微鏡は、試料の化学的および構造的完全性を変えることなく、微視構造の連続イメージングを提供する強力で本物の分析ツールとして機能します。この機能により、診断や創薬から細胞シグナル伝達やシステム生物学に至るまで、幅広いアプリケーションが開かれます。

2 光子自家蛍光 (2PAF)、3 光子自家蛍光 (3PAF)、第 2 高調波発生 (SHG)、第 3 高調波発生 (THG) などの多光子コントラストは、それぞれサンプルの特性評価において分析上の利点をもたらします。2PAFは内因性フラビンによって生成され、フラビンアデノシンジヌクレオチド(FAD)は生物学的システムで最も豊富です11。3PAFは、近赤外励起を利用してNAD(P)Hなどの固有の発色団を視覚化し、UV関連の光毒性と減衰の問題を回避しながら代謝イメージングを可能にします12。SHGは、線維性コラーゲン(タイプI、II、およびIII)やタンパク質配列13、14、15、16、17などの非中心対称分子構造を具体的に明らかにし、構造的洞察を提供します1。最後に、THGは界面や小さな構造的特徴に敏感で、脂質分布と細胞外小胞のイメージングに優れています18,19,20,21,22。

これらのコントラスト信号のそれぞれは、研究グループによって独自に調査されており、生物学的応用のための信頼性が高く用途の広いツールとして多光子非線形顕微鏡のニッチを確立しています23,24,25,26。これらの取り組みは、2PAF顕微鏡の発明者によって先頭に立って行われ、革新的な技術を活用して、組織の形態、細胞代謝、さらにはアルツハイマー病や癌などの病状の形態機能的特徴について新たな洞察を得ました23。彼らの研究は最終的に神経科学における画期的な応用を推進しました27,28。その後の数年間で、何人かの研究者が、細胞に構造的サポートを提供し、癌の病因の間に実質的な変化を受ける足場である細胞外マトリックスの変化に対するSHGの感受性を強調しました29。特に、Campagnolaら14,24,30,31は、SHG顕微鏡により高分子および超分子アセンブリの視覚化が可能になり、従来の蛍光ベースの技術では検出できなかったコラーゲンの配置、濃度、種類などの詳細が明らかになることを実証しました。これらの結果は、臨床現場で実行可能な診断ツールとしての SHG 顕微鏡の可能性を強調しました。最後に、THG顕微鏡を適用して、げっ歯類の網膜層を細胞内分解能で視覚化することに成功しました25、脳構造をマッピングし32、および黒色腫細胞浸潤の多界面トポグラフィーをキャプチャしました33。

非線形顕微鏡のこれらの歴史的な実装は、一般に、非線形信号を生成および収集するために、高開口数(NA)対物レンズに結合されたモードロックフェムト秒(fs)レーザーを含み、次にダイクロイックミラーでバンドパスフィルターに向けられ、光電子増倍管(PMT)34で収集されました。同様の実装にもかかわらず、ほとんどのアプリケーションは、他のコントラストを無視して、1 つ、または最大で 2 つのコントラストのみを取得することに重点を置いていました。多光子顕微鏡の可能性を最大限に引き出すために、Boppartらは最初に複数の非線形コントラスト21、35、36、37の逐次取得を実装し、続いてそれらの同時検出4,22,38,39,40,41を実装しました.得られた技術は、同時ラベルフリー自家蛍光多重高調波(SLAM)顕微鏡として知られ、シングルショット励起と多重検出を通じて非線形2PAF、3PAF、SHG、およびTHG信号を空間的および時間的に共登録し、それによって優れた分析能力を実現します。これら4つのチャネルの時空間共局在化は、高度にランク付けされた特徴豊富なデータ42を提供し、モーションアーティファクトを排除し、画像レジストレーションの改善を保証することにより、順次取得されたデータよりも利点を提供します。その結果、SLAMは、代謝特性を効果的に特徴付ける光還元酸化比などの複合特徴の生成を可能にします43,44,45。さらに、モダリティ間での信号の複合分析により、チャネルの相関と共局在化に基づく追加機能のエンジニアリングが容易になります。たとえば、Shiらは、医薬品製造に使用されるチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を正確に分類する際のSLAM顕微鏡の共局在化機能の重要性を実証しました42。このようにして、SLAMは、現在多光子顕微鏡の最先端と見なされているものの基礎を築き、この分野の将来の進歩への道を切り開きます46。

