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方法論記事

zpc:cas9ノックインゼブラフィッシュを用いた母性変異体の生成

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DOI:

10.3791/68642

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2025年7月22日

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1Shandong Provincial Key Laboratory of Animal Cell and Developmental Biology, School of Life Sciences Qilu Hospital (Qingdao), Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 2Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), UMR CNRS 8263, INSERM U1345, Development, Adaptation and Ageing, Sorbonne Université, 3College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, 4Key Laboratory for Experimental Teratology of the Ministry of Education, Shandong University, 5State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, 6Shandong University-Yuanchen Joint Biomedical Technology Laboratory

この記事について

サマリー

ここでは、安定な zpc:cas9 ノックインラインとTol2を介したsgRNA発現カセットの送達を結合する母体変異体を生成するためのプロトコルについて説明します。

要約

卵子形成と初期胚発生は、母系由来のmRNAとタンパク質に大きく依存しています。これらの母性要因を排除するには、雌のゼブラフィッシュにホモ接合型変異が必要であり、しばしば致死的または不妊の表現型をもたらし、母体変異胚の獲得を防ぎます。私たちの以前の研究では、卵子特異的なゲノム編集を通じて接合子の致死性を回避するための迅速なアプローチを紹介しました。しかし、以前に報告されたcas9導入遺伝子は不安定性を示し、世代を重ねるごとに徐々に沈黙します。さらに、この系統のzpc:cas9カセットに隣接するTol2トランスポーザブルエレメントの存在は、現在ゼブラフィッシュで最も効率的なトランスジェニックシステムであるTol2システムを使用したさらなるsgRNAトランスジェネシスの可能性を妨げます。そのため、安定して堅牢な卵子特異的Cas9発現を保証するTol2フリーゼブラフィッシュ株が急務となっています。ここでは、この要件に対応する rbm24a 軌跡に zpccas9 ノックインを使用したラインを示します。この強化されたツールを使用して、ゼブラフィッシュモデル内で接合的に致死的な変異体表現型を持つ遺伝子の母体変異体を迅速に生成するためのパイプラインを提供します。

概要

脊椎動物の初期の胚発生は、卵子に蓄えられたRNAとタンパク質に大きく依存しており、総称して母性因子と呼ばれます。これらの母体産物は、主に減数分裂Iのジプロテン段階で合成されます1,2,3。それらの機能的役割を調べるためには、卵子のホモ接合変異のみがこれらの母性因子を完全に枯渇させることができるため、ホモ接合変異体雌個体を生成することが不可欠です。しかし、このようなホモ接合変異体の雌を得ることは、接合子のホモ接合変異が致死性または不妊をもたらす場合、困難になる4,5。これは、接合子の致死遺伝子または無菌遺伝子によってコードされる母体産物の機能を解明する上で大きな障壁となります。この技術的な限界を克服するために、いくつかの革新的なアプローチが開発されてきた6,7,8。それにもかかわらず、これらの技術は、多くの場合、実験のタイムラインが長引いたり、技術的な課題が生じたりします。

私たちの以前の研究では、単一の世代内で母性変異体を生成できるようにする条件付きノックアウト戦略も開発しました9,10。このシステムは、Tg(zpczcas9)トランスジェニックゼブラフィッシュと、3-4 sgRNA発現カセットを持つI-SceIトランスジェニックプラスミドシステムの2つの主要コンポーネントで構成されています。このシステムを活用して、卵子9,10の母性因子の条件付きノックアウトに成功しましたが、まだ改善の余地があります。まず、以前に報告されたTg(zpczcas9)トランスジェニック系統のゲノム編集効率は、Cas9のトランスジェニック発現を維持する上で安定していませんでした。さらに、このトランスジェニックラインはTol2トランスポゾンシステムを使用して生成されたため、Tol2トランスポジションをsgRNA発現カセットの統合にさらに使用することはできません。代わりに、I-SceIを介したトランスジェネシスが必要です。ただし、このアプローチはTol2よりも効率が悪く、世代を超えたサイレンシングの影響を受けやすくなります。

