研究環境におけるポジティブ強化訓練によるスナネズミの福祉向上

サマリー

クリッカートレーニングは、実験室のスナネズミの積極的な強化技術として機能します。この方法は、正の強化によってストレスを軽減し、ハンドリング効率を向上させ、実験動物の健康に貢献することを目的としています。

要約

ストレスを最小限に抑え、種に適した取り扱いを促進することにより、実験動物の福祉を改善することは、世界中の現代の生物医学研究の中心的な目標です。クリッカートレーニングは、ポジティブ強化トレーニングの広く認識されている形式であり、クリック音を条件付け強化剤として使用して、望ましい行動と報酬の橋渡しを行い、動物がより迅速に、ストレスを軽減しながら学習できるようにします。私たちの研究グループは、クリッカートレーニングがマウスやラットの認知強化の一形態として機能することを以前に実証しました。本研究では、このトレーニングアプローチをモンゴルのスナネズミ(Meriones unguiculatus)に適応させることに成功し、プロトコルをスナネズミの種固有の行動特性に合わせて調整しました。43匹の近交系スナネズミ(メス27匹、オス16匹)のコホートは、標準化された10日間のクリッカートレーニングプロトコルを受け、その間に食料報酬と引き換えに実験者の手に自発的に近づき、相互作用することを学びました。訓練期間の後、動物は、探索行動と人間と動物の相互作用に対する訓練の効果を評価するために、オープンフィールドテストや標準化された人間相互作用テストなどの行動評価を受けました。私たちの調査結果は、スナネズミへのクリッカートレーニングの実施が迅速、効率的、忍容性が高いことを示しています。訓練された動物、特にメスは、実験者の手との自発的な相互作用の増加を示し、不安のような行動の減少を示しました。これらの結果は、種に適応したクリッカートレーニングプロトコルが実験者と動物の間の信頼関係の構築を促進し、最終的にストレスを軽減し、動物福祉と実験結果の信頼性の両方を向上させることができることを示唆しています。

概要

ストレスを軽減し、福祉を改善するために、生物医学研究における動物の使用を改善することは、広く認識されている国際的な目標^です1,2,3。2022年、欧州委員会は、欧州連合(Alures)で使用されている838,539頭の動物のうち、3,440頭^がスナネズミであったと報告しました4。ドイツでは、動物福祉法(TierSchG⁾⁵第7条(2)に基づき、2023年に約146万匹の脊椎動物と頭足類が動物実験に使用された。科学目的で殺された動物と合わせると、2023年にドイツで使用される実験動物の総数は約^210万頭に達しました6。これらの数字は、生物医学研究におけるスナネズミの使用の関連性を強調し、動物福祉のためのプロトコルの継続的な改善の必要性を強調しています。

実験動物の行動ニーズと種固有の福祉をサポートする管理戦略の重要性は、倫理的および科学的実践に不可欠であると広く認識されています⁷。飼育における人間と動物の相互作用は、ハンドラーと動物の間の絆を育むことなく、動物を汚れたケージから清潔なケージに移すという本質的な作業に限定されることがよくあります。この社会的相互作用の欠如はストレスにつながり、動物の行動や生理学に悪影響を及ぼし、最終的には実験結果に影響を与える可能性があります⁸。不適切な取り扱いは、研究データのばらつきのよく知られた原因です⁹。たとえば、マウスの尻尾を持ち上げると不安やストレスが増大しますが、トンネルまたはオープンハンドの方法は自発的なアプローチを促進し、不安のような行動を軽減します^10,11。取り扱いは、グルココルチコイド^{レベル 12} などの生理学的マーカーに対する一貫した影響により、小型哺乳類の研究で標準化された急性ストレッサーとしても使用されています。これらの発見は、短い人間とのやり取りの実質的な影響と、洗練された低ストレス処理技術の必要性を浮き彫りにしています¹³。

トレーニングベースの改良は、動物の幸福と研究の質の両方を向上させるための効果的な方法としてますます認識されています^10,14。動物研究で使用される最も効果的なトレーニング方法の 1 つはクリッカー トレーニングであり、これは多くの場合、食物報酬と組み合わせられます^15,16。過去数十年にわたり、クリッカートレーニングに関する34の研究が発表されており、このトレーニングアプローチに対する科学的関心の高まりを反映しています¹⁷。研究によると、犬(47%)と馬(30%)が最も一般的に訓練された実験動物であり、次に猫、牛、魚、ヤギ、サル(それぞれ3%)が続きます¹⁷。訓練された動物は自発的に処置に参加できるため、ストレスが軽減され、身体的拘束の必要性が最小限に抑えられます¹⁸。

