急性呼吸困難症候群に備えたアンカー依存性間質細胞のマイクロバイオリアクター生成

Summary

アンカーレッジ依存性細胞のマイクロキャリア・マイクロバイオリアクター生成に関するプロトコルが、細胞ベースの治療法として説明されています。急性呼吸困難症候群のユースケースを対象にした例、フラスコベースのプロセス条件に比べて細胞収量の比較および遺伝子発現が良好であることを示しています。このプロトコルは、他のアンカージュ依存細胞や標的適応症にも拡張可能です。

Abstract

細胞ベースの治療は、さまざまな健康状態に対する新たな治療アプローチです。しかし、十分な量の高品質セルを生産することは依然として活発な科学的・技術的課題です。最終的な細胞生成物は滅菌できません。したがって、無菌性と設計による品質の考慮が最も重要です。アンカー依存の細胞においては、フラスコベースの拡張は依然として開発および産業規模で利用されており、大きな物理的フットプリントを必要とし、生化学環境(pH、_CO2 および_O2、栄養素や代謝物の拡散勾配)の制御を制限し、最終細胞の品質に影響を与える物理的な手がかりを提供します。これらの課題がバイオリアクターベースの製造手法の採用を促しましたが、これらの手法は通常、体積規模で進められ、探索的なベンチトップ研究やプロセス開発にはコストがかかる課題が生じます。マイクロバイオリアクターとマイクロキャリア細胞療法の生産は、細胞源タイプのテストケースである間質質細胞の培養中の生化学的制御に役立つと報告されています。 in vitroでの細胞質の初期評価において、急性呼吸困難症候群が潜在的なユースケースとして検討されました。ここに示すアプローチは、マイクロバイオリアクター内の小容量(2 mL)と厳密な生化学的制御により、ベンチトップスケールでの迅速なプロセス開発を可能にします。間葉質質細胞のようなアンカー依存細胞タイプに対してこれを実現するには、マイクロバイオリアクタープロセスの大幅な改良が必要であり、マイクロ流体プロセスで社内で製造されたゼラチンマイクロキャリアプラットフォームを使用しました。ここでは、このようなアンカレッジ依存細胞をマイクロバイオリアクターで培養するための方法とプロセスパラメータについてさらに詳細を示し、他の研究者が自身のユースケースや細胞源タイプにこれらの手法を適応できるようにしています。

Introduction

生細胞を治療製品として利用することは、最近、いくつかの健康課題に対する有望な新しい治療選択肢として浮上しています。例えば、キメラ抗原受容体(CAR)T細胞は、これまでの治療法に抵抗性だった白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫といわゆる液体がん患者に持続的な寛解をもたらしました^。より最近では、間葉系幹細胞/間質細胞(MSC)製品(Ryoncil)が、ステロイド難治性急性移植片対宿主疾患(SR-aGvHD)の子ども治療に承認されました^。この疾患は死亡率が50%>2。しかし、他の未充足の臨床ニーズへの拡張には、治療法とその製品を開発・製造する手段の両方の集中的な開発が必要です。

そのような未充足の臨床的ニーズの一つが、急性呼吸困難症候群(ARDS)に苦しむ人々に見られます。ここでは、ARDSを特定のユースケースとして説明し、方法、結果、そして他の疾患標的への拡張の可能性について説明します。ARDSは、数時間から数日単位で進行し、米国では年間20万人の感染者>発生率が高く、致死率も27%〜46%(発症の重症度による)であり、COVID-19パンデミック中にSARS-CoV-2感染患者の典型的な死因メカニズムとして再び広く注目を集めました ^3,4.ARDSは肺血管透過性の増加を特徴とし、間質性浮腫、肺泡の洪水、好中球や赤血球を含む細胞成分の肺胞区画⁵への浸潤を引き起こします。ARDSの初期滲出期では、先天免疫細胞介在炎症が内皮および上皮バリアの完全性を損ない、炎症性サイトカインの分泌を通じて免疫細胞の募集と活性化を促進することで、これらの病原性結果を引き起こします。炎症反応の成功した解決、バリアの健全性の修復、過剰な線維化の回避は生存に不可欠です^。レムデシビルのような抗ウイルス療法はSARS-CoV-2介在性ARDSとの闘いに有望を示している一方で、他の病因については、現在、死亡率を低減する承認された薬理学的介入は存在^{しない5。}