このプロトコルでは、SLAM顕微鏡の主要コンポーネント(図1)を概説し、その実装のための段階的な方法論について説明します。これには、励起パルスの生成と整形、代表的な組織標本の調製、イメージング手順、処理、および結果データの表示が含まれます。既製の技術と確立された技術を利用することで、このプロトコルは普遍的で転送可能であり、異なる研究室間で同様の光学システムを使用して簡単に再現できます。

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図1:同時ラベルフリー自家蛍光多重高調波(SLAM)顕微鏡の光学設計。 フェムト秒レーザーは、10 MHz の繰り返し速度で 370 fs パルスで 1040 nm の光を出力します。レーザーの強度と偏光は、フォトニック結晶を励起して超連続体を生成する前に慎重に制御されます。次に、パルスはパルスシェイパーによって圧縮され、カスタマイズされたレーザー走査顕微鏡(破線のボックス)に向けられます。ダイクロイックミラーとバンドパスフィルターは、光電子増倍管(PMT)やハイブリッド光検出器(HPD)などの高感度光子検出器で検出される前に、サンプルによって生成された非線形信号を分離します。光学設計は、前述のシステム41に基づいている。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

すべての動物実験は、イリノイ大学施設動物管理および使用委員会によって承認されたプロトコル UIUC#23031 に従って実施され、関連するすべてのガイドラインと規制に厳密に従いました。