正の強化プロトコルは、小型哺乳類にも適用されています。最近の研究では、飼育手順のためのウサギと行動研究のためのスナネズミの訓練の成功が報告されています^19,20。以前のいくつかの研究では、クリッカーで訓練されたマウスが実験者との接触が増加し、排尿、排便、発声、浮遊行動などのストレスに関連する行動指標が減少することを示しました21,22,23。これは、ウサギ、げっ歯類、フェレットなどの小型哺乳類の訓練が、恐怖反応を軽減し、積極的な強化技術を通じて取り扱いを容易にすることが示されている獣医学分野の調査結果と一致しています²⁴。特に、トレーニングパフォーマンスには性別特異的な違いも観察されました:雌マウスは、トレーニングセッション全体で雄マウスよりも高いモチベーションと高い反応頻度を示しました。これは、雌マウスが標準化された条件下で自発的なトレーニングタスクにより容易に従事する可能性があることを示唆しています²¹。

有望ではありますが、スナネズミの既存のトレーニングアプローチは通常、特定の行動パラダイムに関連付けられており、日常の飼育ルーチンで一般的に使用するようには設計されていません²⁵。モンゴルスナネズミ(Meriones unguiculatus)に広く適用可能な標準化されたプロトコルは、特定の実験セットアップとは無関係に、まだ確立されていません。このギャップに対処するために、本研究は、スナネズミの種固有の特性に合わせた単純なクリッカートレーニングプロトコルを開発し、検証することを目的としていました。このプロトコルは、穏やかな取り扱いと実験者との自発的な関与によるストレスの軽減に焦点を当てています。このアプローチにより、動物福祉が改善され、より一貫した行動ベースラインが確立され、実験結果の信頼性が高まるという仮説を立てています。そのシンプルさと柔軟性により、幅広い実験室環境に容易に導入できます。

提案されたトレーニングプロトコルの有効性と適用可能性を評価するために、次の具体的でテスト可能な予測を策定しました。
訓練されたスナネズミは、10日間の訓練期間内に、実験者の手の上に自発的に座るという、目標の行動を確実に実行します。
訓練された動物は、訓練されていない対照と比較して、標準化されたテストで実験者との自発的な相互作用の増加を示します。
訓練された動物は、特にオープンフィールドテストの中央ゾーンでより多くの時間を過ごすことによって、不安のような行動の軽減と一致する行動指標を示します。
メスのスナネズミは、オスよりも訓練に対して強い行動反応を示す可能性があり、これは人間の相互作用への適応における性差を反映している可能性があります。
これらの予測は、行動評価の設計を導き、プロトコルの評価基準に情報を提供しました。

プロトコル

スナネズミの取り扱いと実験手順は、動物の世話に関するヨーロッパ、国内、および施設のガイドラインに従って実施されました。地方自治体のライセンスG 21-1-100によって承認されています。プロトコルには、10日間のトレーニング(月曜日から金曜日)が含まれ、週末(土曜日と日曜日)の休憩があります。このプロトコルは、特定のニーズに合わせて簡単に適応できます。必要なすべての材料 は、材料表に記載されています。

1.動物の準備

1. 施設の繁殖施設から必要な数の動物を入手します。オープンハウジングシステムで12時間の明暗サイクルで動物を維持します。
2. 生後5週齢で子孫を離乳させます。離乳後の動物に耳タグを付け、ケージごとに2〜3人の同性グループに収容します。
3. すべてのスナネズミをタイプ4ケージ(590 x 380 x 200 mm、1.815 m²)に収容します。各ケージに少なくとも 3 つのトンネルを装備し、木材を噛んで強化します。食料と水を 自由 に提供します( 材料表を参照)。
4. 動物を訓練されたグループ(女性:n = 27、男性:n = 16)と訓練されていないグループ(女性:n = 16、男性:n = 5)にランダムに割り当てて、選択バイアスを最小限に抑え、治療間で同等のベースライン条件を確保します。ステップ2.2で概説したように、繁殖ケージ環境内で動物を食物報酬と実験者の手の両方に慣れさせます。プロトコルの。トレーニング開始時の動物(メスとオス)は生後約8週間でした。