MSCは全身注射時の肺特異的嗜好性や、周囲の微小環境に免疫調節性パラクリンシグナルを分泌する能力から、ARDS治療に有望なアプローチを提供する可能性があります^6,7。機構的研究では、インターロイキン-10(IL-10)⁸、インドレアミン2,3-ジオキシゲナーゼ1(IDO1)⁹、プロスタグランジンE2(PGE2)¹⁰などのパラクリン因子の発現が、急性肺損傷(ALI)/ARDS11を含む複数の適応症におけるMSC治療効力の推定要因に関与していることが示唆されています。したがって、これらの遺伝子産物の発現レベルは臨床的有効性を予測する可能性のある重要な品質特性(pCQA)となり、製造時の最終細胞製品の放出基準の適用可能となります。しかし、効果的な治療用量に達するために十分な細胞を産生することは困難です。例えばリョンシルは、患者質量の1kgあたり2×10⁶細胞を2回投与し、週2回、4週間¹²分の投与に適応されています。80kgの患者の場合、1回の治療で12億個のMSCを>に相当し、この2次元成長条件に十分な表面積を収容するには大きな物理的フットプリントが必要です。この生細胞製品は患者投与前に滅菌することは細胞の治療効果を損なう可能性があるため、現在の適正製造基準(GMP)を活用して無菌状態で生産することが極めて重要であり、細胞製造の物流的複雑さを増し、結果として商品コストも高まります¹³。

さらに、過去の研究では、組織培養ポリスチレンフラスコ(TCPS)フラスコにおける典型的なMSC産生が集団内の表現型異質性の発生に寄与することが示されています。一部の最終用途では、研究や臨床翻訳においてバッチ間の品質管理が困難になること^{もあります。}TCPSフラスコに含まれる生化学的制御が限られていること、例えばガス、栄養素、代謝廃棄物の拡散勾配、pH調節の不備などがこれらの課題に寄与していると推測されています。

これらの課題は、制御された三次元成長フォーマットで利用可能な優れた生化学的調節と細胞密度を活用するためにバイオリアクターベースの培養の採用を促^{しています。}しかし、バイオリアクターベースのプロセスや製造には独自の課題があります。錨固依存の細胞タイプであるMSCは、バイオリアクター内で成長するための何らかの基質を必要とし、マイクロキャリアの追加が必要です。さらに、市販の多くのバイオリアクターは、細胞品質の測定可能な指標の発現に影響を与える未知のプロセスパラメータを特定し、精緻化させるために必要な実験的ベンチトップ研究に>3Lの増殖培地といった膨大な資源集約量で稼働しています。これらの特徴は潜在的クリティカル品質属性(pCQAs⁾と呼ばれます。

Krupczakらは以前、マイクロキャリア-マイクロバイオリアクターアプローチを報告し、ARDSに対してpCQA発現が改善されたMSCを生成しましたが、 これはin vitro 評価に限定されています²⁰。このアプローチは、社内で製造された溶解性ゼラチンマイクロキャリアプラットフォームと、市販されているマイクロバイオリアクタープラットフォームであるMobius Breezマイクロバイオリア^クター21を組み合わせたものです。このマイクロバイオリアクターは2 mLの使い捨てリアクターチャンバーを使用し、温度、pH、_CO2、_O2 の調節など、動的に混合された閉ループの灌流供給システムで生化学的制御を改善する多くの望ましい機能を備えていますが、MSCのようなアンカレッジ依存細胞を念頭に置いて設計されていません。実際、原子炉内容物を注入する標準的なマイクロ流体チャネルはマイクロキャリアの通過を許すには小さすぎ、このプラットフォームでのMSC生産に成功させるためには大幅な適応が必要です。