これらの制限を克服するために、私たちは堅牢で安定した卵子特異的Cas9発現を可能にするノックインラインの確立を目指しました。この系統では、Tol2トランスポゾンシステムを使用して、ゼブラフィッシュにおけるsgRNA発現プラスミドの高効率な導入が可能になります。イントロンベースのゲノム編集戦略11を利用して、rbm24a遺伝子の最後のイントロンの統合された部位とzpccas9ノックインラインを生成することに成功しました(図1A、B)。この遺伝子座を、2つの独立した観察に基づいて、母体導入遺伝子発現の候補ゲノムセーフハーバーとして選択しました。1)無害な統合:私たちの最近の研究12では、この場所で外因性DNAを持つホモ接合型のノックイン魚は、完全に生存可能で繁殖力が保たれました。2)頑健な発現:zpccas9カセットを同じ遺伝子座に挿入したところ、Cas9は高レベルで発現し、世代を超えて一貫して強力なゲノム編集効率が得られました(図1C)。核となる生殖形質成分として、RNA結合タンパク質Rbm24aはBucと提携して、生殖細胞質RNAを胚芽顆粒に組み込みます。その結果、母体のRbm24a欠損は、原始生殖細胞(PGC)の完全な欠如につながる12。ここでは、最近の研究で例としてrbm24aを標的とすることにより、接合子致死遺伝子の母体変異体を生成および特徴付けるための改善されたビデオプロトコルを提供します。

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プロトコル

実験はARRIVEガイドラインに従って実施され、山東大学の動物管理委員会によって倫理的に承認されました(承認番号。SYDWLL-2021-15)。このプロトコルの概要を 図 2 に示します。

