大きな影響のためのスケールダウン:合理化されたハイスループット組換えアデノ随伴ウイルス生産

サマリー

遺伝子送達に広く使用されているにもかかわらず、組換えアデノ随伴ウイルス (rAAV) ベクターは顕著な生産上の課題に直面しています。このプロトコルは、接着細胞と浮遊細胞の両方を使用したマイクロスケールおよびミニスケールの製造方法の概要を示しています。この方法はベクターの生成、精製、最適化を合理化し、それによって前臨床研究を加速し、遺伝子治療パイプライン内の進歩を促進します。

要約

近年、組換えアデノ随伴ウイルス (rAAV) ベクターが遺伝子治療アプリケーションの主要なプラットフォームとして浮上しています。しかし、煩雑な製造および精製プロセスは、医薬品開発における重大なボトルネックのままです。労働集約的で時間のかかる精製手順を必要とせずに、ハイスループットで小規模なrAAV生産は、前臨床研究と初期段階の治療スクリーニングを加速するための貴重な代替戦略を提供します。このアプローチにより、初期 の in vitro および in vivo 評価に十分な品質を備えた多様な rAAV バリアントまたは治療コンストラクトの迅速な生成が可能になります。このプロトコルでは、細胞の種類と生産規模によって区別される2つの方法、マイクロスケールとミニスケールのrAAV生産を紹介します。マイクロスケール生産は、接着ヒト胚性腎臓(HEK)293T細胞(マイクロ6ウェル)を使用して6ウェル形式で実行されますが、ミニスケール生産は24ウェルプレート内の浮遊細胞(mini-HT24)を使用します。これらの方法で生成されたベクターは、細胞培養条件を最適化するために下流の分析を受けたり、導入遺伝子の生物学的活性を評価するために使用されます。主な分析結果には、ベクターゲノム滴定(vg/mL)、キャプシド力価測定(vp/mL)、ウェスタンブロット分析、細胞形質導入アッセイなどがあります。さらに、ミニスケールで製造され、アフィニティー樹脂を使用して半精製されたベクターを、塩化セシウム密度勾配 を介して 精製されたミディスケール調製物と比較します。ここで説明する合理化された方法は、細胞培養パラメーターの改良、スクリーニング中のリード候補の同定(すなわち、最適化された導入遺伝子カセットまたは優れたAAVキャプシド)、および導入遺伝子発現の増強に大きな可能性を示しています。まとめると、提示されたワークフローは、あらゆる研究室で容易に実装できる、遺伝子治療パイプラインにおける反復開発のための堅牢で効率的なプラットフォームの確立をサポートします。

概要

医薬品開発は複雑でリソースを大量に消費するプロセスであり、標的の特定、前臨床検証、臨床試験など、さまざまな段階からの高品質のデータを統合する必要があります¹。より迅速なスケジュール^{とコスト削減}2に対する需要の高まりに応えて、製薬業界は、現代の開発戦略の基礎として、高度な人工知能(AI)と組み合わせたハイスループット(HT)小規模アッセイをますます採用しています^3,4,5。HTアッセイは、^{従来の方法と比較して}、数分の一の時間とコストで、多数の薬剤候補またはアッセイ変数の迅速なスクリーニングと評価を可能にします^5,6。

遺伝子治療アプリケーション、特にアデノ随伴ウイルス(AAV)ベクターを利用するアプリケーションでは、高コストと長い製造スケジュールが^{大きな課題と}なっている7。開発プロセスは、トランスフェクションに必要なプラスミド材料の製造から始まり、ウイルスベクターの生産に十分な高密度への細胞増殖が続きます。トランスフェクション後、収穫前に2〜5日間のインキュベーション期間が必要であり、プロセスは精製およびバッチ^{特性評価8,9}で終了します。このワークフローは、合計すると最大1か月かかる場合があり、通常、アフィニティーカラムまたはグラジエント超遠心分離^{9、10、11、12}を使用する場合に並行して実行できる限られた数の調製に制限されます。

小規模、ミニ、またはマイクロスケールのAAV生産プロトコルの必要性を認識し、この分野では、小規模なラボスケールのセットアップで組換えAAV(rAAV)を製造するためにいくつかのアプローチを採用してきました。これらのアプローチでは、通常、接着細胞に複数の15 cmディッシュ、^13、14、または50-2000 mLの懸濁培養用の¹⁵シェイクフラスコを使用します。過去には、勾配超遠心分離(ヨウジキサノール¹⁶、塩化セシウム(CsCl)¹⁷、またはスクロース勾配¹⁸など)などのAAV精製法が採用されていました。この安価で血清型に依存しない方法は、ラボ規模でrAAVを製造するのに非常に適していましたが、その労働集約的な性質と限られた超遠心分離機の容量により、ハイスループットアプリケーションにはあまり適していません^19,20。

より高いスループットに対する継続的な需要により、rAAV 生産を縮小するための代替アプローチの模索が行われました。接着細胞を使用して、6ウェル^13、21、22、96ウェル²³、さらには384ウェルプレート²⁴などのフォーマットが調査されています。最近では、浮遊細胞が採用されており、その拡張性が向上し、ベクター調製物8と同等、またはさらに優れた効力を備え^ている。

ただし、培養量が15 mL未満の懸濁細胞におけるrAAVのハイスループット生産は、依然として専門分野であり、公開されているプロトコル^は限られています^7,25,26。ほとんどの研究は、下^{流のアプリケーション8,9,27}で十分な収量を達成するために、より大きな量に焦点を当てていますが、接着細胞と同様に、ミニスケールフォーマットはリソース消費と処理時間を大幅に削減するため、現場での重要なニーズを満たします。重要なのは、ミニスケールおよびマイクロスケールのプロトコルでは、下流の特性評価と分析に「粗ライセート」、つまりベクター粒子を含む未精製細胞培養収穫物を利用することが多いことです。

この研究では、接着細胞と懸濁生産者細胞の両方を利用する2つのプロトコルの概要を示しています(図1)。接着HEK293T細胞から産生された粗rAAVライセートは、標的細胞の形質導入などのその後の用途に直接使用されます。対照的に、浮遊細胞で生成されたrAAVは、ハイスループットアフィニティー樹脂精製 によって さらに処理されます。これらの方法は、高価な試薬や材料の消費を最小限に抑えながら、収量の向上、ベクターの品質の評価、導入遺伝子発現のモニタリングを目的として特別に開発されました。ここで提示された結果は、アプリケーションの範囲に応じて、粗ライセート(接着細胞由来)とアフィニティー精製材料(浮遊細胞由来)の両方が適していることを示しています。さらに、アフィニティー樹脂を使用して得られたrAAVは、ヒト由来の神経細胞共培養における収量、純度、および形質導入効率の観点から、従来の塩化セシウム超遠心分離を使用して精製されたrAAVと直接比較されました。

遺伝子治療薬開発におけるハイスループット、小規模アッセイの採用は、イノベーションを加速し、科学的発見と治療の現実の間のギャップを埋める、不可欠な進歩を表しています。これらの方法は、コストとスケジュールを削減するだけでなく、多数の症状の並行テストを可能にし、最終的には革新的な治療法の効率的な開発に貢献します。