ここでは、このマイクロバイオリアクターをMSCのアンカーレッジ依存培養に適応させるための詳細なプロトコルを説明し示しています。ここに報告されたプロセスパラメータは、ARDSの治療効果の前臨床試験体(in vitro)評価のためのMSCのプロセス開発および製造に参考となる意図で特定されました。しかし、原理的には、このプロトコルは他のエンドユーザー用途、炎症性や免疫調節に関連する状態、さらには実験台上で強化された生化学的制御が恩恵を受ける可能性のある他のアンカー依存性細胞タイプにも適応可能です。図1は付随するビデオで説明されたプロトコルの概要を示し、図2、図3、図4は主要な結果を示しています。

Protocol

1. 微生物反応器のセットアップと調製

1. 必要な数のマイクロバイオリアクター消耗品の準備
   1. バイオセーフティキャビネット(BSC)がオンで滅菌されていることを確認してください。新しい消耗品を覆うホイルパウチを袋の上部に穴を開けて取り除き、実験終了までホイル袋を保持してください(欠陥の場合に備えロット#の詳細を記録するため)。外側のブリスター包装を開けて、中身の保湿パックを捨てます。外側のブリスターパッケージは捨ててください。
   2. 内部のブリスター包装に70%エタノールをスプレーし、BSCに持ち込みます。内側のブリスター包装を開けて捨ててください。
   3. 滅菌シリンジを使い、プランジャーを取り外し、ノズルを0.22μmの滅菌フィルターに接続します。無滅菌の超純水50mLを注射器の樽に注ぎます。シリンジを待機中の滅菌50 mLチューブにかざし、プランジャーを再びシリンジに挿入し、滅菌されたろ過水を待機中の回収管に注入します。
   4. ボトルラックのボトルLLに繋がっている透明プラスチックキャップを外してください。新しい滅菌50mLシリンジを使い、プランジャーを外してノズルをボトルLLに接続します。滅菌されたろ過水をシリンジのバレルに注ぎ、ボトルLLに注入します。
      注意:ニードルレス接続ポートは製造者の滅菌作業中に引っかかることがあるため、ボトルのシールを破り、中身を確実に注入するためには、注射器を何度も接続・取り外しする必要がある場合があります。あるいは、チューブ溶接機を使って、ソースボトルを溶接可能なチューブに無菌的に接続し、適切なボトルに対応することもできます。
   5. 同じ手順で、ボトルLに非FBS補助の低グルコースDMEM25 mL、無菌PBS25 mL、ボトルRRに8 mLの抗付着洗浄液を充填します。各液体には新しい滅菌シリンジを使いましょう。
   6. この手順を実験に必要なだけ消耗品で繰り返す。
2. この実験で使用される各PODでPOD自己検定を行います。
   注意:自己検査は問題なく完了するはずです。自己テストのコンポーネントが失敗した場合は、続行する前にその失敗に対処してください。
3. 自己検査カセットは光保護された収納袋に移してください。
4. 以下のように消耗品をバイオリアクターに取り付けます。
   1. 消耗品のバルブから緑色のテープを外し、PODに取り付けてください。クランプを再取り付けし、ガスや空気が漏れる音が聞こえないか確認してください。
   2. 白いボトルラックの圧力センサーライン、赤い空気圧ライン、そして消耗品とベースステーション/PODの間に青い真空ラインを接続してください。側面の注入ポートは白いティアドロップクランプでしっかりと閉じていることを確認してください。
   3. ソフトウェアの手順に従って新しい実験を開始してください。これらはオートプライムとキャリブレート機能で締めくくられ、約4〜5時間で一晩稼働可能です。
5. 各ボトルラックにPODの位置をラベル付けし、バイオリアクターから取り出した後にどのPODに戻すべきかを簡単に区別できるようにしましょう。位置を示すには色付きのテープを使ってください:Pod0 = 赤、Pod1 = オレンジ、Pod2 = 黄色、Pod3 = 緑。実験の名前と日付をテープに書き込め。
6. 消耗品は一晩キャリブレーションさせておきましょう。メディアが反応器に入り、廃棄管に排出されるようにしてください。
7. 液体窒素で保存するセルを使う場合は、凍結保存から24時間>回復できるように解凍・メッキを施してください。