1. rbm24a-RFP zpc:cas9 ノックインラインの生成

  1. ノックイン用sgRNAのスクリーニング
    1. ノックインsgRNA候補の選択と合成
      1. rbm24aの最終イントロンの配列をCRISPRscan(http://www.crisprscan.org)に提出し、高いCRISPRscanスコア(オンターゲット効率を示す)と低いCFDスコア(オフターゲット効果を反映)の両方を示す最適なsgRNA候補を特定します。各sgRNA(sgRNAオリゴ)の長鎖オリゴを合成します。
        注:CRISPRscanは、T7プロモーター配列、20ヌクレオチドsgRNA標的配列、16ヌクレオチドsgRNAスキャフォールド配列などの必須機能要素を含むsgRNAオリゴを生成します。ここでは、5'-taatacgactcactataGGGCTGCTGTCATGTTGGという配列のsgRNAを選択した。
        GTgttttagagctagaa-3'(T7プロモーター小文字、20-ntガイド大文字、部分的なスキャフォールド小文字)。
      2. sgRNA合成用のDNAテンプレートを取得するには、50 μLのFill-in PCR反応を調製します:2x Taq Master mix 25 μL;sgRNAプライマー(10μM)2μL;ユニバーサルプライマー(10μM)2μL;脱イオン H2O 21 μL。
        注:すべてのプライマーの配列は 、材料の表に示されています。
      3. 十分に混合し、反応混合物を事前にプログラムされたサーマルサイクラーに移し、次のサイクルパラメータを使用して増幅プロトコルを開始します:94°Cで3分間、35サイクル(94°Cで15秒間、50°Cで15秒間、72°Cで30秒間)、および72°Cで1サイクル5分間。
      4. sgRNA合成用の反応混合物を1.5 mLの微量遠心チューブで調製します。室温ですべての成分を次の順序で組み合わせます:11 μLの蒸留水、2 μLのATP/GTP/CTP/UTP(各10 mM)、10 μLのPCR産物、4 μLの10x RNAポリメラーゼ反応バッファー、2 μLのT7 RNAポリメラーゼ、および1 μLのRNase阻害剤。総反応量は40 μLです。フリックして十分に混合し、短時間の遠心分離を行います。
      5. 37°Cで1.5時間インキュベートします。DNase I1 μLを加え、フリックして混合し、短時間遠心分離します。37°Cで15分間インキュベートし、DNAテンプレートを完全に除去します。
      6. 5 μL のシリカ磁性ビーズを加え、続いて 120 μL (4x 容量) の RNA 結合バッファー (Gu-HCl 1 M 9.55 g、Tween-20 0.05%、エタノール 100 mL) を加えます。ピペッティングで十分に混合します。サーモミキサーで1,500 rpm、室温で10分間インキュベートします。
      7. チューブを磁気スタンドに置き、ピペットまたは真空システムを使用して上清を慎重に取り除きます。
      8. 400 μLの90%エタノールとボルテックスを加えてビーズを再懸濁します。チューブを磁気スタンドに置き、上清を捨てます。
      9. エタノール洗浄ステップを繰り返して、合計2回の洗浄サイクルを完了します。
      10. 残留上清を取り除き、開いたチューブを50°Cの加熱ブロックで10分間風乾します。
      11. ヌクレアーゼフリーの水15 μLを加え、サーモミキサーで1,500 rpmで室温で5分間インキュベートします。
      12. チューブを磁気スタンドに置き、溶出液を新しい微量遠心チューブに移します。
      13. アガロース電気泳動により98 bp sgRNAバンドを確認します。マイクロ分光光度計とアガロース電気泳動によりRNA濃度を定量し、明確に標識し、-20°Cで保存します。
    2. sgRNAの効率を試験
      1. sgRNAの実際の効率を判断するには、マイクロインジェクション用のリボ核タンパク質(RNP)複合体を調製します。各sgRNA 1 μL (最終濃度 50 ng/μL) と Cas9 タンパク質 1 μL (最終濃度 100 ng/μL )) をピペッティングして氷上で混合します。2 nLのRNP複合体を1細胞期の各胚にマイクロインジェクションにより導入します。
      2. 受精後24時間(hpf)で、注入したCas9 RNPごとに10個の胚を1.5 mLの微量遠心チューブに収集し、余分な培地を慎重に取り除きます。50 mM NaOH 100 μL (胚あたり 10 μL) を 100 μL 加え、加熱ブロックまたはサーモサイクラーを使用して 95 °C で 15 分間インキュベートします。10 μLの1 M Tris-HCl(pH 7.0)を加えてライセートを中和します。
      3. 中和した胚溶解物をPCR増幅のテンプレートとして直接使用します。標的部位を含むフラグメントを増幅するためのプライマーを設計し、両側に≥100 bpの隣接配列があります。アガロースゲル電気泳動でPCR産物を検証し、必要に応じてゲル抽出物を用いて精製します。増幅された製品のサンガーシーケンシングを実行します。
      4. CRISPR編集効率の定量化:ICE(Inference of CRISPR Edits)解析ツール（https://ice.synthego.com/#/)を使用して、シーケンシングクロマトグラムを解析します。注入されていないコントロールサンプルに対する編集効率を、ウェブサイトが推奨するプロトコルに従って正規化します。
  2. ノックイン用ドナープラスミドの構築
    1. 確立されたTEDA(T5エキソヌクレアーゼDNAアセンブリ)法を使用して、ライゲーション反応13を行います。
    2. rbm24a-RFP KIzpc:cas9ノックインドナープラスミドの構築に3フラグメントギブソンアセンブリ戦略を採用します。第1のフラグメントは、rbm24a終止コドンのすぐ上流にあるゲノム領域を包含する1,704bpの5'相同性アームを含む。2つ目はGFPコーディングシーケンスです。3つ目は、rbm24a終止コドンの下流に2,274 bpの3'相同性アームを含み、続いてrbm24a 3'-UTRの遠位3'方向に配置されたzpccas9発現カセットが含まれています。
    3. Gibsonアセンブリを使用して、3つのフラグメントをpBluescript SK-ベクトルのApaIサイトにアセンブルします。
    4. 制限酵素処理とサンガーシーケンシングにより、最終的なプラスミドを検証します。
  3. マイクロインジェクションと早期統合による胚の選択
    1. ヌクレアーゼフリー水に12 pgの rbm24a-RFP KIzpc:cas9 ノックインドナープラスミド、200 pgのsgRNA、および600 ngの組換えCas9タンパク質を含む注射混合物を調製します。標準的なマイクロインジェクション技術を用いて、1〜2 nLの混合物を1細胞期胚の胚盤に送達します。30 hpfで、 rbm24aの内因性発現を模倣するRFP発現パターンについて胚をスクリーニングします。これは、切断段階の早い段階でドナープラスミドの統合を示しています。これらの胚を早期に組み入れて育種し、水晶体、心臓、骨格筋、および内耳有毛細胞にRFPシグナルを示しました(図3A、B)。
      注:プラスミド調製中に導入された残留RNaseを除去するために、注入前にフェノール-クロロホルム抽出によってプラスミドを精製します。
    2. rbm24a-RFP KIzpc:cas9 incrosses (図 4A,B) に由来するF1世代胚における母体 Rbm24a-RFP の発現パターンを解析します。
  4. Cas9タンパク質の発現と編集効率の評価
    1. Cas9の編集効率を評価するには、200 pgの bmp2b sgRNAを1細胞 rbm24a-RFP KIzpc:cas9 胚にマイクロインジェクションします(図1C、D)。
    2. Cas9編集の安定性を評価するには、背部形成表現型を示す胚の数を定量化し、サンガーシーケンシング解析を実行して編集効率を評価します(図5A-D)。
      注:3世代にわたってCas9発現の減少は検出されていませんが、このノックインラインのすべての世代で編集効率を確認することをお勧めします。