2.動物の慣れ

注:スナネズミが輸送されなかった場合、慣れ時間を短縮できます。プロトコルのグラフィカルな概要を 図 1 に示します。社内飼育動物では、親動物がよく慣れていて、子が動けるようになった時から少なくとも週に1回は手による慣れを続ければ、幼体の馴化期間を大幅に短縮することができます。この準備段階は、ネオフォビアを軽減し、食品の取り扱いに対する前向きな関係を確立し、クリッカーベースのトレーニングへのスムーズな移行を保証するように設計されています。

図1:外部調達および社内飼育動物の慣れおよびトレーニングプロトコルの概要: この図は、外部調達のスナネズミおよび社内飼育のスナネズミに使用される慣れおよびトレーニングプロトコルのタイムラインと主要な手順を概説しています。プロトコルには、初期取り扱い、食物の慣れ、クリッカーの紹介、およびクリッカーのトレーニングが含まれており、動物の起源と曝露前に基づいて調整されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. 第1週:外部から調達された動物の慣れ
   1. 到着したら、スナネズミをケージごとに2〜3匹の同性グループに収容します。順応をサポートするために、輸送ボックスから巣材と寝具材を少量の使い慣れた食品ペレットに加えて追加します。
   2. 各ケージに少なくとも3〜4個のトンネル(段ボールチューブやプラスチックシェルターなど)を提供し、種に典型的な掘削行動を可能にするために、寝具を約8〜10 cmの深さまで満たします。
   3. スナネズミの尻尾を持ち上げるとストレスが生じ、尾が怪我する危険があるため、避けてください²⁶.代わりに、必要に応じてカップ状の取り扱いを使用して動物を穏やかに移します( 図2Aを参照)。
   4. ~5 gのカボチャまたはヒマワリの種を寝具に散らすことにより、すぐに食物ベースの慣れを開始します( 材料表を参照)。これにより、掘ることが促進され、動物が報酬に慣れることができます。
   5. 翌日、~10個の報酬の種を含む片手をケージに2〜3分間入れます。動物が種子を直接摂取しない場合は、~5 gの種子を寝具に入れます。
   6. 動物が手から食べ物を取るまで、この手順を1日1回繰り返します。通常、これには約1週間かかります。先ほど成功した場合は、クリッカートレーニングに進みます(ステップ3を参照)。
   7. 慣れている間は、さまざまな種類の種子を手に与え、2〜3分後に残りの種子を数えて、食べ物の好みを評価します。
      注: 望ましい行動を強化するためのご褒美としてのみ、少量ずつ食べ物を与えてください。餌のご褒美が実験動物の栄養ガイドラインに準拠していることを確認してください。このプロトコルではカボチャとヒマワリの種を使用しますが、施設の衛生要件を満たしている場合は、他の適切な報酬を使用できます。実験動物用に設計された市販のおやつも許容されます。
2. 第1週:社内飼育動物の慣れ
   1. ステップ2.1.3で説明したように、~5 gのカボチャまたはヒマワリの種を寝具に入れることにより、繁殖ケージで直接食物報酬への慣れを開始します。このステップは、報酬に精通しているかどうかを確立するために、分娩前に繁殖ペアから開始する必要があります。
   2. 繁殖動物が寝具から種子を確実に消費したら、ステップ2.1.4で概説した手順に従って、実験者の手から報酬を提供します。動物が毎日2〜3分間自発的に探索し、報酬を受け取ることを許可します。
   3. 女性が出産した後、最低1週間は手による慣れを中断します。この間、露出を維持するために、週に1〜5回、ケージの寝具に直接食べ物の報酬を提供し続けます。
   4. 子犬が可動になったら(産後約18〜21日目)、手による慣れを再開します。動物にセッションごとに2〜3分間報酬付きの手を探索させます。これは、子孫がトレーニングのコンテキストに早期に慣れることをサポートします。
   5. 生後5週間で、幼体を離乳させ、ケージごとに2〜3匹の同性グループに収容します。移送当日に新しいケージ寝具に餌のご褒美を入れて慣れを続けます。
   6. 離乳の翌日に、上記のように手作業によるフードデリバリーを再導入します(ステップ2.1.4および2.1.5)。
   7. 動物が手から食べ物を取るまで、この手順を1日1回繰り返します。
   8. 幼体が一貫して手から報酬を受け取ったら、トレーニングプロトコルに進みます(ステップ3を参照)。通常、約1週間かかります。先ほど成功した場合は、クリッカートレーニングに進みます(ステップ3を参照)。