1. フォトニック結晶ファイバー (PCF) の切断と整列

  1. ファイバーカッターまたはワイヤーカッターを使用して、フォトニック結晶ファイバー(PCF、 材料表)のセクションを15cmをわずかに超える長さに切断します。
    注:切断中にPCFをしっかりとクランプするためにこの長さが必要なため、少なくとも1.5 cmの長さがPCFの両端から切断されます。この研究で使用されたPCFの最終的な長さ(12 cm)は、一般化非線形シュレディンガー方程式47 と実証検定を使用した以前のシミュレーションに基づいて決定されました。一般に、最適な PCF 長は、PCF タイプ、励起レーザー入力、および目的の超連続体によって異なる場合があります。
    注意: PCF を切断するときは、実験者の目と皮膚を保護するために個人用保護具 (PPE) を着用してください。繊維スクラップは直ちに鋭利物処理容器に廃棄してください。
  2. ファイバーストリッパー(材料表)またはカミソリの刃を使用して、PCFの両端から約3cmのプラスチックコーティングを剥がし、ティッシュペーパー(材料表)と100%メタノールでプラスチックをきれいにします。
  3. PCFの一端を精密光ファイバー包丁(材料表)のホルダーに置き、PCFの端から1.5cmの位置にブレードを合わせます。慎重にクランプを閉じ、 劈開 ボタンを押します。
    注: PCF を切断するための特定のガイドラインを含む、ファイバー クリーバーのユーザー マニュアルに注意深く従ってください。繊維張力などの設定では、PCF の種類ごとに一貫した高品質の切断を実現するために微調整が必要になる場合があります。
  4. ガラス繊維処理ワークステーション(材料表)で統合顕微鏡(倍率10×)を使用してPCFの切断面と側面を検査し、切断が良好な品質であることを確認します(図2A、C)。破片(図2D)、傷(図2E)、または切断面が平らでなく、PCFの長さに対して垂直でない場合は、再切断します(図2B)。
    注:このステップとその後のステップでは、損傷を引き起こさないように、PCFの切断端が表面に触れないように細心の注意を払う必要があります。
  5. PCF の 2 番目の端を切断し、希望の最終長さを確保します。
    注:このプロトコルで使用されるPCFは12cmにカットされています。
  6. 前の手順と同様に、PCF の新しく切断された端を検査します (手順 1.4 を参照)。切断に欠陥があるか、一貫性がないと思われる場合は、現在の PCF を破棄し、新しい PCF でプロセスを繰り返します。
  7. PCFの入力端を3軸ステージ(材料表)に、定規で測定したファイバーカップリングレンズの焦点距離とほぼ同じでクランプします。PCF のもう一方の端を一時的なポストまたはマウントでしっかりとサポートします。
    注意: クランプ グロス調整中にPCFが破損しないように、出力をまだ固定してください。
    注意: レーザー被ばくのリスクを軽減するには、出力端を支え、十分なビームブロックで囲む必要があります。
  8. PCFの直前のビーム経路に光パワーメーター(材料表)を配置して、入力パワーを測定します。レーザーをオンにする前に、フェムト秒レーザー(材料表)がシャッター1でブロックされていることを確認してください。
    注: レーザーの使用に関連するリスクを理解するために、必要なレーザー安全トレーニング プログラムを常に完了してください。
    注意: レーザーを操作するときは、使用中のレーザーの波長と出力に合わせて特別に定格された適切なレーザー安全メガネを着用してください。レーザーを操作する前に、危険な迷走反射を引き起こす可能性のあるジュエリー、時計、その他の反射物をすべて取り外してください。
  9. レーザーの電源を入れ、レーザーが指定した「コールドウォームアップ時間」までウォームアップします。シャッター1を開き、偏光ビームスプリッターの直前で半波長板(HWP1)を使用して、パワーメーターが260mW以下になるまでパワーを調整します。
    注:アライメントに260 mWを使用することは、IRビューアまたは蛍光ターゲットで視覚化するための明るいビームを提供しながら、PCFの損傷を回避するのに十分な低さであると経験的に決定されました(アライメントがずれているときでも)。
  10. シャッター1を使用してレーザーをブロックし、パワーメーターをPCFの出力端に移動します。
  11. レーザーのブロックを解除し、パワーメーターに信号が表示され、PCFのコア、クラッディング、またはプラスチックコーティングに光が結合されていることを示すまで、3軸ステージを使用してPCF入力面の光軸を調整します。ビームの焦点にPCF入力を配置する位置が3軸ステージの範囲外にある場合は、レーザーをブロックしてから、PCFを調整して再クランプします。
    注:赤外線(IR)ビューアまたは蛍光ターゲットを使用して、ビームが焦点を合わせている場所を視覚化できます。
  12. 3軸ステージを使用して、PCFの光軸の1次元を調整して、光が結合する範囲を求め、その範囲の中間を計算して、そこにステージを移動させます。2次元についてこれを繰り返して、ビームをPCFのコアのほぼ中央に配置します。
    注:3軸ステージのμm目盛りは、距離を測定し、PCFの中心を見つけるのに役立ちます。
  13. 結合効率を最適化しながら、3軸ステージの3次元を繰り返し調整し、ビームをPCFのコアに正確に中心に配置して焦点を合わせます。
    メモ: パワーメーターで測定した最大結合効率が入力電力の80%より著しく低い場合は、シャッター1を閉じて、PCFのクランプを外し、損傷がないか検査します。損傷している場合は、手順1.1から再起動し、それ以外の場合は、レーザーをブロックし、PCFを再クランプし、手順1.11からアライメントを再開します。
  14. シャッター1でビームを遮断し、レーザー出力を1.6Wに上げます。
    注:1.6 Wの使用は、PCFの損傷しきい値を下回りながら、十分に広い超連続体を生成するために、シミュレーションと実証テストによって決定されました。
  15. シャッター1を開き、もう一度3軸ステージを繰り返し調整してPCF入力位置を調整し、結合効率を最適化します。
    注:経験的には、最大効率は通常約80%です。
  16. シャッター1を閉じ、PCFの出力をパラボラミラーの焦点距離にほぼクランプします。放物面鏡の出力にビームブロックを配置します。
  17. レーザー出力を再び260mW以下に下げます。
  18. シャッター1を開き、パラボラミラーの3軸ステージを使用してパラボラミラーの光軸を揃え、ビームの歪みを最小限に抑えます。次に、焦点を調整し、遠方場でビームをコリメートします。
    注:IRビューアまたは蛍光ターゲットを使用して、出力ビームを表示します。
  19. 放物面ミラーの後のミラーを調整して、ビームが光学システムの残りの部分に位置合わせされていることを確認します。
    注:このステップを再現できるように、恒久的なフリップアライメントターゲットまたはアイリスを取り付けます。
  20. シャッター 1 を閉じ、レーザー出力を 1.6 W に上げます。シャッター 1 を開き、ビーム パスが変化しないことを確認します。
  21. パワーメーターを使用してパルスシェイパー(材料表)の出力電力を測定します。パルスシェイパー(HWP3)の前で半波長板を回転させて、パルスシェイパーの伝送効率を最適化します。