プロトコル

1. 接着細胞におけるrAAVベクターのマイクロ6ウェル生産

注:rAAVのマイクロ6ウェル生産は、Fakhiriらによって以前に公開されたプロトコルから適応されたバージョンです²¹。

1. HEK293T細胞の播種とトランスフェクション
   1. HEK293T細胞²⁸ のバイアルを37°Cのウォーターバスで解凍します。
   2. T175フラスコ内の30 mLの接着細胞培養培地に細胞を移し、DulbeccoのModified Eagle Medium(DMEM)+ 10%子牛胎児血清(FCS)で37°Cおよび5%CO₂で維持します。
   3. 2〜3日ごとにHEK293Tを分割する:細胞培養培地を吸引し、10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を慎重に加えて細胞を洗浄します。
      注:このプロトコルでは、rAAV産生に直接影響する細胞の完全性と健全性を確保するために、継代番号15未満の細胞継代のみが使用されました。
   4. 2 mLの0.025%トリプシン/エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を細胞に加え、37°Cで2分間(または細胞が剥離するまで)インキュベートします。
   5. 20 mLの新鮮な培地を加え、25 mLピペットを使用して培地中の細胞を懸濁して反応を停止します。コンフルエンシーに応じて、細胞を24 mLのDMEM高グルコース培地で1:10または1:20に希釈することができます。トランスフェクションに十分な細胞密度を得るには、T175フラスコに7×10⁶ HEK293T細胞をシードします。
   6. 37°Cで72時間後、トリプシン処理(ステップ1.1.3〜1.1.5で説明したとおり)によって細胞を回収し、20 mLの培地に再懸濁し、細胞をカウントします。
      注:細胞は、必要な精度、スループット、および利用可能な機器に応じて、さまざまな方法を使用してカウントできます。主に、手動計数(ノイバウアーチャンバー)と自動セルカウンターの2つのアプローチが使用されます。このプロトコルは、完全に自動化された画像ベースのセルアナライザーを使用して、生存率、細胞密度、凝集速度などの重要な細胞パラメータを測定します。
   7. 6ウェルプレートで0.5×10⁶ 細胞/ウェルの密度で細胞をシードします。細胞を均一に分散させるには、プレートを軽く振って_CO2 インキュベーターに入れます。
   8. 24時間後、細胞は60〜70%のコンフルエンスに達し、トリプルトランスフェクトすることができます。
   9. 各ウェルについて、90 μLの無血清培地と、pTransgene、pRep/Cap、pHelperを含む合計2.6 μgのプラスミドDNAを1:1:1のモル比で混合します。
   10. 2本目のチューブで、トランスフェクションの直前に5 μLのポリエチレンイミン(PEI)を90 μLの無血清培地に加えます。
   11. 2つの溶液を混合した後、混合物をボルテックスし、室温(RT)で10分間インキュベートします。
   12. トランスフェクションミックスを各ウェルに滴加えます。プレートをインキュベーターに戻す前に、プレートを軽く振ってください。
       注:トランスフェクション後の培地交換は可能ですが、細胞は実験全体を通して良好な生存率を維持したため、標準的な方法としては適用されませんでした。
2. 細胞の採取と溶解
   1. トランスフェクションの72時間後、プレートから細胞培地を慎重に吸引します。
   2. 各ウェルに500 μLのPBSを加えて細胞を切り離し、慎重にピペットを上下にピペットします。
   3. 細胞懸濁液を1.5 mLの微量遠心チューブに移します。
   4. 製造元の指示に従って、細胞の生存率と密度を手動または自動で測定します。
   5. 懸濁液から96 Uボトムプレートに50 μLを移し、フローサイトメトリー を介して レポーター陽性集団を定量することにより、トランスフェクション効率を決定します。
      注:プレート上のトランスフェクション効率をモニターするために、トランスフェクションコントロールを並行して実行することを常にお勧めします、すなわち、蛍光タンパク質(例えば、緑色蛍光タンパク質(GFP)、mCherryなど)を運ぶ導入遺伝子で1〜2ウェルのトランスフェクションを行うことです。形質導入されていない細胞を含むウェルは、ネガティブコントロールとして機能します。
   6. 残りの細胞懸濁液を800 × g でRTで10分間遠心分離して、生成されたベクターの主要部分を含む細胞をペレット化します。
   7. 上清を廃棄し、細胞を100 μLのPBSに再懸濁します。細胞懸濁液は-80°Cで保存できます。
      注:採取した細胞から粗ライセートを得るには、以下に説明する2つのアプローチのいずれかを使用します。
   8. 最初のアプローチでは、細胞を37°Cの予熱ウォーターバスと液体窒素を使用して、それぞれ5分間の5回の凍結融解サイクルにかけることができます。サイクル間でサンプルを2〜3秒間短時間渦状にします。
   9. このプロトコルで2番目で主に使用されるオプションは超音波処理です。ここで、細胞懸濁液を薄壁ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)プレートまたはチューブに移し、ウォーターバスソニケーターに4°Cで置きます。
      1. 25%の振幅(強度)で30秒のオン/オフ増分で合計3分間サンプルを超音波処理します。
   10. 超音波処理後、卓上遠心分離機(16,100 × g 、4°Cで10分間)を使用して細胞をペレット化し、細胞破片を除去し、無細胞ベクター懸濁液を得る。
   11. 上清を1.5 mLチューブに移し、各サンプル10 μLを低結合96ウェルプレートにピペットで移し、デジタル液滴(dd)PCRまたはデジタル(d)PCR分析を行います。
   12. チューブと96ウェルプレートは、さらに使用するまで-80°Cで保管してください。
3. 粗ライセートを用いたHEK293A細胞の形質導入
   注:HEK293A細胞は、すべてのAAV血清型に適しているとは限りません。適切な細胞株を特定するには、SPIRIT²⁹ (SPIRIT データベースへのリンクについては 材料表を参照) または関連するオリジナルの研究論文^30,31 などのデータベースを参照してください。
   1. 形質導入の1日前に、1プレートあたり1.5×10⁶ 細胞の密度で3つの96ウェルプレートに細胞HEK293Aを播種します。
   2. 翌日、生成したベクター10 μLを異なる容量のPBSと混合して、1:2、1:10、および1:100の希釈液を生成します。
   3. マルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルプレート内の細胞を技術的3回に形質導入します。
   4. 培地交換を行わずに細胞をrAAVと72時間インキュベートします。その後、発現した導入遺伝子に応じて、タンパク質レベル測定、蛍光タンパク質発現のためのフローサイトメトリー解析、ノックダウン/ノックアウト解析など、下流の実験を行います。
   5. このプロトコルで実行される標準的なフローサイトメトリーの場合、培地を吸引し、25 μLの0.025%トリプシン/ EDTAを添加して細胞を分離します。
   6. 37°Cで3分間インキュベートします。
   7. PBS中の175 μLの1%ウシ血清アルブミン(BSA)を各ウェルに添加して反応を停止します。
   8. 100 μLの細胞懸濁液をフローサイトメトリー分析に使用します。

2. 浮遊細胞におけるrAAVベクターのMini-HT24作製

注:ミニHT24セットアップでは、前述のマイクロ6ウェル生産とは対照的に、rAAVベクターの精製調製物は浮遊細胞を使用して生成されます。懸濁培養では、同じ培養量内で達成できる細胞密度の増加により、より多くの量のrAAVが得られます。このプロトコルでは、24深のウェルフォーマットが採用されました。粗細胞ライセートは、粗ライセートが適さない特定の用途に必要なクリーンな生成を目的として、AAVXアフィニティー樹脂を使用してハイスループットで精製されます(ディスカッションセクションを参照)。