図2:ポジティブ強化を使用したスナネズミの取り扱いと慣れ。 (A) スナネズミのカップ状の取り扱い: スナネズミは、ストレスを最小限に抑えるために、カップ状に両手で優しくすくいます。(B) トレーニングの開始: 実験者の手をケージの床に置き、手のひらに食べ物のご褒美を置きます。スナネズミは報酬を受け取り、クリックして行動をマークします。(C) スナネズミは自発的に実験者の手の上に座り、訓練が成功したことを示します。食べ物の報酬は目に見えて手のひらに配置されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. クリッカートレーニング

注:スナネズミが実験者の手から餌を受け取った場合にのみトレーニングを開始します。そうでない場合は、手順2.1で説明した期間を超えて食物の慣れ段階を延長します。または2.2。

1. トレーニングの概要
   1. スナネズミ1匹につき1日1回のトレーニングセッションを4分間実施します。ストレスを軽減し、慣れ親しんだ環境を維持するために、動物のホームケージで直接トレーニングを実施します。すべての濃縮アイテムを取り除く必要はありませんが、ケージ内に少なくとも1つのチューブまたはトンネルが残っていること、およびケージの床に実験者の手のための十分なスペースがあることを確認します。
      注意: 理想的には、トレーニングは専用の静かな部屋で実施する必要があります。これが不可能な場合は、環境騒音や妨害への曝露を効果的に軽減する限り、動物施設内の遮音キャビネットを使用できます。
   2. 聴覚の合図が交絡変数にならないように、トレーニングセッション中は口頭でのコミュニケーションや声を厳守してください。動物との声の相互作用は、トレーニングのコンテキスト外の期間に制限します。
   3. トレーニング中の慣れと学習の成功の実際的な指標として、ターゲット行動の繰り返し(例:実験者の手の上に自発的に座る)を使用します。この動作が 3 日間連続してセッションごとに少なくとも 5 回観察された場合は、トレーニングが成功したと見なします (手順 3.4.4 を参照)。
2. トレーニングの準備
   1. 必要な材料をすべて準備します: 報酬としてヒマワリの種を半分に切るか、カボチャの種を 3 等分に切ります。フットクリッカー、カラーキュー(音なし)、またはその他のサイレントタイマー(デジタルまたはアナログ)を使用するタイマーアプリ、およびクリーンなセカンダリケージを提供します( 材料表を参照)。
   2. 環境ストレス要因を最小限に抑えるために、トレーニングが行われる静かで気を散らすことのない場所にホームケージを移動します。スナネズミは聴覚刺激に非常に敏感であるため、セッション中は会話、ドアをバタンと閉める音、機器の音などの突然の大きな騒音は避けてください。
   3. トンネル1つを除くすべての強化アイテムを削除します。残りのトンネルがトレーニングエリアへのアクセスを妨げないようにしてください。手を収容するのに十分なスペースがあることを確認してください。
   4. コンパニオンアニマルを清潔な二次ケージに移し、分離中のストレスを軽減するために少量の家庭用ケージの寝具や濃縮物を敷きます。
   5. フットクリッカー(足で押すとカチッという音を出す機械装置、 材料表を参照)をテーブルまたはトレーニング面の下に置きます。これにより、トレーナーは手を使わずに望ましい動作をマークすることができ、両手を動物と対話できるようにしながら一貫したタイミングを確保できます。
3. トレーニング1〜5日目:クリッカーの紹介
   1. タイマーを開始する: アプリで「開始」をタップするか、サイレントタイマーのボタンを押します。
   2. ケージの前に立ったり座ったりします。選択した種子を5枚手のひらに置き、ケージの片隅にある基質に手を平らに置きます。
   3. スナネズミが手から種を奪う瞬間をクリックします(図2B)。複数のシードが順番に取得されている場合は、それぞれのシードの後をクリックします。クリック音を使用して、食べ物の報酬を手からの餌を与える行動に関連付けます。
   4. 動物が望ましい行動を5回実行したとき、またはタイマーがゼロに達したとき(4分後)にトレーニングを終了します。
   5. 3日目から、スナネズミの行動に応じて、一度に1つずつ種子を提供し始めます。ケージの床のすぐ上に手を置き、動物が伸びるか、前足に短時間接触するように促します(図2C)。これは、行動を徐々に形作るのに役立ち、動物を次のトレーニング段階に備えます(ステップ3.4を参照)。
4. トレーニング6-10日目
   注: オプションのトレーニングのヒント: スナネズミが手に登るのをためらう場合は、タスクを自信を築く小さなステップに分割します。まず、動物が登ることを期待する前に手に触れる行動を強化します。この成形戦略を使用して、ストレスを軽減し、取り扱いに慣れるまでにより多くの時間を必要とする動物をサポートします。
   1. 一度に 1 つのシードのみを提供します。手を基板より少し高く持ち、スナネズミが報酬にアクセスするために手に完全に登るように促します。このステップは、前のシェーピングプロセスに基づいて構築され、最終的なターゲット動作への移行を表します。
   2. スナネズミが一貫して手の上に登ったら、クリックして行動を強化します。中古の手を使って種子を提供し始めます( 図3を参照)。スナネズミがケージの床に完全に登るように、トレーニングハンドをケージの床の上に維持します。片手で親指と人差し指で種子を持ち(図3A)、片手でもう一方の手の手のひらの上に報酬を提示し、動物がその上に登るように促します(図3B)。
   3. スナネズミがセッションごとに自発的に実験者の手の上に 5 回座り、手のひらまたは秒数の手から報酬を受け取るトレーニングの成功を評価します。
   4. 最大 3 週間 (週 5 日) の期間、またはトレーニング目標が連続 3 日間にわたって一貫して実証されたら、トレーニングを終了します。
      注: プロトコルでは最大 3 週間の構造化されたトレーニング フェーズが定義されていますが、特にトレーニングの終了から実験手順の開始までの間に遅延が予想される場合は、必要に応じてこの期間を超えて強化セッションを継続できます。継続的な正の強化は、学習した行動を維持し、長期にわたって信頼性を確保するのに役立ちます。トレーニングフェーズが無事に完了した後も、週に 1 回強化を継続することをお勧めします。ただし、動物間の一貫性と比較可能性を確保するために、実験タスクに移行する前に、ターゲット行動の安定した反復パフォーマンスによって定義される明確なトレーニングエンドポイントを文書化する必要があります。

