SNAI2およびMiR-200c-3pを介したLncRNA MALAT1 による卵巣癌における上皮間葉転換の調節

サマリー

このプロトコルは、miR-200c-3p/SNAI2 軸の調節を通じて、上皮性卵巣癌における上皮間葉系移行の促進における MALAT1 の役割を評価する方法を説明しています。

要約

長い非コード RNA MALAT1 は、miRNA 調節を含む競合する内因性 RNA (ceRNA) メカニズムを通じて、上皮性卵巣癌 (EOC) の上皮間葉転換 (EMT) と転移を調節します。本研究は、 MALAT1 がmiR-200c-3pおよびSNAI2との相互作用を介してEMTおよび転移挙動に影響を与える分子経路を解明することを目的とした。 MALAT1 発現は、EOC 細胞株 SK-OV-3 で過剰発現またはノックダウンのいずれかによって遺伝的に操作されました。EMT 関連のタンパク質レベル、細胞遊走、および浸潤に対する機能的影響は、それぞれウェスタンブロッティング、創傷治癒、およびトランスウェルアッセイを使用して評価されました。バイオインフォマティクス解析により、MIR-200c-3pが MALAT1 およびSNAI2の共通標的であることが特定されました。 MALAT1/miR-200c-3p/SNAI2軸は、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイと免疫蛍光染色によってさらに検証され、直接的な分子相互作用が確認されました。 MALAT1 の過剰発現は、SK-OV-3細胞遊走を20%、浸潤を5%増強し、SNAI2発現の有意な増加を伴いました(P < 0.01)。逆に、 MALAT1 ノックダウンはこれらの表現型を抑制しました。デュアルルシフェラーゼアッセイにより、miR-200c-3pが MALAT1 とSNAI2の両方に直接結合することが確認されました(P < 0.001)。miR-200c-3p 過剰発現は、SNAI2 をダウンレギュレートすることにより MALAT1 駆動 EMT を減少させましたが (P < 0.05)、SNAI2 を回復させると、転移に対する MALAT1 サイレンシングの阻害効果が逆転しました。このプロトコルは、 MALAT1 が miR-200c-3p を隔離する ceRNA として機能することにより、EOC における EMT と転移を促進し、SNAI2 の抑制解除につながることを示しています。この発見は、新しいメカニズムの洞察を提供し、 MALAT1/miR-200c-3p/SNAI2 軸を卵巣がん転移を阻害する潜在的な治療標的として特定しました。

概要

卵巣がん (OvCa) は非常に潜行性で診断が遅れた悪性腫瘍です。通常、後期に到達するまで無症候性に進行し、主に腹腔内での積極的な成長を特徴とします。この病理学的プロセスは通常、腹水、治療反応性の低下、および予後不良を伴います¹。2018年の疫学統計では、世界中で約29万5,000人が新たに診断され、18万5,000件の死亡が明らかになり、疾病負担の持続的な増加傾向を反映^{している2。}最新の治療プロトコルには外科的介入と薬理学的レジメンが組み込まれていますが、転移や治療抵抗性と組み合わされた早期発見の持続的な制限により、長期生存率は 45^{% 未満}に維持されています3。12〜18か月以内の再発は、進行^性疾患の多くの患者で一般的に観察されます4。これらの臨床現実は、臨床的に関連する診断マーカーと治療モニタリング戦略を特定する緊急の必要性を強調しています。したがって、臨床的に関連する診断マーカーを特定するのに役立ちます。

現在、研究者らは、ヒトゲノムのかなりの割合が長いノンコーディングRNA(lncRNA^{)を生成する}ことを発見しました5。LncRNAはタンパク質をコードせず、RNAの形でのみ存在し、細胞のさまざまな生物学的機能において調節的な役割を果たします。LncRNAは非保存性を示し、組織特異的な発現パターンを示します⁶。特に、lncRNAの特異的な過剰発現が複数の癌組織で観察されています⁷。競合する内因性RNA(ceRNA)メカニズムは、RNA相互作用の新しいモードを明らかにしました。マイクロRNA(miRNA)は、mRNAの3'非翻訳領域(UTR)との配列特異的相互作用を通じて遺伝子をサイレンシングできることは十分に確立されています。一方、ノンコーディングRNA(ncRNA)はmiRNAに競合的に結合し、それによって標的遺伝子に付着する能力を妨げ、遺伝子発現に影響を与え^ます8。ceRNAメカニズムは、現在、lncRNAの調節的役割について最も広く受け入れられている仮説です。コード転写産物、miRNA、および制御RNA間の三者クロストークは、腫瘍の開始と進行に影響を与える複雑な分子ネットワークを構築します⁹。