1. 24ディープウェルプレートにおける浮遊細胞の培養とトリプルトランスフェクション
   1. 懸濁ウイルス産生細胞(VPC)のバイアルを37°Cのウォーターバスで解凍します。 継代細胞を30回未満にして、製造されたベクターの一貫した品質を保証します。
   2. 細胞を振とうフラスコ内の30 mLの懸濁培養培地に移し、維持培養条件(37°C、8%CO₂、95%湿度、140 rpm(振とう台半径25 mm)で2〜3日間培養します。
   3. 2〜3日後に生存細胞密度を決定します(ステップ1.1.6の注を参照)。AAV生産に必要な生細胞の数に達するまで、継代培養と増殖を続けます。
      注:細胞を4×10⁶ 細胞/mL>および6×10⁶ 細胞/mL<の生存密度で、または使用する個々の細胞株に基づいて製造元の指示に従って培養します。6 × 10⁵ 細胞/mL の生存密度で 3 日間播種し、分割または 3 × 10⁵ 細胞/mL で 4 日間播種します。製造元の指示に従って分割します。
   4. 24ディープウェルプレートの各ウェルの2.5 mLに3×10⁶ 細胞/ mLを播種し、プレートを滅菌膜蓋で覆います。
   5. 次のように、各rAAVコンストラクトのトリプルトランスフェクションミックスを調製します。
      1. 生産プラスミド(pHelper、pRep/Capsid、pTransgene)のDNAミックスを1:1:1モル比で調製し、1×10⁶ 生細胞あたり600 ngのDNAの最終質量で調製します。
      2. 混在液を懸濁培養培地中で、トランスフェクトする培養体積の2.5%の最終容量で調製します。
      3. PEI-Mixを懸濁培養培地中で、トランスフェクトする培養体積の2.5%の最終容量で調製します。DNA 1 ngあたり1 ng PEIの最終質量を使用します。
      4. 個々のPEI-Mixの全容量を対応するDNA-Mixに移すことにより、DNA-MixとPEI-Mixの両方を組み合わせると、培養体積の5%のトランスフェクションミックス量が得られます。
      5. 上下に10回ピペッティングして混合します。
         注:インキュベーション³²中に形成されたPEI-DNA複合体の破壊を避けるために、インキュベーション時間後にトランスフェクションミックスをボルテックスしないでください。
      6. RTで10分間インキュベートします。
   6. ディープウェルプレートを注意深く振とうながら、トランスフェクションミックスを対応するウェルに滴下的に加えます。
   7. 滅菌通気性レーヨンフィルムを使用してプレートを密封し、蒸発を最小限に抑えるために対応するメンブレン蓋でさらに覆います。
   8. プレートが適切なディープウェルシェーカートレイに置かれていることを確認し、しっかりと固定してください。
   9. 細胞を37°C、8%CO₂、95%湿度、225rpmで72時間インキュベートします。
      注:ディープウェルプレートのフォーマットが異なれば、細胞が時間の経過とともに底に沈降することなく、均質な懸濁液中の細胞の効率的なガス交換と培養を可能にするために、振とう速度を個別に評価する必要があります。これには、個々の実験装置とセットアップ、および生産に使用される細胞株に応じた初期テストが必要です。特に、細胞懸濁液を均一に保ち、細胞が底に沈降しないように、振とう半径、プレート形式、ウェル底部の形状を考慮してください。
2. 収穫と溶解
   1. 各ウェルの全培養量を個別に標識された5 mLチューブに移して細胞を回収し、800 × g で4°Cで20分間遠心分離します。
   2. 上清を吸引し、ペレットを550 μLのダルベッコ(D)PBSに再懸濁し、懸濁液を1.8〜2.0 mLのスクリューキャップチューブに移して、チューブを開くときのエアロゾルや液滴を防ぎます。
      注:この時点でペレットを保管して、後で精製プロセスを進めることもできます。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)再懸濁ペレットを-80°Cで保管し、凍結融解サイクルステップ中にこれを必ず考慮してください。
   3. チューブを液体窒素に約2分間入れてから、37°Cのウォーターバスで解凍してライセートを調製します。このサイクルを3〜5回繰り返します。
   4. 4°Cで1000 × g で5分間遠心分離します。 遠心分離機のバケツをエアゾール密閉蓋で覆います。
   5. 遠心分離機からチューブを慎重に取り外します。
      注:溶解物は、精製プロセスで使用される樹脂の目詰まりを避けるために、透明で目に見える破片や濁りがない必要があります。ペレットを振ったり、邪魔したりしないでください。上清が透明でない場合は、遠心分離ステップを繰り返します。高濃度のサンプルや大量の破片を含むサンプルの場合は、遠心分離速度を上げたり、時間を長くしたりすることを検討してください。
3. アフィニティー樹脂ベースのハイスループットrAAV精製
   1. ビーカーで、720 mgのクエン酸を50 mLの超純水に加え、最終濃度75 mMのクエン酸に到達させて溶出バッファーを調製します。
   2. 粉末が完全に溶解するまでバッファーをかき混ぜます。
      注:ウェル容量が、こぼれたり、隣接するウェルの相互汚染の危険を冒さずに、バッファー容量とピペットチップを収容するのに十分であることを確認してください。
   3. バッファーを連続的に撹拌し、pH電極で測定しながら、1 M塩酸(HCl)を滴下してpHを3.0に調整します。
   4. 0.22 μmの孔径を使用してバッファーで滅菌ろ過を実行します。
   5. 表1に記載されているスキームに従って精製するために、ウェル容量が2〜2.2 mLの96ディープウェルプレートのカラムを調製します。
      注:ここでのサンプルは、電子マルチチャンネルピペットセットアップを使用して精製されました。このプロセスは自動リキッドハンドリングシステムと互換性があり、より高いサンプルスループットのためにスケールアップすることができます。
   6. 精製スキームに示されているパラメータ( 表1を参照)を使用して、RTのバイオセーフティキャビネットで精製を実行するか、樹脂またはサンプル量、予想される力価などに応じて、個々の要件に従ってパラメータを最適化します。
   7. 溶出後、各サンプルに1/4の溶出量の中和バッファーを加えます。
   8. 体積の80%を上下に10倍にピペッティングして混合します。
   9. メンブレンカセットを取り外し、各ウェルに1600 μLの透析バッファーを加えて、透析プレートを調製します。
      注: 再乾燥は膜の完全性と機能を損なう可能性があるため、透析を行う前に膜を液体に接触させないように注意してください。
   10. サンプル全体の容量(最大300 μL)を、適切な容量形式とメンブレン孔径(≥20,000分子量カットオフ(MWCO))の透析カセットに移します。メンブレンが均一にロードされ、気泡が存在しないことを確認してください。
   11. カセットを透析プレートのロードされたウェルに入れ、プレートをシーリングホイルで密封します。
   12. 透析プレートを振とうプラットフォームに移し、300 rpm、4°Cで30分間インキュベートします。
   13. 透析バッファーを交換し、300 rpm、4°Cで30分間インキュベーションを繰り返します。
   14. バッファー交換とインキュベーションを合計3回繰り返します。
   15. 透析したサンプルの全量を標識された保存チューブに移し、その後特性評価やその他の実験に使用する場合は4°Cで保存します。
   16. 長期保存のために-80°Cで保管してください。凍結融解サイクルはAAVの効力に影響を与える可能性があるため避け、必要に応じて少量のアリコートを調製してください。
4. デジタルPCR(dPCR)を用いた粗ライセートおよび樹脂ベースの精製からのrAAVゲノム力価の滴定
   1. 粗ライセートのゲノム力価、すなわちウイルスゲノム/mL(vg/mL)を決定するには、採取したベクターサンプルをRTで解凍し、10 μLをチューブにピペットで入れます。
      注:ベクター調製物のウイルスゲノム(vg / mL)力価を決定するためにいくつかの方法が利用可能であり、絶対定量は通常、2つの主要なアプローチに依存しています:液滴またはエマルジョンベースの方法(ddPCR)、およびデジタルPCR(dPCR)^33,34で表されるマイクロプレートベースの方法。これらのデジタル法に加えて、定量的PCR(qPCR)を使用して絶対定量化を達成することもできます。qPCRは従来、相対定量法ですが、プラスミド標準曲線を使用することで絶対定量に適応できます。これには、既知の濃度で標的配列を含むプラスミドが含まれ、ウイルスゲノム力価^21,33を外挿するための参照として機能します。qPCRはddPCRやdPCRよりも高速で安価ですが、精度が低く、プラスミド標準¹⁶の精度に大きく依存しています。定量方法に関係なく、粒子からウイルスゲノムを放出するためにサンプルを前処理する必要があります。このプロトコルは、Dobnik、D.ら³⁵によって以前に説明された方法に従います。
   2. rAAVサンプルをヌクレアーゼで37°Cで30分間処理し、トランスフェクションプロセスからの遊離プラスミドDNAを分解します。