図3:ご褒美の配達時の手の位置の例。 (A)ご褒美は、動物が手のひらの上に座っている間、同じ手の親指と人差し指の間に保持されます。(B) 報酬は人差し指と人差し指で持ち、動物はもう一方の手の手のひらの上に座ります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. トレーニング後の行動テストの実施(10+日目)

1. 相互作用のテスト
   注:従属変数:一次従属変数は、テストの2分間の動物と実験者の手の間の自発的な相互作用の持続時間です。相互作用は、匂いを嗅ぐ、登る、または前足¹⁰で手に触れるなどの直接的な身体的接触として定義される。行動スコアリングはビデオ録画に基づいており、手動または行動分析ソフトウェアを使用して実行できます。
   1. 相互作用テストが実施されるテーブルの上に、三脚に取り付けられたカメラを配置します。
   2. 動物がグループで飼育されている場合は、ホームケージから一握りの寝具を含む清潔な二次ケージに動物を移します。
   3. ホームケージからすべてのトンネルまたはシェルターを取り外し、清潔なケージに入れます。テストケージ(=ホームケージ)には寝具だけを残します。寝具だけが入っているホームケージをカメラの下に置きます。
   4. カップ状の取り扱いを使用して、試験動物をそっとホームケージに戻します。
   5. 録音を開始します。ケージの前で1分間じっとしています。1分後、手袋をはめた片方の手をケージの前端近くのケージ内にさらに1分間置きます。
   6. 性別の異なる動物間で手袋を交換します。
2. オープンフィールドテスト
   注:従属変数:測定された変数には、総移動距離、センターゾーンと周辺で費やした時間、センターエントリーの数、および飼育イベントが含まれます。これらの指標は、一般的な自発運動活動と不安のような行動を反映しています。センター時間の増加は通常、不安の軽減と解釈されます。動作はビデオで記録され、自動追跡ソフトウェアを使用して分析されます( 材料表を参照)。
   1. オープンフィールドアリーナ(100 cm x 100 cm x 40 cm)の上にカメラを配置します。
   2. ビデオ録画を開始し、カップ状の取り扱いを使用して動物をアリーナの中央にそっと置きます。7分間の行動を記録します。
   3. テスト後、動物を自宅のケージに戻します。各動物の後にオープンフィールドボックスと壁を70%エタノールで掃除します。エタノールが完全に蒸発するまで待ってから、次の動物をアリーナに配置します。

