方法論記事

新生児持続的陽圧呼吸法および気道収縮率測定のための精密肺スライス法のマウスモデル

DOI：

10.3791/68643

⸱

2026年3月13日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, UH Rainbow Babies & Children's Hospital, 2Department of Pediatrics, Case Western Reserve University School of Medicin, 3Department of Anesthesiology & Perioperative Medicine, Mayo Clinic, 4Department of Physiology and Biomedical Engineering, Mayo Clinic

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

麻酔なしの新生児マウスに対して、異なるレベルのCPAPを非侵襲的に投与する方法を示しました。この技術は、多くの早産児に対するCPAP投与を部分的に模倣し、肺の発達への影響を評価することを目的としています。また、精密肺切片法を用いてCPAPが気道収縮力に与える効果も示しています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

早産児の集中ケアで使用される陽圧呼吸支援に関連する機械的な力は、肺の発達に正の影響も悪影響も及ぼす可能性があります。陽圧支持は肺ガス交換を改善し、無気張を抑え、全身の酸素供給を改善しますが、人工呼吸などの侵襲的手法が肺の発達に及ぼす有害な影響もよく知られています。しかし、より低侵襲的な換気方法の悪影響については大きな理解の空白があります。ここで、持続的陽圧呼吸法(CPAP)は最も一般的な呼吸支援法の一つであり、陽圧スペクトルの中で最も侵襲性の低い方法を表します。人間の気道発達を研究する上で大きな制約は、年齢に適したモデルの不足と、小型新生児にCPAPを投与できないことです。この問題は、覚醒した麻酔なしの新生児マウスに毎日投与される新生児CPAPのマウスモデルを開発し、臨床的に関連性の高いCPAPレベルを早期乳児がICUでCPAPを受ける可能性が高い段階で利用することで解決しました。ここでは、麻酔されていない新生児に非侵襲的にCPAPを届け、レベルを調整できる便利なカスタム設計システムを備えた当社のCPAPモデルを実演します。また、気道過敏性の 体外反応性測定のための精密切断肺切片法の実証も行います。PCLSは、肺系の機能的読み取りを便利に提供するためここで説明されます。これは小型(新生児)動物モデルでは技術的に難しいことがあり、またCPAPとは無関係の他のモデルにも広く適用可能です。CPAPが気道過敏性を引き起こすことを示すデータを示し、これは早産児の集中治療における呼吸支援療法の選択に重要な臨床的示唆をもたらす可能性があります。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

多くの早産児にとって、無呼吸や呼吸困難などの呼吸器関連の問題は命を救う呼吸補助を必要としますが、残念ながらこれが乳児の罹患率や長期入院に寄与しています。補助的な酸素補助および陽圧呼吸支援、機械換気(MV)やより低侵襲なCPAPは一般的な呼吸補助療法です。しかし、早産期の重要な期間を生き残った人々にとっての主な短期的および長期的な問題は、慢性気管支疾患1,2,3,4であり、生涯にわたる喘鳴・喘息、肺機能の低下、運動能力の低下として現れます。補給酸素および心肺の有害な影響は、数十年にわたり気管支支性異常(BPD)および長期呼吸器疾患の病因に広く関与しているとされていますが、一部の証拠ではCPAPのような非侵襲的な呼吸支援も発生中の肺に意図しない影響を与える可能性が示唆されています。11、12。しかし、CPAPの副作用についてはほとんど知られていません。これは主に新生児動物への非侵襲的投与に伴う技術的課題のためです。