      注:使用する酵素に応じてオプション:サンプルを95°Cに15分間加熱して、酵素を不活性化し、ベクターのキャプシドを溶解します。
   3. RTで冷却した後、プロテイナーゼKを15分間加えてカプシド断片を消化します。
   4. プロテイナーゼKを不活性化するには、サンプルを再び95°Cに15分間加熱します。
   5. 製造元の指示に従って、ddPCRまたはdPCRマスターミックスを調製します。
   6. 標識DNAプローブは、色素をインターカレートするよりも特異的なシグナルを提供するため、使用してください。プローブをプロモーターやポリAテールではなく、ウイルスゲノム、すなわち導入遺伝子(注を参照)で「中心的に」結合するように設計し、それぞれのPCRシステムと互換性のあるヘキサクロロ-6-カルボキシフルオレセイン(HEX)または6-カルボキシフルオレセイン(FAM)などの蛍光色素を選択します。
      注:最近、ウイルスゲノムの異なる領域を標的とするプライマー/プローブセットを採用するマルチプレックスddPCRまたはdPCRが、力価測定の精度を高めるために利用されています^36,37。このアプローチにより、参照研究で概説されている式を適用するか、統合されたソフトウェアソリューションを使用することで、インタクトゲノムの定量化が可能になります。
   7. 低DNA結合96ウェルプレートを使用して、ddH₂Oで後処理サンプルの10倍の連続希釈を実施します。最後に、5.5 μL(ddPCRの場合)または2 μL(dPCRの場合)のテンプレート(希釈液10、⁴、および10⁵)を、プライマー/プローブを含むddPCR/dPCRマスターミックスがすでに含まれているddPCR 96ウェルプレートに移します。個々のコンストラクトの生産効率に基づいて希釈範囲を調整し、測定値が線形検出範囲内に収まるようにします。
      注:dPCR/ddPCR定量は高感度の方法であるため、サンプルの10⁴希釈および10⁵希釈が必要です。
   8. ddPCRについては、以下の手順に従ってください。
      1. PCR増幅については、使用するプライマー/プローブセットに基づくアニーリングおよび増幅時間の調整など、アッセイ条件を最適化するための製造元の指示に従ってください。この研究で使用された標準的なサイクリングプロトコルは次のとおりです:9°Cで10分間の初期変性(ランピング°C / s)。9°Cで30秒間変性35サイクル、6°Cで60秒間増幅。続いて、9°Cで10分間(ランピング°C/s)の最終伸長ステップが続きます。
      2. rAAVウイルスゲノムターゲットのPCR増幅後、プレートを液滴リーダーに移し、製造元の指示に従って各ウェルの蛍光強度を測定します。液滴リーダーは、ウイルスゲノムコピー数の絶対定量を可能にします。
   9. dPCRについては、以下の手順に従ってください。
      1. ddPCRベースの定量について説明されているように、アッセイ条件を最適化するための製造元の指示に従ってください。
      2. 出発点として、dPCRデバイスで事前に設定された熱プロファイルに従い、9°Cで2分間の最初の変性ステップ、その後9°Cで15秒間40サイクルの変性、および5°Cで30秒間のアニーリング/伸長を行います。
         注:このプロトコルは、メーカーが指定した推奨ランプレートと反応量を使用して実行されました。
   10. 通常、装置メーカーが提供するさまざまなソフトウェアソリューション(それぞれQX managerとQIAcuity Software Suite 1.2など)を使用して、ddPCRおよびdPCRデータを解析します。どちらの方法でも、定量のために正と負のパーティション/液滴の適切な比率を持つサンプル希釈液のみを選択します。
       注:粗ライセートおよびAAVX樹脂精製材料からのrAAV粒子力価(vp / mL;vp =ウイルス粒子)の測定には、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用できます。AAV定量用のさまざまな市販の標準サンドイッチELISAキットが利用可能です(この研究で使用したキットは 、 材料表).製造元のマニュアルに従ってアッセイを実行します。使用するELISAキットが、製造されているAAV血清型と互換性があることを確認してください。
5. 精製されたrAAVからのVP比の分析
   注:24のディープウェルセットアップの個々のウェルからの各サンプルのウイルスカプシドタンパク質(VP)比を決定するには、標準的なウェスタンブロットまたは自動キャピラリーベースのプロトコルのいずれかを実行できます。
   1. AAV2カプシドタンパク質VP1、VP2、およびVP3を検出するには、一次抗AAV VP1 / VP2 / VP3モノクローナル抗体を使用します。一次抗体がそれぞれの血清型またはカプシド変異体で機能することを確認してください。
   2. 組換えVP1、VP2、VP3などの適切なポジティブコントロールやAAV参照標準を使用してください。
   3. ポジティブコントロールを1:1:10(VP1:VP2:VP3)の分子比で調製し、予想されるVP比を模倣します。これは、信号領域積分を使用したVP比の定量化のリファレンスとしても役立ちます。
   4. 検出するキャプシドタンパク質を網羅する適切な範囲のキャピラリーキットを選択し、最小のもの(~60 kDaのVP3)と最大のもの(~82 kDaのVP1)を含めます。これは、使用する血清型とカプシド変異体によって異なります。
   5. キットに付属の試薬とビオチン化ラダーを製造元の指示に従って準備します。
   6. キットの付属の希釈バッファーで、サンプルの希釈シリーズを調製します(1 × 10¹² vg/mLから1 × 10¹⁰ vg/mLまでのゲノム力価に基づく、または希釈サンプルから1:64までの1:2希釈液に基づく)各サンプルの良好な検出範囲を確保します。
   7. 製造元の指示に従って、または以前のテストに応じて、提供された抗体希釈バッファーで一次抗体を希釈します。1:100から始めます。
   8. 一次抗体の供給源に応じて、対応する検出キットを使用してください。
   9. キットに付属のスキームに従ってプレートをロードします。
   10. 空のカラムに水またはサンプル希釈バッファーを入れて、乾燥によって装置の毛細血管を損傷しないようにしてください。
   11. プレートをシーリングホイルで覆い、1200 × g、4°Cで5分間遠心分離します。
   12. プレートとキャピラリーを装置に移し、事前に設定された標準条件を使用して実行します。
   13. Compass (バージョン 6.3.0) ³⁸ などのデータ分析ソフトウェアを使用して実行を分析します。
       注:粒子の完全性、単分散性、および純度の陰性染色を分析するには、透過型電子顕微鏡(ns-TEM)をお勧めします。TEM分析は、Steiningerらによって説明されているように実行できます。アル²⁵.ただし、質量測光法³⁹、SEC-MALS⁴⁰ 、スライバー染色⁴¹ などの他の方法も、rAAV調製物の品質を評価するための補完的な読み出しを提供できます。
6. 精製されたウイルス粒子による形質導入
   注:精製されたウイルスベクターで細胞を形質導入するには、感染の多重度(MOI)を決定する必要があります。MOIは、細胞ごとに追加される粒子を含むゲノムの数として定義されます。これは理論的な値であることに注意することが重要です。細胞あたりに送達されるrAAVゲノムの実際の数は、標的細胞をうまく形質導入するキャプシドの能力に依存します。したがって、最適なMOIは常に実験的に決定する必要があります。このセクションでは、異なる精製方法(塩化セシウム超遠心分離とAAVXアフィニティー樹脂)を使用して製造された2つのウイルスベクターストックを比較することが目標でした。この目的のために、ヒト由来のニューロン共培養物を2つの製剤で形質導入し、蛍光顕微鏡を使用して形質導入効率を評価しました。
   1. 96ウェルの黒色光学底板を0.1%(ポリ-L-オルニチン)PLOで4°Cで一晩コーティングするか、37°Cで≥1時間インキュベートします。
   2. 播種当日に、PLOコーティング試薬を吸引し、低成長因子基底膜マトリックスでコーティングし、37°Cで≥1時間インキュベートします。
   3. 運動ニューロンをアストロサイトで1:6の比率で、またはサプライヤーの推奨に従って培養します。
   4. 2日間 のin vitro (DIV)で、50,000のMOIで共培養を形質導入します。
   5. ウイルスアリコートを4°Cで解凍する
   6. 形質導入培地(細胞あたりのウイルスゲノムに基づく所望のMOIのウイルスベクター+ウェルあたりの培養培地の50%を置換するための適切な量の細胞培養培地)を調製します。
   7. 形質導入培地と50%培地交換を行います。
   8. 5 DIVでは、通常の培地との完全な培地交換を行います。
   9. 2〜3日ごと、またはサプライヤーの推奨に従って、定期的な培地交換で細胞を維持します。
   10. レポーター導入遺伝子の正しい励起を備えたライブイメージング顕微鏡で発現レベルを監視します。ヒト由来のニューロンの場合、形質導入後10〜14日の間にプラトー発現が観察されます( 図4Aを参照)。