5. 統計分析

1. 動物との直接的な相互作用の性質上、トレーニングセッション中は実験者の完全な盲検化は実現できませんでしたが、観察者のバイアスを減らすために盲検化された方法で行動データ分析を実行します。
2. インタラクションテストとオープンフィールドテストの両方で、すべてのセッションをビデオに記録します。従属変数を、訓練されたオブザーバーによって手動で収集するか(相互作用テスト)、または行動分析ソフトウェア( 材料表を参照)を使用して自動的に収集し、オープンフィールド記録(センターゾーンで費やした時間)を行います。
3. 統計分析の前に、Shapiro-Wilk 検定を使用してすべてのデータの正規分布を検定します。誤検出率 (Q) を 10% に設定した堅牢な回帰および外れ値除去 (ROUT) 方法を使用して、外れ値を特定し、除外します。トレーニングと性別が行動結果に及ぼす影響を分析するために、相互作用検定の二元配置反復測定 ANOVA と、オープン フィールド テストの中心で費やした時間を評価するための混合二元配置 ANOVA を実施します。
4. 相互作用の検定とオープンフィールドの中心ゾーンで費やされた累積時間を主従属変数として分類します。Tukey の正直な有意差 (HSD) 検定を使用して事後比較を実施します。0.05 < の p 値は統計的に有意であると考えられました。すべての統計分析は、統計ソフトウェアを使用して実行されました ( 材料表を参照)。

結果

訓練されたすべてのスナネズミは、割り当てられたタスクを10日以内に学習し、この種におけるクリッカートレーニングの実現可能性を実証しました。 図4 は、1日目から10日目までのメス(n=27)とオス(n=16)のスナネズミのトレーニングの成功を示しています。オスとメスのスナネズミのトレーニング1日目と10日目のパフォーマンスを分析した反復測定ANOVAでは、時間と性別の間に有意な相互作用効果は見られませんでした(F_(1、41) = 0.003; p = 0.955)、時間の経過に伴う改善は男女ともに類似していることを示しています。時間の非常に有意な影響が観察され (F_{(1, 41}) = 38.83、p < 0.0001)、男女のスナネズミが 10 日目までにトレーニング プロトコルに完全に準拠していることが示されました。

訓練されたスナネズミが10日以内に割り当てられたタスクを遵守したという事実は、この種におけるクリッカートレーニング方法論の有効性を検証しています。この成功率は、クリッカーが望ましい行動と一次報酬 (ヒマワリ/カボチャの種) の間のギャップを埋める二次強化剤として機能するオペラント条件付けの基本原則と一致しています。クリッカーは行動と報酬の間の架け橋として機能し、トレーナーが望ましい行動が発生する正確な瞬間を正確なタイミングでマークできるようにします。これは、行動とその肯定的な結果との間に明確かつ即時の関連性を生み出すのに役立ちます。

行動テストは、トレーニングプロトコルの完了後、特にトレーニング10日目後に実施されました。双方向混合ANOVA分析では、訓練されたスナネズミが実験者の手との自発的な相互作用を増加させることが示されました(図5A)。訓練の有意な効果が検出され(F _(1、60) = 22.89; p < 0.0001)、訓練された動物は実験者とより頻繁に関わりました。事後分析により、女性 (p < 0.0001、n = 27) と男性 (p = 0.049、n = 16) のトレーニングの具体的な違いが明らかになりました。性効果は観察されず(F_{(1, 60)} = 0.621、p = 0.434)、オスとメスのスナネズミが全体的に同様のパフォーマンスを発揮したことが示唆されました。分析の結果、性別とトレーニングの間に有意な相互作用は見られませんでした(F_{(1, 60)} = 0.078、p = 0.781)。

スナネズミによる自発的な相互作用の増加は、クリッカーのトレーニングが正の強化を通じて生来の恐怖反応を効果的に減少させたことを示しています。これにより、取り扱いや実験手順中のストレスが最小限に抑えられ、動物福祉とデータ品質の両方が向上する可能性があります。

トレーニング後の不安のような行動の評価は、オープンフィールドテストを使用して実行されました。 図5B は、センターゾーンで費やされた累積時間を示しています。オープンフィールドテストのセンターゾーンでの累積期間では、性別とトレーニングの間の相互作用は観察されませんでした(F_(1、60) = 0.101、p = 0.751)。さらに、性別の有意な主効果は見られませんでした (F_{(1, 60)} = 0.001、p = 0.969。トレーニングの非常に有意な主効果が観察されました (F_{(1, 60)} = 17.26、p < 0.0001;HSD Tukey テスト: 女性と男性でそれぞれ p = 0.003 と p = 0.052)、訓練されたスナネズミは訓練されていないスナネズミと比較して中心で有意に多くの時間を過ごしたことを示しています。これらの結果は、動物が10日間のトレーニング期間を完了した後に測定された行動反応を反映しています。