小児喘息の全体的な増加率13と、NICU滞在後の早産児の生存率向上を踏まえ、未熟気管支気道の構造的・機能的変化を引き起こすメカニズムと、それらが補助的な酸素投与とは独立して生涯にわたる肺疾患にどのように寄与するかを理解すること重要な未充足の臨床および研究ニーズです。新生児用CPAPは気道機能に長期的な悪影響を及ぼし、喘鳴障害に寄与する可能性が示唆されており、これはCPAPが補助酸素中毒を防ぐための呼吸補助法として推奨されていることから重要です。CPAPを小型かつ年齢に適した新生児動物に投与する技術的な課題は、CPAPが肺の発達に与える効果(有益または有害か)の理解を妨げてきました。この問題を解決するために、CPAP10、11、12、14、15を出生から毎日(CPAPのレベルを異なるレベルで1日3時間投与)して、出生から起きた非麻酔マウスに投与した最初の新生児マウスモデルを開発しました。これにより、CPAP16を投与される可能性が高い非常に早産(~24〜28週)の胎児に相当する肺の発達段階における臨床的に関連性の高いCPAPレベルの研究が可能となりました。17歳。新生児マウスモデルでMRIスキャンを実施し、CPAPが肺の膨張を引き起こすことを確認しました。また、CPAPが出生後最初の1週間にCPAPを使用すると、長期的に(生後3週間)気道反応性が増加することが確認されました。これは幼児(3〜4歳)の喘鳴と一致します。ここでは、新生マウス向けにカスタム設計されたCPAPシステムの詳細なデモンストレーションと、体外精密肺切開法(PCLS)を用いた気道収縮性の便利な評価方法について説明します。

PCLSは気道過敏反応性メカニズムとその経路を調査する優れた便利な機会を提供します。PCLS法を用いることで、特定の受容体/チャネル阻害剤で前処理した後、メサコリンなどの気管支収縮因子に対する気道狭窄をリアルタイムで画像化します。これらの研究は、CPAPの早期段階における病態生理学的影響を理解し、必要な臨床ケアの最適化を可能にしつつ、生涯にわたる影響を軽減できるターゲットを絞り、実行可能な介入を提供する上で重要です。

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プロトコル

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妊娠期間中のマウスを対象に実験を行い、出生日を特定するために毎日モニタリングされます。マウスは出生後最初の1週間、 21%酸素でCPAPの有無にかかわらず治療します。通常、肺はCPAPから2週間後に精密肺断片法(PCLS)を用いたAW反応性測定の準備として摘出されますが、このような測定はP8日(CPAP直後)や成人期に至るまで可能です。すべての処置は国立衛生研究所(NIH)の実験動物のケアと使用に関するガイドラインに従って実施され、ケース・ウェスタン・リザーブ大学の動物ケア・利用委員会によって承認されました。

1. CPAPマスクの組み立て

  1. 5mLの注射器の切断端から個別のマスクを作成し、ルアーロック部分を含んでチューブを接続し、マウスの気道に空気の流れと正圧を届けます(図1A)。
  2. マスクの注射器部分をあらかじめ穴開けて、エルボーに接続されたねじルアーロック、ホースへのルーアとバーブフィッティング、標準的な水槽チューブ(直径3/8インチ)を収容できるようにしてください。
  3. サイドポートのチューブを使って、下流の調整可能な漏れを通る流気を通し、マウスの肺への逆圧を設定し、カスタムメイドのマノメーターでCPAPのレベルをリアルタイムで監視します。

2. 襟のデザイン

  1. カラーは、小型の標準的な実験用手袋の指先部分をカットして作ります。マウスをマスクユニットに接続するために使ってください。
  2. 穴を開けた1/4インチの穴を開けて、切った指先の先端に穴を開け、顔と頭を収める均一で均一な大きさの開口部を作ります。
    注意:穴穴はマスクのサイズを一定に保つためですが、P4付近ではマウスの成長に対応するために大きな穴あけが必要です。

3. マノメーターの建設

  1. 2つの使い捨て血清学ピペットを曲がった水槽チューブで接続してマノメーターを構築します(図1A)。CPAPのレベルを視覚化しやすくするために、マノメーターに色付きの染料の滴を含む水が半分入っていることを確認してください。
  2. マノメーターを流量コントローラー(流量~600-700 mL/min)とマスクと直列に接続します。