歩	バッファー/材料	ウェル容量 [μL]	作業量 [μL]	サイクル	流量 [μL/分]
1. 平衡化	平衡/ ウォッシュIバッファー	1100	950	2	500
2.読み込み/ キャプチャ	サンプル上清	550	500	4
3.ウォッシュI.	平衡/ ウォッシュIバッファー	1100	950	2
4. ウォッシュ II	洗浄 II バッファー	1100	950	2
5. 溶出	溶出バッファー	70 μL(20 μLレジンチップ) 250 μL (80 μL レジンチップ)	60 μL (20 μL レジンチップ) 240 μL (80 μL レジンチップ)	4
6. 中和	中和バッファー	溶出量の1/4を各サンプルに直接追加します。 70 μLの溶出サンプル→17.5 μLを添加 250 μL の溶出サンプル→ 62.5 μL を添加		-	-

表1:rAAVのアフィニティー樹脂精製のためのプレートレイアウトと精製パラメータ。

結果

近年、ラボスケールのAAVベクター生産の需要が大幅に増加しており、これをサービスとして提供する多数の受託研究機関の設立につながっています⁴²。アウトソーシングには高コストとスケジュールの遅れが伴うことが多いため、社内で rAAV を生産することは依然として魅力的な選択肢です。特に、精製ステップを統合しながら材料の消費と作業時間を最小限に抑えるハイスループットプロトコルは、医薬品開発パイプラインにおいて非常に有益です。

このプロトコルは、rAAV生産のための2つのハイスループットセットアップ、接着細胞を使用したマイクロ6ウェルアプローチと浮遊細胞用のミニHT24プロトコルの概要を示しています( 図1の概要を参照)。マイクロ6ウェルセットアップは、接着性HEK293T細胞を利用して、6ウェルフォーマットでrAAVを生成します。この材料は、rAAV2産生に対する2つの市販のPEIトランスフェクション試薬と塩化ナトリウム(NaCl)の効果を評価するために使用されました(図2A)。ここでは、異なるパラメータを同時に監視しました:(i)GFP導入遺伝子を使用した生産細胞の生存率およびトランスフェクション効率(図2B および 補足図1)、および(iii)粗ライセートによる形質導入後のGFP陽性(GFP +)細胞の割合(図2C)。形質導入実験は、ベクター力価と機能の安価で迅速な間接読み出しとして機能しました。興味深いことに、トランスフェクション試薬とDNAの比率を低くすることで、良好な細胞生存率を維持しながら、効率的なベクター生産を促進するのに十分でした(図2B)。さらに、150 mM NaClの添加は、特にPEIpro試薬を使用する場合に有益であると思われました。この実験をマイクロスケールで実施すると、いくつかの利点がありました:(i)細胞播種、トランスフェクション、ベクター回収が1週間以内に完了する高速ワークフロー。(ii)標準的な下流分析アッセイとの互換性。(iii)すべてのAAV血清型への幅広い適用性。

in vivo実験やin vitro速度論研究(より高い範囲またはより広い範囲のMOIが適用される)など、大量のrAAVベクターを必要とするアプリケーションでは、スケールアップが必要です。ハイスループット精製に十分な材料を提供するミニHT24プロトコルを確立するために、浮遊細胞を使用しました。接着細胞と比較して、懸濁培養は表面積に制約されないため、拡張性が高く、スペース効率が高くなります。浮遊細胞は培地中で自由に増殖するため、培養体積全体を占めることができ、3次元でのスケールアップがより簡単になります。これにより、層培養と比較してより高い細胞密度を達成することができます。さらに、懸濁システムは、継代や収穫中に取り外し手順を必要としないため、メンテナンスと処理が容易です。24ウェルフォーマットでのrAAV産生の均一性は、プレート全体の3つの主要なパラメータを分析することによって評価されました(図3):(A)粒子力価(vp / mL);(B)キャプシドのVP比。(C)ゲノム力価(vg/mL)および(D)空対満の比率。

これらのパラメータ間である程度のばらつきが観察されましたが、それはほぼ 2 倍の範囲内にとどまり、これは測定誤差の範囲内です。VPタンパク質の発現も、自動ウェスタンブロット分析を使用して評価しました(図3E)。最後に、マイクロ6ウェル、ミニHT24、および中規模(振とうフラスコ)の製造から得られた総収量の比較を提示し、実験要件と下流の分析ニーズに基づいて適切なスケールを選択するガイドを示します(図3F)。

AAV精製プロトコルの重要な側面は、ベクターの純度と効力の評価です。ここでは、樹脂精製ベクターを、2段階塩化セシウム(CsCl)ベースの超遠心分離(UC)法を使用して精製したベクターと並べて比較しました(図4)。運動ニューロンと星状細胞の形質導入の成功によって実証されているように、2つの製剤間の同等の効力は蛍光顕微鏡によって観察されました(図4A)。電子顕微鏡分析では、粒子形状や凝集状態に有意差は見られませんでした。ただし、CsCl精製によりより一貫してよりクリーンな調製物が得られることを示すわずかな傾向がありました(図4B)。