2. 再調整およびマイクロキャリア準備

1. 自動プライマーやキャリブレーションの手順が無事に完了していることを確認してください。
   1. キャリブレーションがうまく完了しない場合は、根本原因を特定し修正し、再キャリブレーションを試みてください。よくある問題には、白いボトルラッククランプを外さないこと、PODに入れる前に消耗品から緑色のテープを外さないこと、メディアボトル内のメディア容量不足などがあります。
2. 溶存酸素センサーが安定していることを確認してください。
   1. キャリブレーション後、消耗品の約10%がDOセンサーでセンサードリフトを示します。推奨される修正措置として、完全な校正を再実行してください。必要に応じて、以下のいずれかを行います。
      1. カセット内に空気がないことを確認し、コントロールを表示するために「 表示プロット 」のチェックボックスを外し、「 自動キャリブレーションDO」と「pH」をクリックします。
         1. 再校正が必要な時に原子炉内に空気が存在していた場合は、該当するPODのウィンドウ左上にある 青い左矢印 をクリックしてMBSダッシュボードの最初のページに戻ります。 手動操作を開始するためにボタン をクリックしてください。 廃棄物チューブ準備済み ボックスにチェックを入れ、テキスト入力欄にWを入力して廃棄物ボトルを選択してください。イ ジェクトウォッシュ ボタンをクリックし、ポップアップウィンドウで「はい」をクリックしてください。これにより、原子炉チャンバーを空にし、メディアソースボトルからメディアを補充します。
3. 各条件ごとに1つずつ、15mL円錐形チューブ内に適切な数のマイクロキャリアを準備します。
   注意:マイクロキャリア数、集合表面積、セルシーディング密度は用途によって異なります。このプロトコルでは、T75フラスコと比較して75 cm^² の利用可能なマイクロキャリア成長面積を得るために、絶対数のマイクロキャリアを注入することが推奨されます。
4. マイクロキャリアがチューブ内に定着するのを待つこと。マイクロキャリアを除去せずにできるだけ多くの上清を吸引し、細胞や新鮮な培地のためのスペースを確保します。