非小細胞肺がん転移で最初に同定された MALAT1 は、多くの悪性腫瘍で広く過剰発現する lncRNA として出現しました¹⁰。以前の研究では、OvCa 病期分類¹¹ に直接関連する OvCa 組織における MALAT1 の発現の増加を特定しました。ここでは、上皮OvCa(EOC)細胞株SK-OV-3におけるMALAT1発現を遺伝的に調節するプロトコルを提示し、qPCR、ウェスタンブロッティング、デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ、創傷治癒アッセイやトランスウェルアッセイなどの機能アッセイを介して、上皮間葉転換(EMT)関連タンパク質発現、遊走能力、および侵襲性への影響を評価します。目的は、MALAT1 が miR-200c-3p および SNAI2 との相互作用を通じて EOC における EMT および転移播種を調節する分子メカニズムを解明することです。

lncRNA-miRNA相互作用を研究するための既存の方法では、イン シリコ 予測ツールのみが使用されることが多く、実験的検証が不足している可能性があります。EMT 調節研究では、従来の組織学的方法では詳細な分子的洞察が得られない場合があります。実験的検証にデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイを採用することで、私たちの研究はこれらの制限を克服し、予測された相互作用のより信頼性の高い確認を提供します。さらに、スクラッチ アッセイやトランスウェル アッセイなどの複数の機能アッセイと分子技術を組み合わせることで、細胞レベルと分子レベルの両方で EMT を包括的に理解することができ、単一アッセイ アプローチによって提供される深さを超えます。

プロトコル

細胞培養とトランスフェクション

SK-OV-3ヒトOvCa細胞株を標準条件下で培養した。細胞は、89%マッコイ5A、10%ウシ胎児血清、および1%ペニシリン-ストレプトマイシン溶液を含む培地に、5%CO₂で37°Cの加湿インキュベーターで維持されました。培地を2〜3日ごとに交換し、0.25%トリプシン-EDTAを使用して80〜90%のコンフルエンスに達したら細胞を継代しました。 MALAT1 過剰発現および MALAT1 ノックダウン(shRNA)のレンチウイルスコンストラクト、およびmiR-200c-3p模倣、阻害剤、およびネガティブコントロール、およびSNAI2を標的とするsiRNAおよびそれに対応するコントロールsiRNAは、市販の供給源から入手されました。トランスフェクションのために、SK-OV-3細胞を500 μLの完全培地に5×10⁴細胞/ウェルの密度で24ウェルプレートに播種し、一晩接着させました。トランスフェクションは、メーカーの指示に従って脂質ベースのトランスフェクション試薬(RRID:AB_2548650)を使用して実行されました。簡単に言うと、核酸(miRNA模倣体/阻害剤またはsiRNA)と脂質ベースのトランスフェクション試薬を還元血清培地で別々に希釈し、5分間インキュベートした後、一緒に混合し、室温でさらに15分間インキュベートして錯体形成を可能にしました。複合体を細胞に滴下添加した。6時間後、培地を新鮮な完全培地と交換した。細胞は、トランスフェクションの24〜48時間後に回収され、下流の分析が行われました。

リアルタイム蛍光定量PCR(qPCR)

製造元の指示に従って、RNA抽出試薬を使用して培養SK-OV-3細胞からトータルRNAを抽出しました。簡単に言うと、細胞を6ウェルプレートのウェルあたり1 mLの試薬で溶解し、提供されたプロトコルに従って市販のRNA抽出キットを使用してRNAを単離しました。RNA濃度と純度は分光光度計を使用して測定され、A₂₆₀/_{A 280} 比が1.8〜2.0のサンプルが下流のアプリケーションに使用されました。逆転写は、RTマスターミックス(RRID:SCR_018597)を20 μLの反応量で500 ngのトータルRNAとともに使用して行いました。熱サイクル条件は、37°Cで15分間、続いて85°Cで5秒間逆転写酵素を不活性化した。得られたcDNAは、使用するまで-20°Cで保存しました。リアルタイムPCRは、市販のmiRNA qRT-PCR検出キットをリアルタイムPCR装置で用いて、定量的リアルタイムPCRを実施しました。各反応は、10 μLの2x qPCRマスターミックス、1 μLの特異的プライマー(フォワードおよびリバース、10 μM)、2 μLのcDNAテンプレート、および7 μLのRNaseフリー水を含む20 μLの容量で実行しました。熱サイクル条件は、95°Cで10分間、その後95°Cで10秒間、60°Cで30秒間の40サイクルでした。製品の特異性を検証するために融解曲線分析を実施しました。発現レベルは、 GAPDH (mRNAの場合)または U6 (miRNAの場合)を内部コントロールとして、ΔΔCt法を使用して計算しました。すべての反応は 3 回に分けて実行され、データは平均値± SD として表示されます。
注:RNA抽出試薬は危険な化学物質です。腐食性があり、皮膚や目に炎症を引き起こす可能性があるため、ドラフト内で取り扱う必要があります。試薬を含む廃棄物は、地域の有害廃棄物処理規制に従って処分する必要があります。