2. rbm24a-RFP KI zpc cas9 系統におけるsgRNA導入

  1. rbm24aノックアウト用のsgRNAを選択し、合成します。
    1. ステップ1.1.1で説明したように、sgRNA候補を選択し、合成します。
      注:非常に効率的な機能喪失を確実にするためには、コーディング領域の前半分を標的とするsgRNAを選択することが重要です。さらに、C末端領域に重要なタンパク質ドメインが同定された場合、コード配列の3'末端を標的とするsgRNAも許容されます。CRISPRscanは、T7プロモーター配列、20ヌクレオチドsgRNA標的配列、16ヌクレオチドsgRNAスキャフォールド配列などの必須機能要素を含むsgRNAオリゴを生成します。効果的な母体遺伝子ノックアウトを達成するためには、6-8の候補を設計し、3-4の高効率sgRNAを確実に同定することが望ましいです。詳細なプロトコルは、以前の論文9に記載されています。
    2. ステップ1.1.2で説明したように、初期ゼブラフィッシュ胚のsgRNA効率をテストします。
      注:編集効率が50%を超えるsgRNAが好ましい。
  2. sgRNA発現トランスジェニックプラスミドの構築
    注:編集効率を最大化するために、それぞれが少なくとも36 bp離れている4つの異なる重複しないsgRNAを使用することをお勧めします。これらのsgRNAは、pU6x:sgRNAベクター(pU6x:sgRNA #1、#2、#3、#4)に個別にライゲーションされ、それぞれが3'スキャフォールドとともに固有のU6プロモーターを保有しています14.その後、それぞれsgRNA発現カセットを含むこれら4つのU6ベクターを、ゴールデンゲートライゲーションを介してpGGDestISceIEB-4sgRNA宛先ベクターにアセンブルします。
    pU6x:sgRNAベクターは順次選択する必要があります。例えば、3つのsgRNAをクローニングする場合は、#1から#3のベクターを使用します。4つのsgRNAをクローニングする場合は、ベクター#1から#4を使用します。
    1. sgRNA標的配列をpU6x:sgRNAベクターにサブクローニング
      1. 選択したsgRNAの配列に従って、アニーリングプライマーを合成します:フォワードプライマー:TTCGN(19);リバースプライマー:AAAC[N(19)]*。ここで、GN(19)はsgRNAの20 ntの標的配列です。[N(19)]*は、sgRNAターゲットの19 ntの3'方向の逆補体配列を表します。
      2. プライマーをアニールするには、1 μLのフォワードプライマー(100 μM)、1 μLのリバースプライマー(100 μM)、2 μLの10xバッファー、および16 μLの脱イオンH2Oを調製して、総容量20 μLになるように調製します。
        注:すべてのプライマーの配列は 、材料の表に示されています。
      3. 混合物をサーモサイクラーに入れ、次のようにプログラムを実行します:95°Cで1サイクル15分間、次に0.1°C / sの制御されたランプ速度で50°Cまで徐々に冷却し、この温度を10分間維持します。4°Cで10分間保持します。
      4. アニーリングしたsgRNA標的配列をpU6x-sgRNAベクターにクローニングするための反応混合物を調製します:1 μLの10x制限酵素バッファー、1 μLの10x T4リガーゼバッファー、0.3 μLのT4リガーゼ、0.3 μLの BsmBI、0.2 μLの PstI、0.2 μLの SalI、1 μLのアニーリングされたsgRNAプライマー、 5 μL の pU6x:sgRNA#x (20 ng/μL) と 1 μL の脱イオン H2O を、最終反応量を 10 μL に調整します。
      5. 反応成分を十分に混合し、次のサーモサイクラープログラムを実行します:6サイクル(37°Cで20分間、16°Cで15分間)、37°Cで1サイクルで10分間、55°Cで1サイクルで15分間、80°Cで1サイクル15分間。
      6. 形質転換には、DH5αコンピテントセルを氷上で解凍し、チューブをフリックして50μLの細胞をライゲーション混合物と穏やかに混合し、混合物を氷上で30分間インキュベートします。42°Cで60秒間ヒートショックを行い、すぐにチューブを氷に2分間戻します。形質転換した細胞を100 μg/mLのスペクチノマイシンを含むLBプレートに広げ、プレートを逆さまにして37°Cで少なくとも16時間インキュベートしてコロニー形成を行います。
      7. コロニーPCRでは、ピペットチップで各細菌コロニーをピペットチップで選択し、脱イオンしたH2Oの10 μLに移します。ピペッティングで上下にコロニーを完全に再懸濁し、ダウンストリームPCR分析のために完全に分散するようにします。5 μL の 2x Taq Mix と 2 μL のコロニー液、M13 フォワードプライマー (10 μM) とリバースプライマー (10 μM) を各 0.4 μL ずつ、脱イオン H2O 2.2 μL を組み合わせ、PCR 反応混合物を調製すると、総反応量は 10 μL になります。