図1:rAAVの生産と調製アプローチの概要。 この図は、中規模の振とうフラスコからミニHT24懸濁培養、マイクロ6ウェル接着培養に至るまで、rAAVの製造方法を示しています。これらのアプローチにより、さまざまな細胞溶解およびベクター精製戦略を利用して、さまざまな規模での rAAV 生成が可能になります。rAAVの最終特性評価には、通常、ウイルスゲノム定量(vg/mL)のためのqPCR/dPCR、キャプシド力価(vp/mL)測定のためのELISA、および生物学的活性を評価するための細胞形質導入アッセイが含まれます。BioRender で作成。オーランド、P. (2025) https://BioRender.com/x3sfbdd。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:マイクロ6ウェルrAAV生産のためのトランスフェクションプロトコルの最適化。 (A)テストされたパラメータと分析測定値を使用した実験の概略図。(B)トランスフェクションの24時間前に、HEK293T細胞を0.5×10⁶ 細胞/ウェルの密度で6ウェルプレートに播種しました。さまざまな DNA 量、PEI タイプ (Pro または Max)、比率、および NaCl 濃度がテストされました。(C)形質導入後72時間のGFP陽性(GFP+)HEK293AパネルAからの等量のライセート(各10 μL)の割合。簡単にするために、ベクター収量が最も高い(2650 ng)得られたDNA条件のみを示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:ミニHT24セットアップで産生されたrAAVの分析特性評価と、異なるスケールでの力価比較。 (A)各ウェルの精製されたrAAVキャプシド力価のELISA分析。値は、精製後のプレートの平均粒子力価を超える変動として表されます。予想される力価は、使用されたAAVキャプシドとパッケージ化された導入遺伝子によって異なります。異なるAAVベクターの粒子力価は、10¹¹ VP/mL以下から10¹² VP/mL以下の範囲でした。(B)示されたウェルから精製されたrAAVのWESによるVP比分析。組換えAAV2 VP1、VP2、およびVP3をポジティブコントロールとしてモル比1:1:10で使用しました。(C)各ウェルから精製されたrAAVのdPCR分析。値は、精製後のプレートの平均ゲノム力価を超える変動として表示されます。予想される力価は、使用されたAAVキャプシドとパッケージ化された導入遺伝子によって異なります。異なるAAVベクターのゲノム力価は、低10¹⁰ (rAAV2)から高10¹¹ vg/mL(rAAV9、ここには示していません)の範囲でした。(D)パネルAおよびCのゲノムおよび粒子力価の結果に基づく、示されたウェルの空対満の比率(E / F)。値はプレート平均に正規化されます。示されている rAAV2 のミニ HT24 フォーマットの平均 E/F は、AAVX アフィニティー樹脂精製後の 10.6% ± 3.0% です。(E)各ウェルからの精製されたrAAV2サンプル中のVPタンパク質のキャピラリーウェスタンブロット分析。(F)各方法の最終サンプル量と濃度を考慮した総ウイルスゲノム収量の比較。データは、最小フォーマット(マイクロ6ウェル)の平均倍数差として表示され、エラーバーは生物学的複製からの標準偏差(SD)を示します。AAVX アフィニティー樹脂精製によるハイスループット 24 ディープウェル生産の場合、SD = ±0.176(n = 24);マイクロ6ウェル超音波処理用;SD = ±0.349 (n = 6);CsClグラジエント精製による標準的な中規模生産の場合、SD = ±134.70(n = 2)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:ハイスループット(HT)樹脂精製rAAVと標準CsCl精製サンプルの効力と純度の比較。 (A)ヒト由来の運動ニューロンとアストロサイトを、50,000のMOIでレポーターとしてヒトシナプシンプロモーターの下で蛍光レポーターmRuby3を発現する同じrAAVコンストラクトを形質導入しました。蛍光顕微鏡画像は、形質導入 (DPT) の 7 日後にライブ イメージング顕微鏡で撮影されました。rAAV は、標準的な CsCl グラジエント法 (上) または HT AAVX アフィニティーレジンチップベースのアプローチ (下) のいずれかを使用して精製しました。CsCl精製サンプルは、形質導入を行う前にさらに1回凍結融解サイクルにさらされ、樹脂精製rAAVと比較されました。(B)CsCl勾配法(上)およびHT樹脂チップ法(下)で精製されたrAAV2血清型ベースの変異体の透過型電子顕微鏡(TEM)分析。rAAV2のHT樹脂精製サンプルの2つのバッチを、透析なし(左下)と透析あり(右下)で比較できます。空と満の比率(E/F)は、TEMを使用して決定され、CsCl勾配超遠心分離精製サンプルでは90%が>、AAXアフィニティー樹脂精製サンプルでは40%が<。スケールバー = 100 nm。パネルBは、示された方法を使用した精製バッチの代表的な写真を示しています。これらの画像は、パネルAに示されている形質導入実験に使用されたのと同じ調製物に属していないことに注意してください。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足図1:マイクロ6ウェルセットアップを使用したrAAV2-GFP産生のためのHEK293T細胞のトランスフェクション。 トランスフェクションには、さまざまな DNA 量、NaCl 濃度(mM 単位)、PEI 生成物、および PEI 対 DNA 比が使用されました( 図 2 を参照)。画像は、トランスフェクションの72時間後に同じ露光時間(320ミリ秒)を使用して撮影されました。代表的な明視野および蛍光顕微鏡画像をこの図に示します。倍率:10倍。縮尺バーは表示されません。画像は説明と定性的評価のみを目的としています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

このプロトコルペーパーでは、接着細胞と浮遊細胞の両方を利用して、ハイスループットの小規模設定でrAAVを生産するための効率的な方法を概説します。これらの方法論は、時間、コスト、リソースの消費を最小限に抑えながら前臨床研究をサポートする、スケーラブルで柔軟な rAAV 製造プロセスに対する需要の高まりに対応します。

接着細胞システムと懸濁細胞システムはどちらも、小規模なrAAV生産に明確な利点と課題を提供します。マルチウェルプレートフォーマットで増殖したHEK293T細胞²⁸ などの接着細胞システムは、初期段階のベクター設計および比較研究に特に適しています。確立された培養およびトランスフェクションプロトコルとの互換性により、ほとんどのラボで簡単に実装できます。たとえば、Grosse et al.ウイルスキャプシド²²の組み立てに重要なタンパク質であるAAP機能を調査するために、6ウェルプレートでの小規模生産を利用しました。Drittanti らは 、rAAV複製の動態を評価し、rAAV産生に対するさまざまなアデノウイルスヘルパーの効果をテストするために、96ウェルプレートでrAAVベクターを作製しました²³。特に、後者の研究では、AAV Rep と Cap を発現する特殊な HeLa 細胞を使用してシグナルをさらに増幅する複製アッセイが記載されました。最近では、QuanらはsiRNAスクリーニングのコンテキストで384ウェルのハイスループット生産プロトコルを適用し、相対力価²⁴を報告しました。しかし、材料の量が限られているため、蛍光タンパク質の測定を超えて細胞形質導入実験で十分なMOIを達成できるかどうかは、まだ不透明であり、再現性に影響を与える可能性があります。

この研究では、接着HEK293T細胞におけるマイクロ6ウェルベースの生産を使用して、rAAV2の培養条件を最適化しました(図1および図2)。以前の研究および技術レポート^43,44に沿って、PEIとDNAの比率の低下とトランスフェクション中のNaClの添加は、rAAV産生にプラスの影響を与えました。これは、HEK293A細胞で産生されたベクターの形質導入効率に間接的に反映されました。低いPEI:DNA比で観察された顕著な違いは、特にPEIproの細胞生存率の低さによって示されるように、主に細胞ストレスに起因していました。PEImax条件下では効果はあまり明らかではありませんでしたが、顕微鏡画像により、細胞層の無細胞領域が明らかになり、ストレスまたは細胞剥離が示されました(補足図1)。

重要なことに、これらの発見は懸濁培養におけるベクター産生に直接適用できなかったことであり、接着HEK293T細胞におけるrAAV産生を促進する実験条件は、基礎となる細胞型が同じままであっても、必ずしも浮遊細胞に翻訳されるとは限らないことを強調しました。この不一致は、これら2つのシステム間のトランスクリプトームレベルとプロテオミクスレベルの違いに起因する可能性があります⁴⁵。その結果、臨床生産プロセスとの緊密な連携により、開発の初期段階で懸濁培養の使用が必要になる場合があります。これらの観察結果と、懸濁液でより高い細胞密度を達成するという利点に基づいて、24深のウェルシステムを採用して、ミニスケール懸濁培養(mini-HT24)でrAAVを生産しました。このシステムは広範な検証を受け、プレート全体で一貫したvg/mLおよびvp/mL力価、および均一なVPタンパク質発現と比率を実証しました(図3A-E)。実際、マイクロ6ウェルフォーマット(ウェルあたり5×10⁵細胞)と比較して、ミニHT24セットアップで達成されたより高い細胞密度(3×10⁶細胞/mL)は、図3Fに示すように、より高いrAAV力価をもたらしました。これは、培養容器の表面積に制限されない懸濁液ベースのシステムの重要な利点を浮き彫りにしています。ただし、このようなシステムを実装するには、すべての研究室で利用できるわけではない特殊な機器が必要です。最後に、AMBR15やAMBR250などのミニバイオリアクターシステムを使用して、ミニHT24システムから同定されたリード分子または優れた培養条件をさらに検証することが推奨^される。