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図2:フォトニック結晶ファイバー(PCF)の切断端。 (A、B)劈開の側面の画像。(C-F)劈開の顔の画像。(A)よく切断されたPCFは、平らで垂直な面を持っています。(B)角度が付いて欠けた面を持つ、切断が不十分なPCF。(C)きれいな面でよく切断されたPCF。(D) 表面に汚れがある PCF の取り扱いを誤ったもの。(E)表面に傷のある切断が不十分なPCF。(F) 交換された古いPCF。PCFの中心にある黒い斑点で見られるように、PCFのコアに目に見える損傷があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2. パルスの特性評価と最適化

  1. 分光計または光スペクトラムアナライザ(OSA、 Table of Materials)を使用して、放物面鏡の後のレーザーを測定し、PCFの超連続体生成を確認します。
  2. 偏光ビームスプリッター(HWP2)の後に半波長板を回転させて、超連続体の幅を最適化します。
  3. 顕微鏡用自己相関器(材料表)をオンにします。ソフトウェアを使用して、検出器を内部検出器に設定し、スキャン範囲を5 psに設定して、パルス自己相関の全幅がキャプチャされるようにします。
    メモ:パルス幅が長いセットアップ(たとえば、長いPCFでの分散による)では、スキャン範囲を適切に拡大する必要があります。強度自己相関器によって測定されたパルス幅は真のパルス持続時間ではありませんが、それでもパルス圧縮の有用な基準として役立つことに注意してください。パルス振幅と位相の両方を正確かつ完全に特性評価するには、周波数分解光ゲーティング(FROG)48 などのスペクトル分解技術を使用する必要があります。
  4. レーザーのブロックを解除し、信号が表示されるまでパルスシェイパーから出るビームに自己相関器を合わせます。
    注:一時的なミラー(自己相関器の入力に2つ、出力に2つ)を配置すると、光学系の残りの部分に影響を与えることなく、ビームを自己相関器に位置合わせできます。
  5. シャッター2が閉じていることを確認し、対物レンズに適切な浸漬媒体(水や油など)を塗布します( 材料表)。自己相関器の外部検出器を顕微鏡ステージ(材料表)に置き、ステージを調整して検出器を対物レンズの真上に配置します。
    注:一般的な顕微鏡対物レンズとは異なり、SLAM顕微鏡に使用される推奨対物レンズは、THG38の検出を改善するために紫外線透過性です。
  6. 走査検流計ミラー(材料表)をオンにして、電圧をゼロに設定します。シャッターを開き、IRビューアまたは蛍光ターゲットを使用して、ビームが外部検出器に到達していることを確認します。
  7. 自己相関器検出器を外部検出器に設定します。信号が表示されるまでステージの位置を調整します。
    注意: 検出器が飽和した場合は、中性密度フィルターを使用して電力を下げます。
  8. パルスシェイパーの多項式係数(分散次数)を調整して、自己相関器によって測定されたパルス幅を反復的に最小化します。パルス幅が小さくなるにつれて自己相関器のスキャン範囲を適切に縮小し、自己相関関数の精度と可視化を向上させます。
    注:ガウスフィットで測定された最適なパルス幅は、数十フェムト秒(fs)である必要があります。

3. サンプル調製

注:わかりやすくするために、このプロトコルではex vivo 組織イメージングについて説明します。ただし、SLAMのラベルフリーの性質により、 in vivo イメージング手順は簡単に適応できます38。