3. セルおよびマイクロキャリア注入

1. オートプライムやキャリブレート機能が正常に完了していることを確認してください。
2. 標準的な懸濁セルのワークフローに従ってリアクターに接種されているかのように、ソフトウェアウィンドウをクリックしてください。
3. この段階で細胞の注入が行われていないことを示すポップアップウィンドウにメモを入れてください。
4. 手動操作でリアクター混合を一時停止し、ボトルラックラインに白いCクランプを追加してください。
5. 消耗品を一つずつ取り除き、BSCに転送してください。廃液や灌流ボトルから使用済みメディアを取り出し、廃棄します。
   1. 研究中に調整された培地を採取する予定がある場合は、大きな灌流ボトルおよびその中の小さな1.5 mLチューブからすべての廃棄物を必ず除去してください。
6. Lボトルから血清補助されていない成長培地を取り出し、捨ててください。Lボトルは滅菌PBSを~20mLですすいで捨てます。Lボトルに25mLの血清補充増殖培地を加えます。
7. 消耗品をそれぞれのPODに戻してください。実験の残りの期間、メディアソースのボトルを氷に保管してください。毎日氷を補充しましょう。
   注意:ウェットアイスは冷凍パックで補うと温度管理の時間を延長できます。
8. 原子炉をPBSで洗浄し、配管をフラッシュしてください。
   1. ボトルの フラッシュ ボタンをクリックし、ボトルLの ラジオ ボタンを有効にし、「 Output to Waste」を選択し、「 MSCセラムのフラッシュ開始」をクリックしてください。
      注:これにより、新たに追加されたhMSCメディアがラインを通過し、FBS補完されていないメディアがこれ以上原子炉に入らないようにします。
   2. 再度 ボトルのフラッシュ ボタンをクリックし、ボトルRRの ラジオ ボタンを選択してフラッシュを開始します。これにより、接着防止洗浄液がライン内に流れ込み、反応器への投入準備が整うようになります。
   3. ボトルの内容ウィンドウで、ソフトウェア内でMSCserumが実際にはPBSを含むBottle Rに位置していることを示せます。
   4. 手動操作に切り替えて、廃棄物ボトルに3回の排出・洗浄サイクルを実行します。
9. 反応器に接着防止洗浄液を加えます。
   1. ボトルの内容ウィンドウに戻り、MSCserumがBottle RRにあることを示してください。そこには実際に付着防止洗浄液が含まれています。
   2. 手動操作に切り替えて、廃棄物ボトルに1回排出・洗浄サイクルを行ってください。
      注:以前のPBSウォッシュは、DMEM内の部品がアンチアミランスウォッシュに干渉するのを防ぐためのものでした。リアクターは微量PBSを含む付着防止洗浄液で満たされているはずです。
10. 30分経過してアンチアタッチメント溶液が残ったら、PBSで消耗品をすすぎます。
    1. ボトルの内容ウィンドウで、ソフトウェア内でMSCserumが実際にはPBSを含むBottle Rに位置していることを示せます。
    2. 手動操作に切り替えて、廃棄物ボトルに3回の排出・洗浄サイクルを実行します。
    3. ボトルの内容ウィンドウに戻り、ソフトウェア内でMSCserumがボトルLに位置していることを指定してください。LにはhMSCメディアが含まれています。
11. リアクターを空にしてセルとマイクロキャリアの注入を待つ。手動操作パネルで「 再接種」 をクリックし、ダッシュボードが反応器への接種を指示する段階のままシステムをそのままにしてください。
    注:ここでの接種とは、マイクロバイオリアクター内での増殖を目的とした細胞の注入を単純に意味します。
12. 追加の抵抗器を加えて、デフォルトのR0抵抗に合わせて混合速度を調整します。
13. フラスコから細胞を取り出し、血液細胞計で数えます。無菌性を確保するために、すべてのオープン手術をBSC内で行ってください。
    1. 培地を吸引し、その後5〜10mLの予温されたPBSで洗浄します。PBSを吸引し、フラスコに5mLのトリプシン+EDTAを加えます。
    2. 37°Cで5分間、またはすべての細胞がフラスコ表面から目に見えて浮かぶまで培養します。
    3. トリプシン活性を中和するために、予熱したhMSC培地10mLを加えます。液体の内容物を取り出し、15mLの遠心分離機チューブに入れます。
    4. 細胞を300 x g で5分間遠心分離します。上澄液を廃棄し、細胞ペレットを適切な量のhMSC培地に再懸浮させてカウントします。完全にコンフルエントなT75フラスコの場合、適切な体積は通常2〜4 mLであり、これにより細胞濃度は1 mLあたり~1〜2E6個となります。
    5. 再懸濁細胞のサンプルに同量のTrypan Blue生存性染料を混ぜ、混合液をヘモサイトメーターに投与してカウントします。メーカーの指示に従ってセル数を数えてください。
14. 15万細胞に達するために必要な細胞溶液の体積を計算し、その量を各条件に対応したマイクロキャリアを含む待機中の15 mL円錐形チューブにピペット移入します。チューブ内の容量を2.2〜2.5mLにして、新鮮で温かいhMSC培地を補充してください。
    注意:各15 mL円錐形の体積は2 mLよりやや大きくし、注入時に気泡を避けるためにやや過充填状態になるようにし、気泡は後の工程で均等化されます。
15. 適切な細胞量をT75フラスコのコントロールに加えます。
16. 一度に1〜2つの消耗品を扱い、消耗品をPODから取り出してBSCに持ち込みます。
17. 5mLのシリンジで緑色の4インチ鈍針を使って細胞とマイクロキャリアを抽出します。細胞とマイクロキャリアをリアクターに注入してください。
18. 消耗品を基地局に戻し、すべての消耗品が注入されるまで繰り返します。
19. ソフトウェアウィンドウをクリックして、接種が完了したことを示します。ソフトウェアが通常のホームページに戻ったら、消耗品出力ラインから白いクランプを外します。
20. 手動操作を入力し、排出ポートをPに設定してEjectExcess機能を実行します。静的ミキシングモードを起動し、1680秒オン、120秒オフします。静的ミキシングのときはミキシング周波数を5Hzに保ちましょう。
21. 光学密度の基準測定をオフにしてください。
    1. MBSクライアントを開き、「 接続」をクリックします。引用符に含まれる次のコマンドを入力してください:「 dmem_write 0,1,2,3 F_measure_ODref_skip 1」
    2. 送信をクリックし、コマンドが正常送信された確認を待ち、MBSクライアントを閉じます。
22. 24時間後に静的ミキシングモードを無効にし、通常のミキシングを再度有効にしてください。ミキシング周波数を1.5Hzに下げます。