      8. 以下に示すように、プログラムを94°Cで1サイクル3分間、23サイクル(94°Cで15秒間、55°Cで15秒間、72°Cで30秒間)、72°Cで1サイクル5分間実行します。
      9. PCR産物を電気泳動にかけます。予想サイズが 482 bp の陽性コロニーを選択します(図 6)。
      10. 残りのコロニー液を、100 μg/mL スペクチノマイシンを添加した LB 培地 3 mL に接種します。37°Cでインキュベートし、200rpmで14時間振とうします。
      11. メーカーの指示に従って、プラスミドMiniprep Kitを使用して細菌培養物からプラスミドを抽出します。マイクロ分光光度計を使用してプラスミド濃度を測定します。
      12. 抽出したプラスミドを、M13フォワードプライマーを使用してサンガーシーケンシングにかけます。シーケンシング結果を予想されるU6ベクターマップに合わせ、sgRNAターゲットの正しい挿入を確認します。
    2. pGGDestEB-4sgRNAベクターの組み立て
      注: 図7に示すように、ゴールデンゲートアセンブリを使用して、4つのU6駆動sgRNA発現カセットをpGGDestEB-4sgRNAバックボーンベクターに効率的にライゲーションできます。ライゲーションするsgRNAの数によって、ベクターの使用が決まります。例えば、4つのsgRNAカセットを組み立てる場合は、pU6a:sgRNA#1、pU6a:sgRNA#2、pU6b:sgRNA#3、pU6c:sgRNA#4、pGGDestEB-4sgRNAを使用します。
      1. 2 μL の 10× 制限酵素バッファー、2 μL の 10x T4 DNA リガーゼバッファー、各 pU6x:sgRNA#x コンストラクト 100 ng、50 ng の pGGDestIEB-4sgRNA 宛先ベクター、1 μL の BsaI、1 μL の T4 DNA リガーゼ、および脱イオン水を含む 20 μL の Golden Gate 反応混合物を調製して、最終容量を 20 μL に調整します。
      2. ゴールデンゲートアセンブリ反応を37°Cで20分間、続いて16°Cで15分間の3サイクルで行い、最後に80°Cで15分間インキュベーションして酵素を不活性化します。
      3. 形質転換するには、反応混合物5 μLをコンピテントセルに移し、アンピシリンを添加したLB培地にプレート化します。
      4. Dest フォワードプライマーおよびリバースプライマー( 材料表を参照)を使用してコロニーをスクリーニングし、インサートの存在を確認します(図 8)。
        注:ポジティブクローンには、2,415 bpのメインバンドとラダーパターンが存在する必要があります。
      5. 陽性コロニーからプラスミドを抽出し、各sgRNAターゲットのDest ForwardおよびReverseプライマーを使用して配列します。
      6. Sangerシーケンシング結果を予測されたベクター配列にアライメントして検証します。
  3. トランスジェニック創業者のマイクロインジェクションと事前スクリーニング
    1. ホモ接合体 rbm24a-RFP KIzpc:cas9 魚によって産まれた胚を収集します。
    2. 1 μL の pGGDestEB-rbm24a-4sgRNA (12 ng/μL) と 1 μL の Tol2 トランスポゼース mRNA (50 ng/μL) を組み合わせて、注入混合物を調製します。
      注:注入前にフェノール-クロロホルム抽出を使用してプラスミドを精製し、プラスミド抽出プロセス中に導入された可能性のある残留RNaseを除去します。プラスミドとTol2 mRNAは、純水で直接希釈しました。
    3. ガラスカバースリップを15cmの皿に入れます。胚をカバーガラスの端に沿って位置合わせし、ピペットを使用して余分な水分を慎重に取り除きます。2 nLの混合物を各1細胞期胚の胚盤胞ディスクに注入します。注入後、胚を青い水でやさしくすすぎ、新鮮な皿に移します。最後に、ディッシュを28°Cのインキュベーターに入れて培養します。
      注:次のようにメチレンブルーワーキングソリューション(ブルーウォーター)を準備します:180 gの海塩を2.7 Lの蒸留水に溶解し、滅菌して100倍の海水ストックを作ります。このストックを滅菌蒸留水で200倍に希釈すると、1/100倍の海水が得られます。この1/100x海水1Lに5%(m/v)メチレンブルーストック溶液10μLを加えて、最終作業溶液を調製します。
    4. 24 hpfで、堅牢で遍在するBFP発現を示す胚を選択します。4 dpf では、強力なトランスジェニック蛍光シグナルを維持しているものだけを上げます(図 9)。