  1. CO2窒息またはその他のIACUCが承認した安楽死方法によって動物を安楽死させます。
  2. 死後10分以内に標準的な剖検手順49 を使用して目的の臓器を採取し、事前に冷却したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)ですすぎ、血液を除去します。
    注:この研究では、肝臓と肺が採取されました。
  3. 分析に必要な向きに応じて、ブレードを使用して臓器を垂直または水平に解剖します。組織構造の完全性を維持するために、解剖が正確に行われることを確認してください。
  4. 組織片をフェノールレッドフリーの完全細胞培養培地で満たされた滅菌組織培養皿に入れます。画像をすぐに収集しない場合は、組織を4°Cで冷蔵します。
    注:この研究で使用した細胞培養培地は、10%ウシ胎児血清(FBS)、4 mMグルタミン、および内皮細胞増殖培地サプリメントを添加したHEPES緩衝ダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)でした(材料表)。この培地は、イメージング期間中、腎組織サンプルに存在する上皮細胞および内皮細胞の生理学的生存率を維持するために慎重に選択されました50。
  5. 蛍光校正標準を調製するには、静電気防止計量ボートの重量まで精密スケールをゼロにし、約5 mgのフラビンアデニンジヌクレオチド二ナトリウム塩(FAD、 材料表)または5 mgの還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド二ナトリウム塩(NADH、 材料表)を測定します。
  6. シングルチャンネルピペットを使用して、事前に計量されたFADまたはNADH粉末を含む計量ボートに適切な量の1 M HEPESバッファーを分注し、5 mMのストック溶液を調製します。上下に繰り返しピペットをかけて粉末を溶解します。
  7. 原液から1:5希釈してHEPESバッファーに1 mMの作業溶液を調製します。
    注:この研究で使用された1 mMの作業濃度は、検出器の飽和を回避しながら高いシグナルを生成するように経験的に決定されました。
  8. ストックFADおよびNADH溶液を4°Cの微量遠心チューブに保存します。
    注:溶液標準は冷蔵で数日間保存できますが、実験ごとに新鮮な溶液を調製することをお勧めします。
  9. SLAM顕微鏡画像を収集する直前に、組織サンプルを35 mmのガラス底イメージングディッシュに入れます(材料表)。または、ガラスカバーガラスを使用してください。FADおよびNADH溶液を同一の皿またはカバーガラスに分注します。
    注:バックグラウンド信号が減少するため、コーティングされていないガラスまたはポリ-D-リジンコーティングされたガラスを強くお勧めします。ガラスの厚さが、使用している顕微鏡の対物レンズに適切であることを確認してください(この研究では#0を使用しました)。