精製レベルの選択は、特定の下流用途に対する rAAV 調製物の適合性を判断する上で重要な役割を果たします。接着培養物(マイクロ6ウェル)と懸濁培養物(mini-HT24)の両方に由来する粗ライセートは、予備スクリーニングアッセイに迅速で資源効率の高いオプションを提供します。これらのライセートには、ウイルス粒子、細胞破片、培地成分の混合物が含まれており、ベクターゲノム/粒子力価、形質導入効率スクリーニング、ウェスタンブロット分析などの用途に許容されます。特に、基本的な生物学的問題(AAP機能の調査で上記のように)、細胞培養条件の最適化、および前臨床候補のスクリーニングと選択に対処する研究に適用できます。ただし、不純物が存在すると、より高い希釈が必要になる場合があり、その結果、アッセイ感度が低下します。さらに、不純物は、初代細胞などの敏感な細胞型の生存率に悪影響を与える可能性があります。

粗ライセートとは対照的に、懸濁液ベースのプロトコルでのみ使用されるAAVXアフィニティー樹脂精製調製物は、無傷のカプシドを選択的に単離することにより、より高いレベルの純度を達成します。これにより、粗細胞溶解物の限界が克服され、これらの調製物は、 in vivo 研究、導入遺伝子発現動態の詳細な in vitro 分析、および多くの場合、より多くの材料を必要とする正確な機能的読み出しなどのアプリケーションにより適しています( 図3Fの収量比較を参照)。 in vitro アプリケーションの場合、mini-HT24設定で産生されたrAAVベクターの収量は、細胞数と必要なMOIに応じて、通常、読み出しの大部分に十分でした。対照的に、 in vivo アプリケーションでは、通常、用量、投与経路、および動物モデルに応じて、ミディシェイクフラスコスケール以上の製造が必要です。精製に必要なコストと時間が増加するにもかかわらず、得られる材料の一貫性と信頼性は、多くの場合、重要なユースケースへの投資を正当化します。特に、 図4 に示す結果は、アフィニティー樹脂法を使用して精製されたrAAVベクターが、従来の塩化セシウム(CsCl)超遠心分離によって精製されたものと同等の性能を発揮することを示しています。これは、存在するAAV種に応じて、空のキャプシドは形質導入に影響を与えないか、形質導入を強化する可能性さえあるという以前の観察と一致しています⁴⁸。ただし、この実験では1つのMOIと1つの時点しか使用されておらず、細胞の種類ごとに最適な条件を個別に決定する必要があることに注意することが重要です。CsCl精製は一般によりクリーンなバックグラウンドをもたらしますが、HT樹脂チップ精製AAVは純度のばらつきが大きくなります( 図4のTEM画像を参照)。これらの調査結果を総合すると、ハイスループットで小規模なワークフローの採用をさらに裏付けるものになります。

ハイスループット精製における小規模アフィニティー樹脂充填チップの使用は、迅速なrAAVスクリーニングのための実用的なソリューションを提供しますが、信頼性の高い結果を確保するには、いくつかの技術的側面に注意が必要です。樹脂床の体積が限られているため、これらのチップは、特に粗ライセートを処理する場合に目詰まりしやすいです。したがって、高速遠心分離によるライセートの清澄化は、ローディング前に細胞破片を除去するために不可欠です。mini-HT24セットアップでは、トランスフェクションプロトコルを最適化し、ウェルあたり最大作業量を2.5〜3 mLに維持することをお勧めします。さまざまな血清型またはカプシドライブラリーを扱う場合、結合効率および回収率はカプシド構造⁴⁹によって異なる場合があるため、異なるアフィニティー樹脂タイプを試験することが推奨される。ハンドヘルド電子マルチチャンネルピペッティングシステムにより、このワークフローを小規模なラボに簡単に統合でき、自動化を必要とせずに柔軟性を提供します。ただし、手動処理ではばらつきやロット間の差異が生じる可能性があります。一貫性を高めるには、自動リキッドハンドリングプラットフォームが有益である可能性があります。サンプルとバッファーの添加中に相互汚染を避けるために細心の注意を払う必要があり、オーバーフローを防ぐために適切なウェル容量を備えた適切なプレートフォーマットの使用が不可欠です。サンプルの清澄化、プロトコルの最適化、樹脂の選択、慎重なピペッティングなどのこれらの考慮事項に対処することで、研究者は技術的な問題を最小限に抑え、ハイスループット、小規模のアフィニティー精製ワークフローの堅牢性と再現性を高めることができます。