3. ダブルトランスジェニック胚の特性評価

  1. 表現型解析による二重トランスジェニック胚
    1. 野生型のオスと交配するモザイクトランスジェニックファウンダーのメスから胚を採取します。
    2. 蛍光顕微鏡下で1細胞段階でBFP陽性(BFP+)胚をピックアップします。
    3. BFP+ 胚には現れるが、BFP- 胚には現れない発生障害を特定します。
    4. 胚を4%パラホルムアルデヒド(PFA)に4°Cで一晩固定します。必要に応じて、ホールマウント in situ ハイブリダイゼーション、免疫蛍光染色、またはその他の組織学的解析を行います。
      注:GFP陽性またはBFP陽性のsgRNA発現胚にのみ発生する欠陥のある表現型のみが信頼性があります。結論は慎重に導き出されるべきであり、母体の突然変異体の表現型は10例以上によって立証されなければならない。
  2. 母体変異胚のジェノタイピング
    注:Mの識別用rbm24a 胚は、蛍光顕微鏡下でRbm24a-RFPが存在しないことにより、容易に拾い上げることができます。対照的に、他の遺伝子の母体変異体の同定は、主に接合体ゲノム活性化前の細胞吸引戦略に依存し、その後、収集された細胞内の母体mRNAのRT-PCR分析に依存します(図 10).
    1. 細胞吸引
      1. 1.5%アガロース溶液を1/3xリンガー緩衝液に溶解し、溶けるまで煮沸して調製します。溶液を90mmのペトリ皿に注ぎ、溶融したアガロースに型(WPI、z型)を挿入します。固まったら、金型をゆっくりと取り出して、すぐに使用できるプレートにします。
      2. ガラスキャピラリーとプーラーを利用して、メルトシールされた針を作成します。最適な細胞吸引針を得るには、2つの軽量と加熱電力をLv1:60とLv2:90に設定し、Step2の手順を選択します。先のとがったピンセット( 材料の表を参照)で毛細管の先端をトリミングして、開口径を30〜40μmにします。その後、マイクロフォージを使用して針の先端にスパイクを作成し、浸透を助け、胚への損傷を最小限に抑えます。
      3. 推定される女性の創設者を野生型のゼブラフィッシュと交配させ、胚を収集します。BFP陽性胚を1細胞期に単離します。
      4. 3 hpfで、1 mg/mL Pronaseで1/3x Ringer's bufferに10分間インキュベートし、穏やかにピペッティングして胚をデコレーションし、1x ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した1/3x Ringer's bufferを浸したアガロースプレートに胚を慎重に置きます。割球が毛細血管の先端に向けられるように、胚の向きを変えます。
        注:胚は絨毛膜の保護なしでは非常に壊れやすいため、胚を慎重に移植することが重要です。媒体の表面に触れさせないでください。
      5. マイクロインジェクターを使用して、毛細管現象15からの吸引力を補償する平衡圧力を慎重に低下させることにより、各胚から20〜40個の細胞を吸引する。平衡圧を上昇させることにより、これらの細胞をPCRチューブの開口端で2μLの脱イオンH2Oに放出します。
        注:クロスコンタミネーションを避けるために、ガラス針は、各吸引の前に脱イオン化されたH2O 3xを吸引および排出して洗浄する必要があります。
      6. 200 μLのRNA抽出試薬を加えて細胞を洗い流し、チューブを氷上に一時的に保存します。続いて、発生障害の有無にかかわらず、胚由来の細胞の遺伝子型を解析します。
        注:抽出試薬に保存された細胞は、対応する胚が異常な表現型を示すまで-20°Cで保存できます。
      7. 細胞吸引後の胚をアガロースプレートに残すか、1xペニシリン-ストレプトマイシンを含む1/3xリンゲル液を浸した24ウェルプレートに個々に置きます。
        注:脱角化胚の移植には注意が必要です。通常、1回の実験で20〜40個の胚を調べますが、これには約1時間かかります。
    2. 吸引細胞における目的の母体mRNAの解析
      1. 抽出試薬中の細胞に40μLのクロロホルムを加え、穏やかに混合します。混合物を12,000 × g で4°Cで1分間遠心分離します。
      2. 上清を慎重に集めます。グリコーゲン溶液1μL(20 mg/mL)と等量のイソプロパノール(上清の容量が100 μLの場合、イソプロパノール100 μLを添加)を加えてよく混ぜ合わせます。混合物を-20°Cで30分間インキュベートして、沈殿を促進します。
        注:吸引細胞中の全RNAの量が少ないため、沈殿効率を高め、沈殿物の可視化を容易にするためにグリコーゲンを添加する必要があります。
      3. サンプルを12,000 × g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を捨てます。
      4. 500mLの70%エタノールを加え、12,000 × g で1分間遠心分離して、ペレットを2回洗浄します。
      5. 液体を捨てて蓋を開け、ペレットを室温で5分間乾燥させます。
      6. 7 μLの水を加えてペレットを溶解します。ファーストストランドcDNA合成キットを使用して、取扱説明書に記載されている詳細なプロトコールに従って逆転写を行います。
      7. 適切なプライマー( 材料表を参照)でコーディング領域全体を増幅し、アガロース電気泳動を実行します。
      8. PCR産物をクローニングし、各胚に対して少なくとも30個のクローンを配列決定して、mRNAに出現した突然変異を分析します。
        注:欠陥のある表現型の存在が関心のある母体因子の標的変異によって引き起こされることを確認するために、表現型に欠陥のあるすべての胚(n>5)は、野生型の母体転写産物の欠如を示す必要があります。逆に、野生型の母体mRNAは、正常に発生しているすべてのsgRNA発現胚に存在するべきである(n > 5)。同時に、sgRNA陰性胚では、野生型のmRNAのみが検出可能です(n > 5)。