OFTは、げっ歯類が新しい環境を探索するときに経験する自然なアプローチと回避の対立を利用します²⁷。スナネズミは、探検への生来の意欲と、潜在的に危険なオープンスペースを避ける自然な傾向のバランスを取るかもしれません。したがって、訓練されたスナネズミが不安を引き起こすセンターゾーンでより多くの時間を過ごしたという事実は、クリッカーのトレーニングが全体的な探索行動意欲を高めたことを示しており、これは一般的な福祉の改善を示している可能性があります。

図4:クリッカートレーニングの検証。 男性と女性の被験者の 1 日目と 10 日目のトレーニングの成功: トレーニングの成功は、トレーニング プロトコルの 1 日目と 10 日目に、女性 (白いバー、n = 27) とオス (灰色のバー、n = 16) のスナネズミで評価されました。二元配置反復測定 ANOVA により、トレーニング日の有意な主効果が明らかになりました (p < 0.0001)。TukeyのHSDテストを使用した多重比較では、女性(p < 0.0001、n = 27)と男性(p < 0.0001、n = 16)の両方で、1日目から10日目までのトレーニングの成功が大幅に増加していることが示されました。データは平均±標準偏差として表示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:行動評価。 (A)相互作用のテスト:動物が10日間の訓練期間を完了した後、訓練された(灰色のバー)および訓練されていない(白いバー)の雌スナネズミとオスのスナネズミで、実験者の手との相互作用の持続時間(秒単位)が測定されました。二元配置混合分散分析では、トレーニングの有意な主効果 (p < 0.05) と有意な交互作用効果 (p < 0.05) が明らかになりました。TukeyのHSDテストを使用した事後分析は、訓練されていないマウスと比較して、訓練されたマウスが実験者の手と有意に長く相互作用することを示しました(雌:p < 0.0001、雄:p = 0.0497)。データは平均±SDとして表示されます。訓練された女性:n = 27;訓練を受けていない女性:n = 16;訓練された男性:n = 16;訓練されていない男性:n = 5。(B) オープンフィールドテスト: テストは、トレーニングプロトコルの完了後、特にトレーニング 10 日目後に実施されました。センターゾーンで過ごした累積期間は、訓練されたスナネズミ(灰色のバー)と訓練されていない(白いバー)のメスとオスのスナネズミで測定されました。センターゾーン探索に対するトレーニングの効果を分析するために、二元配置混合分散分析を実行しました。TukeyのHSDテストを使用した多重比較により、訓練を受けた女性は、訓練を受けていない女性と比較して、センターゾーンで有意に多くの時間を費やすことが明らかになりました(p = 0.003)。データは平均±SDとして表示されます。訓練された女性:n = 27;訓練を受けていない女性:n = 16;訓練された男性:n = 16;訓練されていない男性:n = 5。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この調査結果は、実験環境でのスナネズミを人間の相互作用に慣れさせるための提案されたプロトコルの有効性を示しています。訓練されたすべての動物が10日以内に目的のタスクを完了する能力は、この方法の効率を際立たせています。

プロトコルの重要なステップの 1 つは、実験者の手に徐々に慣れ、スナネズミが人間の相互作用をポジティブな刺激と関連付けることです。種固有の報酬を使用すると、トレーニング プロセスがさらに最適化されます。トレーニングセッションの期間を調整したり、報酬の種類を変更したりするなどの変更により、スナネズミ間の個人差に合わせてプロトコルをさらに調整し、実験の特定の要件に合わせて最適化することができます。

私たちは、マウスとモンゴルスナネズミの間の行動と学習ダイナミクスにおける顕著な種特異的な違いに焦点を当てています。トレーニングプロトコルを設計する際には、このような違いを考慮する必要があります。たとえば、マウスはより新恐怖症でストレスに敏感である傾向があり、多くの場合、新しい環境や人間の相互作用に慣れるまでにより多くの時間を必要とします²⁸。対照的に、スナネズミはより高い探索意欲と社会的好奇心を示し、トレーニングタスクへのより迅速な関与を促進することができます²⁹。本研究では、スナネズミは実験者の手に容易に近づき、マウスで通常報告されるよりも少ないセッションでクリッカーを報酬に関連付けることを学びました^21,22。しかし、スナネズミは、特にオスにおいて、より大きな個人差も示しており、これはマウスモデルではあまり顕著ではない性別特有のストレスや動機付け要因を反映している可能性があります。これらの違いは、種に適応したトレーニング戦略の重要性を強調しており、スナネズミは自発的な相互作用に重点を置いた、より短い報酬重視のセッションの恩恵を受ける可能性があるのに対し、マウスはより段階的な脱感作と一貫した繰り返しを必要とする可能性があることを示唆しています。これらの行動と認知の違いを理解することは、トレーニング プロトコルを改良し、種間でその効果を最大化するために非常に重要です。