スクラッチアッセイ

SK-OV-3細胞を×5〜10⁴細胞/ウェルの密度で24ウェルプレートに播種し、約90〜100%のコンフルエントに達するまで培養し、均一な単層を形成しました。次に、10 μLの滅菌ピペットチップを使用して、各ウェルの中央にある細胞単層に線状の傷を作成しました。一貫性を確保するために、すべてのウェルでスクラッチ形成中に同じ角度と圧力が加えられました。引っ掻いた後、PBSを加えて、2回の穏やかな洗浄で剥離した細胞を除去しました。次に、増殖の影響を最小限に抑えるために、細胞を無血清のマッコイの5A培地で培養しました。スクラッチ領域の画像は、10倍の倍率で倒立顕微鏡を使用して、すぐに(0時間)、24時間と48時間後に再度キャプチャされました。各時点での引っかき傷の幅は、ImageJ ソフトウェアを使用して測定され、移行率の計算に使用された初期幅と比較した創傷閉鎖の割合が測定されました。

トランスウェルアッセイ

SK-OV-3細胞を、インサートあたり5×10³細胞の密度でTranswellインサートの上部チャンバー(上部チャンバーには200 μLの1%完全培地、下部チャンバーには1 mLの5%完全培地を含む)に播種し、37°C、5%CO₂加湿環境で24時間インキュベートしてからさらに分析しました。24時間インキュベートした後、インサートを取り外し、PBSで3回洗浄し、続いて4%パラホルムアルデヒド(PFA)に15分間固定しました。PBSで洗浄した後、細胞を1%クリスタルバイオレット溶液で染色しました。染色後、細胞をPBSですすぎ、倒立顕微鏡で観察しました。
注:クリスタルバイオレットは生物学的染色であり、摂取したり皮膚に触れたりすると有害になる可能性があります。廃棄物は慎重に取り扱う必要があり、廃棄物は地域の規制に従って適切に処理する必要があります。

デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ

トランスフェクトされた細胞は、溶解前に標準的な培養条件(37°C、5%CO₂加湿環境)で48時間インキュベートされます。48時間のインキュベーション後、細胞を溶解し、5,000 × g で4°Cで5分間遠心分離した。 上清の50 μLアリコートを96ウェルプレートに移し、続いて100 μLのホタルルシフェラーゼ試薬と100 μLのレニラルシフェラーゼ試薬を各ウェルに順次添加しました。ホタルおよびレニラルシフェラーゼ活性は、ルミノメーター上のデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステムを使用して測定されました。レニラルシフェラーゼ活性は、トランスフェクション効率の変動を説明するためにホタルルシフェラーゼ活性に正規化されました。

免疫蛍光アッセイ

SK-OV-3細胞を室温で4%PFAに15分間固定し、PBSで3回洗浄した。非特異的結合をブロックするために、細胞をPBS中の5%ヤギ血清と室温で1時間インキュベートしました。ブロッキング後、細胞をE-カドヘリン(RRID:AB_2833860)、N-カドヘリン(RRID:AB_2837725)、およびビメンチン(RRID:AB_2835318)に対する一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートし、それぞれ1:200で希釈しました。翌日、細胞をPBSで3回洗浄し、適切な蛍光色素結合二次抗体[抗マウスIgG-FITC(RRID:AB_2843438)および抗ウサギIgG-FITC(RRID:AB_2843439)]を暗所で37°Cで1時間希釈してインキュベートした。
注:パラホルムアルデヒドは有毒であり、潜在的な発がん性物質です。手袋やゴーグルなどの適切な個人用保護具 (PPE) を着用して、慎重に取り扱う必要があります。PFAを含む廃棄物は有害廃棄物として処分する必要があります。