4. 微生物反応器の運転

1. マイクロバイオリアクターを毎日監視し、実験に支障が出ないか確認してください。メディアソースのボトルが>5mLのメディアを保持していることを確認し、問題なくリアクターを正常に灌流してください。
2. メディアソースボトルの温度管理を維持するために、必要に応じてアイスバケツを交換してください。光を遮るドレープをマイクロバイオリアクターの前面にかけて、揮発性媒体成分の光による劣化を防ぎます。
3. 気泡が原子炉に入らないように注意してください。TCPSフラスコ制御のメディアを定期的に変更することを忘れないでください。

5. 微生物反応器収穫

1. BSCが無菌状態で稼働可能であることを確認しましょう。
   1. 以下の試薬をビーズまたは水浴で37°Cまで温めます:~25mLの温かいhMSC培地、10mLの温かいPBS、収穫に必要な10 mg/mLのプロナーゼ1.5 mL。
2. 収穫用にボトルラックを準備してください。
   1. ソフトウェア内の各PODで手動操作モードを有効にしてください。
   2. 消費性入力ラインは、ラインのクリア部分に沿って白いCクランプでクランプします。
   3. 消耗品をBSCに移してください。廃棄物ボトルの中身を取り出して捨てます。
   4. 廃棄ボトルに約20mLのPBSを流して捨てます。メディアボトルの残量を評価し、必要に応じて新鮮な(冷たい)hMSC培地を補充してください。
      注:ここでは、収穫に必要な3回の排出洗浄サイクルを完了するために> mLの培地が必要です。
   5. 廃水ボトルに~5mLの冷たいhMSC培地を敷いて、採取液を緩和します。
3. マイクロバイオリアクターから細胞を採取しろ。
   1. 1 mLのシリンジを使い、10 mg/mLのプロナーゼを200 μLと、約300〜400 μLの空気をシリンジに吸い込みます。
   2. サイドポートのインジェクションラインキャップを外し、ニードルレスバルブコネクターに70%エタノールをスプレーします。結び目のあるサイドポート注入ラインを固定していたテープを外し、結び目をほどいてください。白い涙滴型クランプを外します。
   3. 1mLのシリンジを接続し、プロナーゼを優しくリアクターに注入します。液体を空気で注入ラインに沿って追いかけ、すべての液体成分が反応器に届くようにします。
   4. ティアドロップクランプを再び装着し、サイドポートの注入ラインのキャップを再度閉めてください。消耗品を元のPODに戻し、すべてのラインを再接続し、白いCクランプを外して混音を再開します。
   5. 廃棄物ボトルとメディアソースボトルは氷の上に保管してください。5分タイマーを始めて、プロナーゼがリアクター内のマイクロキャリアを消化するのを待ちます。
   6. 5分後、マイクロキャリアが分解していないか確認し、反応器内に目に見えないことを確認する。マイクロキャリアがまだ見える場合は、消化のためにさらに1分余裕を設けてください。マイクロキャリアが見えなければ、先に進みます。
   7. 細胞を収穫しろ。手動操作モードを起動し、#サイクル数を3に設定し、出力ポートをW(廃棄)に設定し、「 エジェクトウォッシュ」をクリックします。
   8. 排出洗浄サイクルが終わったら、消耗品をBSCに戻し、10mLまたは20mLのシリンジで廃棄物ボトルの内容物を抽出します。