4. マウスに首輪とマスクを装着すること

  1. ネズミ(生後1日)に首輪をつけるには、まずマスクの開いた端に位置させます。慎重に動かしながら、マウスの顔と頭を収めるように伸ばす必要があります。
  2. ネズミの顔を首輪の開口部から挿入します。首輪は顔や頭の上に伸ばされた状態から優しく緩めています。生後~4日の時点で、首輪の開口部に小さな切れ目を開けて成長と大きな頭を収めますが、より大きなサイズの全てのパンチも推奨されます。

5. 複数のマウスに同時にCPAPを投与する

  1. 一連のフローコントローラーとマノメーターを用いて、複数(最大10匹)の新生マウスにCPAPを届けられるシステムを作りましょう(図1B)。標準的なレギュレーターを備えた通常のエアタンクによる上流の空気流れを供給し、それをフローコントローラーを通してすべてのCPAP機器やマスク/カラーユニットに全体の流れを伝えます。
  2. 空気を水の貯蔵庫に泡立てて加湿させ、直接CPAPユニットに送り、各動物に独立してCPAPを投与します。
    注意:コントロールマウスはマスクを受け取り、同じ気流ですがバックプレッシャーやCPAPは使いません。
  3. すべての実験は、体温を安定させるために~38 °Cの再循環水を用いたヒートパッド上で行ってください。

6. 年表

  1. 妊娠中のマウスは毎日観察して出生日を特定し、翌日(生後P1日目)に2時間にわたり初回CPAPセッションを行い(図2)、子マウスが乳母から離れている時間を最小限に抑えます。
  2. その後の日(P2〜P7)は、各CPAPセッションを3時間かけて実施します。必要に応じて7日以上、または任意のCPAPレベルで使用してください。ただし、6 cmH2Oの7日間のCPAPが日常的に使用されます。
  3. 次に、CPAP終了直後(P8)直後(P7)または長期的な影響(例:P21や成人期)に、精密肺切除準備(セクション8)を用いて、CPAPが気道反応性に与える影響を評価する。

7. 組織収穫と気道収縮

  1. 分子または生理学的技術(例:ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、ウェスタンブロット、免疫組織化学、RNASeq、プロテオミクス、代謝体学など)のために肺を採取します。
    注:主な焦点はCPAPが気道収縮力に与える影響であり、呼吸器系の力学者としてin vivo (麻酔・機械的換気、P21日以上)またはPCLSを用いた 体外 検査(P8日以上)で評価できます。後者は、 生体内 での研究に適さない特定の経路を標的とする化合物や薬剤の調査に大きな利点があります。

8. 精密肺スライス(PCLS)法のための全肺摘出・準備

  1. 麻酔薬過剰投与(ケタミン/キシラジン混合体の腹膜内注射;それぞれ100 mg/kg/10 mg/kg)でマウスを安楽死させ、肺を浴槽投与中のメサコリンに対する気道反応性の 体外 測定に備えます。
  2. アガロース入りの注射器で気管をカニュレーションするためにマウスを仰向けに置きます。カニューレを小さな腹側の首の切開から挿入し、3~mm進めてから縫合で固定します。
  3. 液化アガロース(40°C)を優しく注入して肺を膨らませ(P8マウスは0.4mL、P21マウスは0.8mL)、マウスを冷蔵庫で30分間冷やし、アガロースを冷やしてゲル化させます。