統計分析

2 つのグループ間の比較には t 検定を使用し、複数グループ間の比較には ANOVA を適用しました。データは平均±標準偏差として表示されます。統計的有意性は、*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001 に設定されました。すべての実験は、3つの生物学的反復(n = 3)で実施されました。

結果

MALAT1によって調節されるSK‐OV‐3細胞の遊走能力および侵襲能力

実験ワークフローの概要を 図1に示します。OvCa細胞の遊走と浸潤におけるMALAT1の役割を調べるために、SK-OV-3細胞における MALAT1 の発現を調節しました。 MALAT1 のノックダウン時に、qPCR により MALAT1 レベルの有意な抑制が確認されました (p < 0.05; 図2A)。スクラッチアッセイでは、対照と比較して、 MALAT1 ノックダウン時のSK-OV-3細胞の遊走能力が10%低下したことが示されました(p < 0.01;...

ディスカッション

婦人科がんの 5 番目に多い OvCa は、依然として女性の健康にとって大きな懸念事項です²。しかし、ほとんどの症例は進行した段階で特定されるため、効果的な治療選択肢が大幅に制限され、その結果、全生存率の改善は最小限に抑えられます¹²。がん転移は、EOC¹³ における患者死亡率の主な原因として際立っています。新たな証拠は、lncRNAとmiRNAがEOC病因の極めて重要な調節因子であることを示唆しています¹⁴。このうち、lncRNA MALAT-1 および miR-200 は、OvCa ^15,16 を含む腫瘍で異常な発現パターンを示します。しかし、MALAT1がOvCaで発癌活性を示す分子経路はまだ完全には理解されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
0.22 & ミュー;m PVDFメンブレン	ビヨタイム	FFP32
オールインワン miRNA qRT-PCR 検出キット	フレンゲン	QP115
ウシ血清アルブミン	ビヨタイム	ST025
化学発光基質	蘇州海星生物科学有限公司	TCH-C335型
化学発光基質	ミリポール	WBKLS0100
デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイキット	ビヨタイム	RG027
ウシ胎児血清	蘇州海星生物科学有限公司	FBP-C550
ヤギ抗マウスIgG FITC	親近感	S0007
ヤギ抗ウサギ IgG FITC	親近感	S0008
リポフェクタミン 2500	広州英鑫バイオテクノロジー株式会社	SJ-LIP-2500
MALAT1干渉レンチウイルス	上海ジェネケム株式会社	LV-マラト1-sh
MALAT1過剰発現レンチウイルス	上海ジェネケム株式会社	LV-マラト1-OE
マッコイの5A	蘇州海星生物科学有限公司	ガムド-B305
miR-200c-3p模倣品	上海ジェネケム株式会社	マイクHAS-200C-3P
多機能酵素免疫測定装置	パーキン・エルマー	エンビジョン2100
ペニシリン-ストレプトマイシン溶液	蘇州海星生物科学有限公司	グサ-R002
ホスファターゼ阻害剤カクテル	GSbioth	GS1439A
一次抗体E-カドヘリン	親近感	BF0219
一次抗体N-カドヘリン	親近感	AF5239
一次抗体ビメンチン	親近感	AF7013
PrimeScript RTマスターミックス	タカラ	RR036A
リアルタイムPCR検出システム	バイオラッド	CFX96
冷蔵遠心分離機	エッペンドルフ	5810R型
RIPA溶解バッファー	GSbioth	GS504A型
SDS-ポリアクリルアミドゲル	ビヨタイム	P0012A
二次抗体ヤギ抗マウスIgG FITC	親近感	S0007
二次抗体ヤギ抗ウサギIgG FITC	親近感	S0008
SNAI2 siRNA	広州英鑫バイオテクノロジー株式会社	si-has-snail2
StarBaseデータベース	中山大学	http://starbase.sysu.edu.cn
BCAアッセイキット	定国バイオテック	BCA02
細胞培養インキュベーター	ヘレウス	ヘラセル 150
画像解析システム	バイオラッド	ゲルDOC1000
倒立顕微鏡	エムショット	MI152-N
RNA抽出キット	エコトップ	EK-1328-50T
TRIzol試薬	広州英鑫バイオテクノロジー株式会社	T751379
万能電気泳動電源	ウィックスサイエンティフィック	WIX-EP600