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結果

rbm24a母系変異体の急速生成
母体のBFPマーカーと、rbm24aコード配列を標的とする4つの高効率sgRNAの発現を可能にするトランスジェニックベクターを構築しました。このベクターをTol2転位を介してホモ接合型rbm24a-RFP KIzpc:cas9胚に導入した後、Rbm24a-RFPタンパク質が存在しないため、BFP陽性F1胚間でMrbm24aが容易かつ迅速に同定されました(Figure 11A-D)。BFP陽性胚の約30%〜70%はRFPシグナルを欠いていました。これらのMrbm24a胚は、nanos3プローブを用いたin situハイブリダイゼーションで示されるように、胚芽顆粒への生殖形質mRNAの...

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ディスカッション

致死的な接合変異は、遺伝子の母性寄与の解析を妨げます。代替戦略、特に生殖細胞置換と卵母細胞マイクロインジェクション In Situ (OMIS) は、技術的に要求されています 6,8。生殖細胞系置換の細胞移植プロセスでは、レシピエント胚はPGCをほとんど受け取らず、しばしば正常な女性の発育を妨げる16,17,18。生殖細胞系置換に誘導PGC(iPGC)を使用すると、最小限の改善しか得られません:iPGCから分化した生殖細胞の数は有意に少なく、これによりiPGC移植キメラのすべての男性性比が得られました19。これらの制限により、生殖細胞置換戦略は、ゼブラフィッシュの母性効果遺伝子の機能を研究するための日常的なツールになること...

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開示事項

このプロトコルは、中国国家知識産権局によって特許として付与されており、著者の許可を得た後、方法の制限された使用が緩和されます。著者は、他に競合する利害関係や金銭的な利害関係がないことを宣言します。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2x M5 HiPer Taq PCRミックスメイ5バイオカタログ#MF001-BD-100
アガロースMDバイオカタログ#A006L
AxyPrep プラスミドミニプレップキットアクシーゲンカタログ#AP-MN-P-4
キャピラリー電気泳動装置(Qsep400)バイオオプティック該当なし
DIGラベリングミックスロシュカタログ#11277073910
DNase Iロシュカテゴリ#4716728001
DTTのサーモフィッシャーサイエンティフィックカタログ#R0861
ファーストストランドcDNA合成キットトランスジェンバイオテックカタログ#AT301
GenCrispr NLS-Cas9-NLSヌクレアーゼジェンスクリプトカタログ#Z03389
ガラスキャピラリー(1.0 x 100 mm)ランタイ教育機器工場カタログ#OS-2B
グリコーゲンBBIライフサイエンスカタログ #28985
GraphPad プリズム 9グラフパッドhttps://www.graphpad.com/
イメージJオープンソースhttps://imagej.net/software/fiji/
低融点アガロースバイオ テクノロジーカタログ#CA1351
マイクロフォージ(MF2)成重該当なし
マイクロ分光光度計(Nano-300)オールシェン該当なし
オリビアオリンポス該当なし
ペニシリン-ストレプトマイシンギブコカタログ#15140122
ピコリットルインジェクター(PLI-100A) ハーバード大学装置該当なし
先のとがったピンセットWPIのカタログ#500341
先のとがったピンセット WPI 500341
プーラー(PC-100)成重該当なし
リボロックRNase阻害剤サーモフィッシャーサイエンティフィックカタログ#EO0381
rNTPサーモフィッシャーサイエンティフィックカタログ#R0481
シリコンヒドロキシル磁気ビーズサンゴンバイオテックカタログ#B518720-0001
T7 RNAポリメラーゼNEBカタログ#M0251L
ゾルドWPIのCat# Z モールド