4. SLAMのセットアップと操作

  1. PCFへのレーザー入力がシャッター1によってブロックされていることを確認し、レーザーのスイッチを入れます。レーザーの指定された「コールドウォームアップ時間」までレーザーをウォームアップします。
    注: この研究では、レーザーに 30 分間のコールド ウォームアップ時間が使用されます。
  2. ビーム経路に障害物がないことを確認し、PCF の直前のビーム経路に光パワーメーターを配置します。シャッター1を開き、入力電力を測定します。
  3. シャッター1を閉じ、パワーメーターを放物面鏡の後のPCFの出力に移動します。シャッター1を開き、入力3軸ステージを使用してPCF出力を最大化します。
  4. PCFを10分間ウォームアップしてから、出力電力を再び最大化します。PCF の送信を記録します。トランスミッションが 50% を下回った場合は、PCF を交換してください。
    注:SLAM顕微鏡の操作中(次の手順)は、一貫したデータを確保するために、PCFの出力電力を1時間ごとに測定することをお勧めします。
  5. 中性密度(ND)フィルターの後にパワーメーターを移動させ、フィルターを回転させてサンプルに到達するレーザー出力を制御します。
    メモ:測定された電力に残りの光学部品の透過率を掛けます。透過率は、対物レンズの後にパワーメーターを配置することによって測定されます。この研究では、サンプルで20mWの平均レーザー出力を使用しました。レーザー出力は、サンプルの損傷や検出器の非線形性を回避しながら高品質の画像を生成するために、特定のサンプル、イメージング深度、および顕微鏡システムについて経験的に決定されました。決定的な標準はありませんが、典型的なラベルフリー多光子イメージングは、数十から数百ミリワット7,32,33,51,52に制限されています。
  6. 検流計の電源を入れてステージングします。取得ソフトウェアを開き、イメージングに必要なパラメータを入力します。
    注:この研究では、512×512ピクセルと13.65μsのピクセル滞留時間を使用して、360×360μm2の視野を画像化しました。0.333Hzで撮影された5つのフレームを1つの高品質フレームに平均化しました。
  7. 手順2.5で使用したように、対物レンズに適した浸漬媒体を使用してサンプルをステージ上に置きます。
  8. 部屋の照明を消し、カーテンを閉めます。
    注意: 検出器の損傷を避けるため、検出器がオンになっているとき、または検出器のシャッターが開いている間は、部屋の照明をオンにしないでください。
  9. 検出器の電源とアンプのスイッチを入れます。
  10. ステージを囲むライトボックスを閉めます。
  11. 電子制御スイッチを使用して、検出器シャッター(S3、S4、S5、S6)を手動で開きます。
  12. 顕微鏡取得ソフトウェアで、[ クリックして取得を開始] をクリックして、SLAM画像の収集を開始します。サンプルに焦点が合うまで、顕微鏡ステージコントローラー(材料表)のノブを回して、顕微鏡の焦点を調整します。
    注:ガラスカバーガラスは強力なTHG信号を生成し、顕微鏡ステージコントローラーに表示されるステージ位置を使用してイメージングの深さを正確に決定するために使用できます。たとえば、この研究で撮影された溶液標準のすべての画像は、カバーガラスの20μm上の焦点面で撮影されました。
  13. 顕微鏡ステージコントローラーのジョイスティックを使用して、サンプル内の目的の視野を見つけ、[ 停止してリセット]をクリックします。
    メモ:画像が飽和している場合は、手順4.5に戻り、電力を下げます。画像の信号対雑音比が 10 未満の場合は、代わりにパワーを慎重に上げることができます。
  14. [ 保存] タブで、[ データの保存] をクリックして [はい]に切り替え、[ クリックして取得を開始]をクリックします。取得が完了するまで待ってから続行します。
  15. イメージング中にサンプルを変更または操作するには、検出器のシャッターを閉じ、懐中電灯またはヘッドランプを使用して光を当てます。サンプルを変更したら、手順 4.10 に戻ります。
    注:再現性と定量分析を可能にするには、FADおよびNADH溶液標準のSLAM画像を収集します。視野、画像サイズ、励起力が生体サンプルに使用されたものと一致していることを確認してください。
  16. SLAM画像取得を終了するには、検出器のシャッターを閉じ、検出器をオフにしてから部屋の照明を点灯します。
  17. シャッター1を使用してレーザーをブロックし、レーザーをオフにします。
  18. 検流計とステージをオフにします。顕微鏡取得ソフトウェアを閉じます。
  19. ティッシュは適切に廃棄し、職場を清掃してください。

5. データの可視化

注:次の画像解析は、ImageJ53 (材料表)などの画像解析ソフトウェア、またはPythonやMATLABなどの画像解析機能を備えたプログラミング言語で発生する場合があります。次の手順では、ImageJを使用してデータの視覚化を実行する方法について説明します。