結論として、ハイスループットで小規模な rAAV 製造方法とアプリケーション固有の精製戦略を組み合わせることで、遺伝子治療研究を前進させるための多用途のプラットフォームが提供されます。これらのプロトコルは、多様な実験要件を満たす柔軟性を維持しながら、費用対効果が高く効率的なワークフローに対する需要の高まりに対応します。純度、拡張性、資源消費のトレードオフのバランスをとることで、研究者は前臨床開発を加速し、臨床応用への移行を促進できます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.9%非緩衝生理食塩水	B. Braun、メルスンゲン、ドイツ	7647-14-5	洗浄IIバッファー
1 M ハイドロクロサークル酸	Merck Millipore、米国マサチューセッツ州バーリントン	1099700050	緩衝液のpH調整
10 x DNase Iバッファ	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、米国	AM8170G	ddPCR/dPCRの
1M トリス-HCl、pH 9.0	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、米国	J60707です。AP通信	中和バッファー
24-ディープウェルマイクロプレート	Enzyscreen、Heemstede、オランダ	CR1424cl	懸濁培養装置
250 mL ポリカーボネート三角フラスコ、ベントキャップ付き	コーニング、ニューヨーク、ニューヨーク、アメリカ合衆国	431144	懸濁培養装置
66 - 440 kDa分離8x25キャピラリーカートリッジ	BioTechne、ミネソタ州ミネアポリス、米国	SM-W008	自動ウェスタンブロットキット
96ウェル2.2mLポリプロピレンDeepWell	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、米国	AB0661	サンプル処理および保管プレート
96ウェルブラック/クリア底板、TC表面	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、米国	165305	形質導入アッセイ
AAV2 VP1、組換えタンパク質	PROGEN、ハイデルベルク、ドイツ	640823	ウェス試薬
AAV2 VP2、組換えタンパク質	PROGEN、ハイデルベルク、ドイツ	640824	ウェス試薬
AAV2 VP3、組換えタンパク質	PROGEN、ハイデルベルク、ドイツ	640825	ウェス試薬
AAV2 Xpress ELISA	PROGEN、ハイデルベルク、ドイツ	PRAAV2XP	HT樹脂精製サンプルに使用します。
Wes用アンチマウス検出モジュール	BioTechne、ミネソタ州ミネアポリス、米国	DM-002	自動ウェスタンブロットキット
アッセイ/テンプレート固有のフォワードプライマー	習慣	習慣	ddPCR/dPCRの
アッセイ/テンプレート固有のプローブ	習慣	習慣	ddPCR/dPCRの
アッセイ/テンプレート固有のリバースプライマー	習慣	習慣	ddPCR/dPCRの
BalanCD HEK293 - 液体	FUJIFILM IRVINE SCIENTIFIC INC.、カリフォルニア州サンタアナ、アメリカ合衆国	NC1192689	浮遊細胞培養用培地
ウシ血清アルブミン	SERVA電気泳動、ハイデルベルク、ドイツ	cウシ血清アルブミン	接着細胞培地のサプリメント
通気性レーヨンフィルム、滅菌	VWR International LLC、米国ペンシルベニア州ラドナー	391-1262	懸濁培養装置
C1000サーモサイクラー	Bio-Rad Laboratories、ヘラクレス、米国	1851096	ddPCRの
CaptureSelec AAVX リガンドリーク ELISA キット	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、米国	8113522000	ELISAの
Cedex HiRes アナライザー	Roche Holding AG、バーゼル、スイス	5650216001	セルカウンター
CELL培養マイクロプレート、96ウェル	Greiner Bio-One、クレムスムünster, オーストリア	655162	アデヒーレント細胞培養装置
クエン酸	Sigma-Aldrich, セントルイス, ミズーリ州, アメリカ合衆国	5949-29-1	精製試薬;注意
CMOSベースのTEMカメラTVIPS XF416	Tietz Video and Image Processing Systems GmbH、ギルチング、ドイツ	XF416	映像・画像処理システム
コンパスソフトウェア(バージョン6.3.0)	BioTechne、ミネソタ州ミネアポリス、米国		WESソフトウェア
Costar 6ウェルクリアTC処理マルチウェルプレート	コーニング、ニューヨーク、ニューヨーク、アメリカ合衆国	3516	アデヒーレント細胞培養装置
ddPCR液滴発生器オイル	Bio-Rad Laboratories、ヘラクレス、米国	#1864110	ddPCR試薬
ddPCR液滴リーダーオイル	Bio-Rad Laboratories、ヘラクレス、米国	#1863004	ddPCR試薬
プローブ用ddPCRスーパーミックス(dUTPなし)	Bio-Rad Laboratories、ヘラクレス、米国	#1863023	ddPCR試薬
DMEM, 高グルコース	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、米国	11960044	接着細胞培養用培地
DMEM, 低グルコース	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、米国	11885084	接着細胞培養用培地
DNA低結合96ウェルプレート	エッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ	30129504	ddPCR/dPCRの
DNA低結合チューブ	エッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ	30108051	ddPCR/dPCRの
DPBSの	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、米国	14190094	洗浄バッファー
EMグリッド(T600H-Cu 698 l/インチ、六角メッシュ、薄いバー;EMS)	電子顕微鏡科学、ハットフィールド、ペンシルベニア州、米国	FFTH600-Cu-UL	電子顕微鏡分析
EVO M5000イメージングシステム	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、米国	AMF5000	形質導入アッセイ用ライブイメージング顕微鏡
EZスタンダードパック3	BioTechne、ミネソタ州ミネアポリス、米国	PS-ST03EZ-8	自動ウェスタンブロットキット
Falcon 15mL コニカル遠心分離管	Fisher Scientific、Schwerte、ドイツ	11507411	サンプル処理
Falcon 50mL コニカル遠心分離管	Fisher Scientific、Schwerte、ドイツ	10203001	サンプル処理
Geltrex LDEV フリー低成長因子基底膜マトリックス	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、米国	A1413201	培養プレートコーティング
グルタMAXサプリメント(L-アラニル-L-グルタミン)	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、米国	35050061	接着細胞培地のサプリメント
HEK293A	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、米国	R70507	形質導入アッセイ(研究用のみ)
HEK293T	ATCC、米国バージニア州マナサス	CRL-3216	rAAVの生産に使用されるアデヒーレント細胞培養(研究用のみ)
HEPES溶液、1M	Merck、ダルムシュタット、ドイツ	#H0887	接着細胞培地のサプリメント
HL-Salt 活性ヌクレアーゼ、SAN (25 U/µL)	ArcticZymes Technologies, Tromsø, ノルウェー	70910-202	ddPCR/dPCRの
HydroSpeed マイクロプレート洗浄機	テカン、Männedorf, スイス	30190101	ELISAの
iCellアストロサイトキット、01434	富士フイルムセルラーダイナミクス株式会社、米国ウィスコンシン州マディソン	R1092	形質導入アッセイ
iCellモーターニューロンキット、01279	富士フイルムセルラーダイナミクス株式会社、米国ウィスコンシン州マディソン	R1051	形質導入アッセイ
インフィニット 200 プロ	テカン、Männedorf, スイス	30213617	ELISAの
JEM-1400Plusは透過型電子顕微鏡です	日本電子株式会社、昭島、東京、日本	JEM-1400プラス	透過型電子顕微鏡
ピン付き低蒸発サンドイッチカバー	Enzyscreen、Heemstede、オランダ	CR1224c型	懸濁培養装置
マイクロプレートリーダー スペクトラマックスi3	Molecular Devices、サンノゼ、カリフォルニア州、米国	i3x(アイ3倍)	ELISAの
マウスanit-AAV2 VP1/VP2/VP3モノクローナル抗体	PROGEN、ハイデルベルク、ドイツ	690058	ウェス試薬
ヌクレアーゼフリー水	Roche Diagnostics GmbH、マンハイム、ドイツ	3036430103	ddPCR/dPCRの
Opti-MEM、還元血清培地	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、米国	#31985070	PEI-DNA複合体形成用培地
PBS	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、米国	#10010023	洗浄バッファー
PEI-MAX、ポリエチレンイミン、1mg/mlストック	ポリサイエンスヨーロッパ、 Hirschberg an der Bergstraße, ドイツ	24765または24765	トランスフェクション試薬
ペイプロ	Polyplus、Illkirch-Graffenstaden、フランス	101000033/10mL	トランスフェクション試薬
Pierceマイクロダイアリシスプレート、96ウェル、0.3mL、20K MWCO	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、米国	A50472	浄化装置
ポロキサマー 188	Sigma-Aldrich, セントルイス, ミズーリ州, アメリカ合衆国	P5556-100mL	細胞培養試薬;注意
ポリ-L-オルニチン溶液(0.01%)	シグマ・アルドリッチ	A-004-M	形質導入アッセイ
プロテイナーゼK溶液(20 mg / mL)	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、米国	25530049	ddPCR/dPCRの
プロテインシンプル」ウェス」	BioTechne、ミネソタ州ミネアポリス、米国	004-600	自動ウェスタンブロット用装置
QIAcuity Eightプラットフォームシステム	Qiagen, Hilden, ドイツ	911052	dPCRの
QIAcuity ナノプレート 8.5k 96 ウェル	Qiagen, Hilden, ドイツ	250021	ddPCR/dPCRの
QIAcuity プローブ PCR キット	Qiagen, Hilden, ドイツ	250101、250102、または250103	ddPCR/dPCRの
QIAcuityソフトウェアスイート1.2	Qiagen, Hilden, ドイツ		dPCRソフトウェア
QXマネージャー	Bio-Rad Laboratories、ヘラクレス、米国		ddPCRソフトウェア
QX200 液滴リーダー	Bio-Rad Laboratories、ヘラクレス、米国	1864003	ddPCRの
スクリューキャップマイクロチューブ、1.5ml、PCR性能試験済み	サルシュテット、Nümbrecht, ドイツ	72.703.416	懸濁培養装置
スクリューキャップ、DNA LoBind、5.0 mL	エッペンドルフ、ハンブルク、ドイツ	30122348	懸濁培養装置
シェーカーインキュベーター	Infors AG、ボトミンゲン、スイス	マルチトロン	懸濁培養装置
ピルビン酸ナトリウム(100 mM)	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、米国	11360070	接着細胞培養用培地
ソニケーターマイクロプレートホーンシステム	QSonica、ニュータウン、コネチカット州、米国	Q700MPXC	粗ライセート生成に使用される超音波処理器
魂			SPIRITデータベースへのリンク:https://spirit.cladiac.com/aav.html
Steriflip-GP 滅菌遠心分離機チューブトップフィルターユニット	Merck Millipore、米国マサチューセッツ州バーリントン	SCGP00525	緩衝液調製装置
T-175、細胞培養フラスコ、550 ML、175 CM²	Greiner Bio-One、クレムスムünster, オーストリア	660175	アデヒーレント細胞培養装置
トリプシン/EDTA 0.025%	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、米国	R001100	細胞培養試薬
ウイルス産生細胞 2.0 (VPC2.0)	サーモフィッシャーサイエンティフィック、ウォルサム、米国	A49784 または A51218	rAAV生産
		J63596です。K2	作業溶液PBSTを1:10に希釈します