9. PCLS法のための肺切開

  1. アガロースが冷却されたら、2%アガロースに選んだ肺葉を埋め込み、バイブラトームに置き、300μmの断片にスライスし、DMEM+ペン/溶連菌溶液に浸して一晩培養します(5% CO2、37°C)。
  2. 翌日、肺のスライスをHBSSで洗浄し、記録チャンバーに取り付けてメサコリン挑戦に対する気道反応のライブ画像撮影を行います。
    注:提示された結果はナイーブ(対照群、すなわちCPAPなし)およびCPAP治療のみであり、作動薬や抗体・阻害薬は使用していません。
    1. 気道画像診断を行ってください。
      1. 肺のスライスを特注の灌流チャンバーに置き、薄くて軽量なメッシュシートとカバースリップで覆い、シリコングリースで固定します。
      2. その後、スライスを含む記録室を顕微鏡に取り付け、室温でパーフュージョンポンプを使ってHBSSを連続的に灌流(7 mL/min)します。
      3. 顕微鏡をカメラで取り付けて個々の気道を特定してください。最初の3分間のベースライン記録の後、チャンバーに増強濃度のメタコリン(各濃度2分)を灌流し、気道腔の面積の変化を継続的に記録します。
    2. 気道の大きさを定量化してください。
      1. 特定のメタコリン濃度(および基準線)に対する気道の画像(ImageJソフトウェア)を特定し、 調整閾 値を選択して腔面積を定量化し、腔面積が完全に捉えられるようにします(図3A)。
      2. その後、同じ気道の異なる濃度(すなわち、同じ気道で閾値が使われる)の後続画像にこれらの設定を適用します。
      3. 次に、 ワンドトレース ツール(図3B)で測定用のルーメン領域を選択し、 Ctrl + M (図3C)を押して、ピクセル単位でルーメン面積を自動的に定量化します。これを各メタコリン濃度ごとに繰り返します。データは数値的に利用可能で、気道反応性は基準腔サイズの割合で表されます(図3)。
    3. サンプルサイズ
      1. 気道をランダムに選び、1つのAW/肺切片でメタコリン反応を行いますが、通常は1匹の動物に複数の切片を評価できます。したがって、治療グループは複数の気道や複数の子犬からなることがあります。
      2. 気道は大(>0.05 mm2)と小(<0.05 mm2)に分類されます。これは、CPAPが異なる大きさの気道に影響を与えることが既に判明しているためです。

10. 薬物の送達

  1. 切除・切片後48時間、siRNAに曝露または培養された切片を用いて特定の経路を標的とします。
    注:さまざまな受容体に特異的な作動薬およびアンタゴニストは、急性に肺切片に適用することも容易であり、これらの化合物がin vivo 投与に適切または安全でない場合に有利です。
  2. あるいは、肺を標準化された膨張圧力(25 cmH2O)で固定(ホルマリン)し、保存して免疫組織化学や染色の準備を行い、後の共焦点顕微鏡による分析に備えることもあります。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

新生児CPAP中の肺容積のMRI解析
MRI解析を用いて、生後3日で麻酔なし、自然呼吸を行うマウス(n=4匹)の肺容積の変化を可視化しました。肺容積は膨張圧(すなわちCPAP)が増加すると最大9 cmH2Oまで増加しました(図4A)。また、生後3日目のマウスの代表画像も示しています。生後0および6 cmH2O CPAPの代表的な画像も示されています(図4B,C)。この分析の目的は、CPAPが腹部ではなく肺を膨らませることを確認することでした。

新生児用CPAPの用量依存的かつ性別特異的で気道反応性への影響
新生児用CPAPは、オス(図5A)とメス(

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CPAPは、呼吸困難を抱える早産児に必要な呼吸補助手段です。CPAPは自然呼吸に重ねて使用され、肺容積を高く保ち、肺泡の虚脱や無気張を防ぐことで全身の酸素供給を改善します。したがって、CPAPには大きな救命効果があり、歯槽の発達を改善することが示されていますが、その効果はCPAPの重症度や持続時間によって異なります。しかし近年、CPAPが気道発達に悪影響を及ぼす可能性を示す新たな証拠が出ており、特に喘鳴や気道過敏性などの長期的な呼吸器障害を引き起こす可能性が示唆されています。9,10,11,12,14,15

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者たちは何も明かすことはありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