  1. 各チャンネルの画像がロスレス画像形式(TIFFやPNGなど)であることを確認してください。
    注:この研究で使用されたカスタム顕微鏡制御ソフトウェアは、画像をTIFFとして自動的に保存しました。画像を TIFF として保存するには、ImageJ で画像を開き、[ ファイル] > [名前を付けて保存] > [Tiff] を選択します。
  2. 照明標準画像を生成するには、FAD溶液とNADH溶液のFADチャネル画像とNAD(P)Hチャネル画像をそれぞれImageJで開きます。画像ごとに、「 処理>フィルター」>「ガウスぼかし...」を選択し、「 シグマ(半径)」 を「41」に設定して、「 OK」をクリックします。
    メモ:必要に応じてガウスフィルターの シグマ(半径) を調整して、画像を十分に滑らかにします。
  3. 不均一な照明を補正し、蛍光強度を正規化するには、サンプルのFADおよびNAD(P)Hチャネル画像を開きます。画像ごとに[ 画像計算機>処理]を選択し、[ 画像1 ]でサンプル画像を選択し、[ 操作] で[ 分割]を選択し、[ 画像2 ]でサンプル画像のチャンネルに対応する照明標準画像を選択して、[ OK]をクリックします。
    注:このステップは、システムの変動性を補正し、光学酸化還元比(ORR)などの自家蛍光の定量的評価の一貫性を維持するために重要です。
  4. より大きな視野またはZスタックを形成するために複数の画像を撮影する場合は、画像をつなぎ合わせるか、1つの画像または画像のスタックに結合します。
  5. ORR画像を生成するには、まずFAD画像とNAD(P)H画像を合計します。[ 画像計算機>処理...]を選択し、[ 画像1 ]と[ 画像2]でそれぞれFADチャネル画像とNAD(P)Hチャネル画像を選択し、[ 操作] で [追加]を選択して、[ OK]をクリックします。ORRイメージを計算するには、プロセス >イメージ計算機...を選択し、 イメージ1 でFADチャネルイメージを選択し、 操作 で 除算を選択し、 イメージ2 でFADとNAD(P)Hの合計の結果を選択してから、[ OK]をクリックします。
  6. ORR 画像にカラーマップを適用するには、[ 画像] > [カラー] > [LUT の編集] を選択し、[ 開く] をクリックし、目的のルックアップ テーブル (.lut) ファイルを選択して [OK] をクリックします。[ 画像]>[明るさ/コントラスト>調整 ]を選択し、必要に応じてコントラストを調整します。
    注:この研究で使用した(反転)CET-I254,55カラーマップなどの等光カラーマップを使用することをお勧めします。カラーマップを画像に適用した後、ImageJ でカラーマップを反転するには、[画像] > [カラー] > [LUT を反転] を選択します。
  7. ORR画像の特徴の鮮明さを向上させるには、蛍光チャネルの強度で明るさをスケーリングします。まず、FADとNAD(P)Hの合計の結果を選択し、 プロセス>コントラストの強化...を選択し、 正規化が オンになっていることを確認してから、 OKをクリックします。 [編集]>[コピー ]を選択して、この結果をクリップボードにコピーします。次に、ORR画像を選択し、 画像>タイプ>RGBカラー」を選択し、 次に画像>タイプ>HSB(32ビット)を選択します。画像の下部にあるスライダーを右端まで動かして 明るさ チャンネルを表示し、[ 編集>貼り付け]を選択してから、[画像] > [タイプ] > [RGB カラー] を選択します。
  8. SLAM画像を合成として視覚化するには、ImageJで4つのSLAMチャネルを開き、 画像>カラー>マージチャネル ... C2(緑)の場合はSHGチャネル画像を選択し、 C5(シアン) の場合はNAD(P)Hチャネル画像を選択し、 C6(マゼンタ) の場合はTHGチャネル画像を選択し、 C7(黄色) の場合はFADチャネル画像を選択します。 [コンポジットの作成 ] がオンになっていることを確認し、[ OK] をクリックします。