   9. 廃棄物ボトルの中身を15mLの円錐形遠心分離機チューブに注ぎます。細胞を300 x g で5分間遠心分離し、上清液を吸引し、細胞ペレットの大きさを評価します。
   10. 細胞ペレットを1〜5mLの培養培地またはPBSに再懸浮させ、ヘモサイトメーターで細胞数を数えます。この手順をすべての消耗品で繰り返します。
4. 通常の細胞培養プロトコルでフラスコの状態を採取してください。MSCの典型的なプロトコルは3.13で説明されています。

6. 微生物反応器条件およびフラスコ条件下の細胞を分析し、下流の応用に備えます

注:特徴的な結果を生み出すために用いられた分析手法は以下に簡潔に示され、さらに詳しくはKrupczak, Farruggio, and Van Vliet (2024)²⁰で説明されています。

1. 環境制御:微生物反応器が提供するグラフィカルユーザーインターフェースを用いて、培養期間中に消費品の統合センサーからのデータにアクセスし表示します。これらのデータは、マイクロバイオリアクターに付属するノートパソコンにインストールされたBreez Explorerソフトウェアに提供されています。
2. 細胞収量:上記の通りMSCを採取し、300 x g で5分間ペレットで細胞を投与します。上清液を慎重に除去し、適切な容量のPBSまたはhMSC培地(1〜2 mL)に細胞ペレットを十分に再懸濁させます。再懸濁したセル混合物のサンプルを取り、同じ量のトライパンブルー染料と混ぜます。染色されたサンプル混合物をヘモサイトメーターチップにマイクロピペット移し、自動または手動のヘモサイトメーターで細胞数と生存率を測定します。
3. 以下に説明する2段階逆転写定量ポリメラーゼ連鎖反応による遺伝子発現を確認します。
   1. RNA精製:RNeasyミニキットを使用して、メーカーの指示に従って各サンプルからRNAを分離・精製してください。簡単に言えば、細胞を溶除し、細胞内容物を精製スピンチューブに移し、各バッファーでサンプルを洗浄して、後続のPCRに干渉する可能性のある不要な細胞成分、核酸、タンパク質を除去します。
   2. cDNA変換:高容量逆転写キットとサーマルサイクラーを用いて、製造元の指示に従って精製RNAを補完的なDNA(cDNA)に変換します。要するに、キットの部品を解凍し、サンプル数に合った適切なボリュームでコンポーネントを組み合わせてマスターミックスを作ることです。各PCRプレートのウェルに、精製済みRNAと準備済みマスターミックス(それぞれ10μL)を同量で注入し、各サンプルの同定位置を追跡する注意を怠らない。サーマルサイクラーの製造プロトコルに従って逆転写反応を完了させます。
   3. qPCR:プライマー二量体を回避するエクソンスパンの配列特異的プライマーを使用し、384ウェルのqPCRプレートにフォワードプライマー、リバースプライマー、テンプレートcDNA、ヌクレアーゼフリー水、マスターミックスを適切な量(通常1μL、1μL、7μL、10μL)で装填し、各遺伝子とサンプルごとに複数の技術的複製ウェルを使用します。必要なら複数のプレートに分割して全ての遺伝子ターゲットを捕獲してください。特定の遺伝子ターゲットのサンプルをすべて同じプレートにロードし、プレート間の違いを防ぎ、各プレートに適切なハウスキーピング遺伝子およびノーテンプレートコントロールを備えていることを確認しましょう。適切なqPCRマシンで蛍光強度を測定し、ΔΔCt法を用いて相対定量で遺伝子発現を計算します。