参考文献

  1. Fuentes, R., et al. The maternal coordinate system: Molecular-genetics of embryonic axis formation and patterning in the zebrafish. Curr Top Dev Biol. 140, 341-389 (2020).
  2. Yan, L., et al. Maternal Huluwa dictates the embryonic body axis through β-catenin in vertebrates. Science. 362 (6417), eaat1045(2018).
  3. Abrams, E. W., et al. Molecular genetics of maternally-controlled cell divisions. PLoS Genet. 16 (4), e1008652(2020).
  4. Shao, M., et al. Rbm24 controls poly(A) tail length and translation efficiency of crystallin mRNAs in the lens via cytoplasmic polyadenylation. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (13), 7245-7254 (2020).
  5. Weidinger, G., et al. dead end, a novel vertebrate germ plasm component, is required for zebrafish primordial germ cell migration and survival. Curr Biol. 13 (16), 1429-1434 (2003).
  6. Ciruna, B., et al. Production of maternal-zygotic mutant zebrafish by germ-line replacement. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (23), 14919-14924 (2002).
  7. Xing, Y. Y., et al. Mutational analysis of dishevelled genes in zebrafish reveals distinct functions in embryonic patterning and gastrulation cell movements. PLoS Genet. 14 (8), e1007551(2018).
  8. Wu, X., Shen, W., Zhang, B., Meng, A. The genetic program of oocytes can be modified in vivo in the zebrafish ovary. J Mol Cell Biol. 10 (6), 479-493 (2018).
  9. Zhang, C., et al. Generation of zebrafish maternal mutants via oocyte-specific knockout system. Bio Protoc. 14 (21), e5092(2024).
  10. Zhang, C., et al. Rapid generation of maternal mutants via oocyte transgenic expression of CRISPR-Cas9 and sgRNAs in zebrafish. Sci Adv. 7 (32), abg4243(2021).
  11. Li, J., et al. Intron targeting-mediated and endogenous gene integrity-maintaining knockin in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Cell Res. 25 (5), 634-637 (2015).
  12. Zhang, Y., et al. Rbm24a dictates mRNA recruitment for germ granule assembly in zebrafish. EMBO J. 44 (11), 3121-3149 (2025).
  13. Xia, Y., et al. T5 exonuclease-dependent assembly offers a low-cost method for efficient cloning and site-directed mutagenesis. Nucleic Acids Res. 47 (3), e15(2019).
  14. Yin, L., et al. Multiplex conditional mutagenesis using transgenic expression of Cas9 and sgRNAs. Genetics. 200 (2), 431-441 (2015).
  15. Shao, M., Cheng, X. N., Liu, Y. Y., Li, J. T., Shi, D. L. Transplantation of zebrafish cells by conventional pneumatic microinjector. Zebrafish. 15 (1), 73-76 (2018).
  16. Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. Germ line control of female sex determination in zebrafish. Dev Biol. 324 (2), 277-287 (2008).
  17. Aharon, D., Marlow, F. L. Sexual determination in zebrafish. Cell Mol Life Sci. 79 (1), 8(2021).
  18. Ye, D., et al. Abundance of early embryonic primordial germ cells promotes zebrafish female differentiation as revealed by lifetime labeling of germline. Mar Biotechnol (NY). 21 (2), 217-228 (2019).
  19. Wang, X., et al. Induced formation of primordial germ cells from zebrafish blastomeres by germplasm factors. Nat Commun. 14 (1), 7918(2023).
  20. Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
  21. Bertho, S., et al. Zebrafish dazl regulates cystogenesis and germline stem cell specification during the primordial germ cell to germline stem cell transition. Development. 148 (7), dev.187773(2021).
  22. Houwing, S., et al. A role for Piwi and piRNAs in germ cell maintenance and transposon silencing in Zebrafish. Cell. 129 (1), 69-82 (2007).
  23. Shao, M., et al. Vegetally localised Vrtn functions as a novel repressor to modulate bmp2b transcription during dorsoventral patterning in zebrafish. Development. 144 (18), 3361-3374 (2017).

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