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Results

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SLAM顕微鏡の複雑なマルチチャネル、マルチモーダルアプローチ(図1)により、新規ユーザーが問題のトラブルシューティングや結果を理解することが困難になる場合があります。まず、よく切断されたPCFは、PCFの長さに垂直な平らな表面を持つきれいな面(図2C)を特徴としています(図2A)。角度の付いた欠けた劈開面(図2B)と傷の存在(図2E)は、劈開不良を示しています。 図2D に示すPCFの表面の汚れや破片は、切断後のPCFの切断不良または不適切な取り扱いを示しています。最も重要なことは、空気穴のハニカムパターンに囲まれた小さな中央領域であるPCFのコアには、切断が成功すると破片や傷があってはなりません。とはいえ、特にPCFの外側のクラッディングに小さな傷やいくつかの破片が見られるのは正...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SLAMイメージングを成功させるには、適切なスーパーコンティニュームを生成することが重要ですが、PCFのセットアップが複雑なため、困難な場合があります。PCF の正確な切断と慎重な取り扱いを確保することは、効果的な結合、超連続体生成を妨げ、さらには PCF の寿命を縮める可能性のある破片、汚れ、傷のない清潔な表面を維持するために不可欠です。PCF は定期的な交換が必要なため、ファイバー切断を練習し、包丁の設定を微調整することで、最適な切断を実現できます。さらに、PCF の正確な位置合わせと、目的の超連続体を確実に生成するには、各使用前に定期的に再調整することが重要です。位置ずれもPCFを損傷する可能性があります。PCFによる超連続体生成はSLAM顕微鏡の重要な側面であるため、PCFコアのサイズと長さの選択は重要な考慮事項です。PCFが長いほど、より広い超連続体を生成できます。ただし、出力電力が低下し、分散が増加し、設置が複雑になり、交換コストが増加する可能性があります。コアサイズが小さいPCFは、より広い超連続体を生成することもできますが、コア直径が大きい場合と比較して...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は利益相反を宣言しません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究で使用された機器の資金は、ベックマン先端科学技術研究所の光学分子イメージングセンターを通じてGSKから部分的に提供されました。この研究は、NIH/NIBIB ラベルフリーイメージングおよびマルチスケールバイオフォトニクスセンター(CLIMB)(P41EB031772)およびNSF定量細胞生物学科学技術センターによっても部分的に支援されました。K.K.D.T.はNIEHS毒物学・環境衛生研究研修プログラム(5T32ES007326-25)の支援を受け、A.D.Cはベックマン先端科学技術研究所のポスドク・フェロー・プログラム、A.H.はNIBIB組織微小環境研修プログラム(T32EB019944)の支援を受けました。著者らは、実験室のスペース、機器、技術の管理に対するダロルド・スピルマン博士に感謝し、この研究で使用されたSLAM顕微鏡システムへの過去の貢献について、ジャネット・E・ソレルズ博士とリシャシュリング・R・アイアー博士に感謝します。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3軸ステージソーラボMAX316中止。
35mmガラス底イメージングディッシュマットテックP35G-0-14-Cコーティングされていない#0カバーガラス。
DMEMのギブコ21063029高グルコース、HEPES、フェノールレッドなし。
内皮細胞増殖培地サプリメントプロモセルC-39210型子牛胎児血清を省略します。
フェムトトレインフェムト秒レーザースペクトル物理学1040-5平均出力:>5.0 W、パルスエネルギー:>500 nJ、波長:1040 nm±8 nm、繰り返し速度:10 MHz、パルス幅(FWHM):<220 fs。
ウシ胎児血清サイトバSH30071.03HyCloneの特性評価
ファイバーストリッパーソーラボT10S13
フラビンアデニンジヌクレオチド二ナトリウム塩水和物シグマ・アルドリッチF6625
検流計ミラーケンブリッジテクノロジー6215H中止。
ガラス加工ワークステーションヴィトランGPX3800
イメージJウィスコンシン大学マディソン校のエリセイリ研究室バージョン 2.16.0フィジーの分布。
キムワイプティッシュペーパーキンバリー・クラーク・プロフェッショナル34120
L-グルタミンサイトバSH30034.01
顕微鏡ステージ応用科学機器FTP-2050型
顕微鏡ステージコントローラー応用科学機器MS-2000-500-UDSWシリーズ
顕微鏡用自己相関器Angewandte Physik und Elektronik GmbHカルペ
対物レンズオリンポスXLPLN25XWMP2水浸、倍率25倍、1.05NA。
光パワーメーターニューポート919P-003-10600 - 1700 nm。
光スペクトラムアナライザソーラボOSA202C
フォトニック結晶ファイバーNKTフォトニクスLMA-PM-15 NKTモード領域が大きく、偏光が維持されます。コア直径:15&μ;m。
精密光ファイバー包丁藤倉CT-101
パルスシェイパーバイオフォトニクスソリューションズ株式会社フェムトジョック-D中止。
&β;-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元二ナトリウム塩水和物シグマ・アルドリッチ10128023001

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