Results

マイクロバイオリアクターにより、約10日間にわたり培養中の環境要因のモニタリングと調整が可能となりました。pH(図2A)、温度(図2B)、溶存酸素(図2C)、二酸化炭素(図2D)などの環境要因は、微生物バイオリアクター条件下で正確に測定・維持されましたが、培養期間中はフラスコ条件下では維持されませんでした。図2A-Dのデータは明確化のために1つのPODからの代表的な結果を示していますが、pH、温度、溶存酸素、二酸化炭素の安定性に関する定量的に類似した観察は、これまでに30件以上の独立した試験で観察されています。pH、温度、溶存酸素、二酸化炭素は、標準的な細胞培養で一般的なフラス...

Discussion

このプロトコルでは、マイクロキャリア・マイクロバイオリアクター方式を用いた細胞の拡大、プライム、収穫方法が記述されています。このプロセスにより、MSCのようなアンカレッジ依存細胞が、従来のTCPSフラスコに比べて優れた生化学的制御下で、ベンチトップスケールで細胞数を増加させることが可能となり、迅速なプロセス開発に適しています。さらに、MSCのマイクロキャリア-マイクロバイオリアクター生成は、ARDS治療において治療効果を高める可能性のあるプライムド細胞表現型をもたらすことが示されています。

バイオリアクターベースのアプローチは、pH、温度、二酸化炭素、溶存酸素などの環境変数を監視・調整する能力など、プロセス開発やセル製造に重要な利点を提供します。これらのパラメータの変動は細胞の収量や表現型に悪影響を及ぼす可能性があるため、これらの機能を持たない培養プラットフォーム(従来のTCPSフラスコを含む)では、品質や量が不安定で予測不能な細胞バッチを生成する可能性があります。しかし、アンカージュ依存細胞培養向けに設計された市...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
接着防止洗浄液	幹細胞技術	7010
バイオセーフティキャビネット
ブリーズ・マイクロバイオリアクター	ミリポーアシグマ
遠心分離機
円錐形チューブ、15 mL
円錐管、50 mL
ダルベッコ改良イーグル 中、低グルコース	ギブコ	11885084
エタノール
胎児用牛血清	ギブコ	A5670701
血球計
実験室用テープ
マイクロキャリア
マイクロ遠心分離機チューブ、1.5 mL
顕微鏡
針、ブラント、4インチ、18ゲージ	アマゾン	B0D663ZR6D
リン酸塩緩衝生理食塩水	コーニング	21-040-CM
ストレプトマイセス・グリセウス由来のプロナーゼ	ミリポーアシグマ	10165921001
血清学的ピペット、10 mL	VWR	75816-100
無菌脱イオン水
シリンジフィルター、0.22 um、滅菌	セルトリート・サイエンティフィック・プロダクツ	229762
注射器、1 mL	BD	309628
注射器、20mL	BD	302830
注射器、5mL	BD	309646
注射器、50mL	BD	309653
組織培養ポリスチレンフラスコ、T75	サーモフィッシャー・サイエンティフィック	130190
トライパン・ブルー	シグマ・オルドリッチ	T8154-100ML