研究資金は国立衛生研究所R01 HL177837およびR01 HL056470からの助成金によって賄われました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
5 mL シリンジフィッシャー・サイエンティフィック149556458
1mLシリンジフィッシャー・サイエンティフィック309659カニューレからアガロースを注射する
1/4インチホールパンチマクマスター・カー3427A57
22 x 22 x 20 埋め込み型フィッシャー・サイエンティフィック22-19
23G針フィッシャー・サイエンティフィック305193カニューレを注射器に取り付けるには、P21やnbsp以外の年齢には他のサイズが必要となります。
2 mL 血清学ピペットフィッシャー・サイエンティフィック13-678-12cモアノメーターを作るために
調節可能な漏れ弁どのペットショップでもhttps://www.petco.com/shop/
en/petcostore/product/imagi
tarium-air-control-valve
水槽用チューブどのペットショップでもhttps://www.petsmart.com/fish/
フィルターとポンプ/空気と水
ポンプ/トップフィン水槽-airline
-tubing-5291863.html
カメラアンスコープMU300
カニューレチューブフィッシャー・サイエンティフィック427411P21マウスについて。他の年齢層には別のサイズが必要になるでしょう。チューブは気管にぴったり収まるはずです
カバースリップフィッシャー・サイエンティフィック12-541-01418 mm x 18 mm
DMEM:F12インビトロジェン11039-021
フローコントローラー主要楽器GS10510AVB個々のマウスへの空気の流れのために
流量計アヴァントールMFLX68560-04システム全体への空気の流れのために
ゲイマーTポンプブレイントリー・サイエンティフィックTP-700CPAP中の体温管理のために
ハンクスバランスソルト溶液フィッシャー・サイエンティフィックMT-20023cv使用時は1倍に薄めてください
イメージJNIH無料ダウンロードhttps://imagej.net/ij/download.html
ラテックス手袋は小サイズフィッシャー・サイエンティフィックMF-300-SCPAPマスク作りのために
低メトリングポイントアガロースインビトロジェン165200-100
メッシュアマゾンhttps://www.amazon.com/Top-
トリミング-ポリエステル-ホースヘア
-selling/dp/B01AC93LJ0/ref=sr
_1_fkmr2_1?keywords=dritz%2
Bpolyester%2Bhorsehair%2Bbr
aid&qid=1562072725&s=gatew
AY&SR=8-1-fkmr2&th=1
メタコリンミリポールA2251
顕微鏡ライカDMLFS
ペン/溶連菌インビトロジェン15140-148
灌流ポンプハーバード・アパラタトゥス70-2027
録音室ワーナー・インストゥルメンツRC-27あるいはそれに似たようなもの
再利用可能なヒーターパッドブレイントリー・サイエンティフィックTP-RゲイマーTポンプでの使用用
シリコーングリース(Molykote111)アマゾンhttps://www.amazon.com/Molykote
- 潤滑剤-成分-耐性-
揮発性/dp/B0DYDFLXGZ/ref=sr_1
_1_sspa?crid=2D4LQC7SRX07P&
dib=eyJ2IjoiMSJ9.HcWWXlt8ThxcB
eGCZ6iH5jwumyClyFGkW141klcjnn
OH3hc60r0hy53Ji-9HDW0TtH33nJ-
7UmalEzJGg59qB2gzsGNzFMelwG< > aBpsTElSrogzwQv27amBxERmXW
P3eedvi9rAYS1oy_HNesZTAxjTbqku
6PxkC7t24srDUq8mHRpDFor4I0iiRM
j6Ij2TWdlQf07ccTIMJ1l4n90nHxPop
9Nwh77ufMeWY2vu5B3to.0mfWIF
3_PrmciPZhO1EAE6RGiNj16v7l-v
CH1cqec1Y&dib_tag=se&キーワード
s=molykote+111&qid=1743607899
&sprefix=molykote+111%2Caps%2
C102&SR=8-1-spons&sp_csd=d2lkZ
2V0TmFtZT1zcF9hdGY&PSC=1
無菌6ウェルプレートフィッシャー・サイエンティフィック3516培養用のスライス用
縫合糸3-0フィッシャー・サイエンティフィックSP117カニューレを気管に結びつけるために
チューブフィッティングハーバード・アパラタトゥス72-1406
ビブラトーム(ペルコ・イージスライサー)テッド・ペラ11000または同等のもの

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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