モンゴルスナネズミは、特定の実験設定の準備ではなく、人間と動物の積極的な相互作用と基本的な行動条件付けに焦点を当てた、非特異的または一般化されたクリッカートレーニングから大きな恩恵を受けることができます。このような一般化されたトレーニングは、ハンドリング耐性を高め、基礎ストレスレベルを低下させ、幅広い実験コンテキストにわたって価値のあるより予測可能な行動ベースライン因子を促進します³⁰。非特異的トレーニングは、行動の柔軟性と実験者との一貫した自発的な相互作用を促進し、動物をさまざまな環境、セットアップ、またはテストパラダイムに適応できるようにします^16、31、32。これは、動物がさまざまな手順にさらされる長期研究や多段階実験において特に有益です。本研究では、トレーニングが単一のテストプロトコルに直接結び付けられていなかったにもかかわらず、スナネズミは実験者との相互作用の改善とストレス関連行動の減少を示し、正の強化による一般的な慣れが全体的な実験の回復力と動物福祉を向上させることができるという考えを裏付けています。

実験者との相互作用の増加に加えて、訓練された雌動物はオープンフィールドテストの中央ゾーンで大幅に多くの時間を費やしました。この行動パターンは、特に新しい環境や軽度の嫌悪感のある環境に反応して、げっ歯類の不安のような行動の減少として一般に解釈されます³³。これらの発見は、クリッカーのトレーニングが不安の行動指標の減少に寄与し、それによって動物の実験手順に対処する能力を高める可能性があることを示唆しています。これは、正強化ベースの慣れプロトコルが実験用スナネズミのストレス回復力と行動の安定性を改善できるというより広範な結論を裏付けています。ストレス軽減を超えて、クリッカートレーニングは実験結果に幅広い影響を及ぼします³⁴。訓練されたスナネズミは、取り扱いに対する耐性が高く、研究結果を混乱させる可能性のあるストレスによる生理学的変動を最小限に抑えました。同様の発見は、実験用ウサギやマウスを含む他の種でも報告されており、クリッカーで訓練された動物は、実験者の相互作用の増加と、排尿、排便、発声、浮遊行動の減少などの不安やうつ病に関連する行動の減少を示しました^19,21。

これらの結果は、ストレス関連反応のばらつきを減らすことで、動物福祉と行動データの一貫性の両方を改善するクリッカートレーニングの可能性を浮き彫りにしています。このプロトコルの目的は、採血などの本質的に嫌悪的な手順をクリッカーのような正の刺激と関連付けるように動物を条件付けすることではないことを明確にすることが重要です。むしろ、目標は、ベースラインのストレスを軽減し、動物を人間の相互作用に慣れさせ、中立的またはやや困難なタスクへの自発的な参加を促進することです。いくつかの研究では、より侵襲的な処置のために動物を準備するための正強化の使用が調査されていますが³⁵、これには慎重に構造化された脱感作プロセスが必要であり、現在のプロトコルの範囲を超えています。不快感に関連する文脈でクリッカーの合図を誤用すると、実際に意図しない否定的な連想が生じる可能性があります。しかし、正の強化技術を正しく適用すれば、予測可能性を高め、ある程度の制御を可能にすることにより、動物が潜在的に嫌悪的な手順に対処するのに役立ちます³⁶。イヌやヒト以外の霊長類などの他の種でうまく実証されているように、スナネズミがそのような状況で確実に訓練できるかどうかを判断するには、さらなる研究が必要です^37,38。

成功したにもかかわらず、この方法には限界があります。一部のスナネズミは、より長い慣れ期間を必要とし、学習速度に個人差があることを示しています。さらに、訓練を受けていないオスのスナネズミの数が比較的少ないため、分析の統計的検出力が制限され、確固たる結論を導き出すことが困難になります。このグループのサンプルサイズを増やすと、結果の信頼性と解釈可能性が向上する可能性があります。さらなる研究では、ストレス反応と学習メカニズムにおける潜在的な性差を調査する必要があります。

この研究のより広範な意味は、ストレス軽減を超えて広がります。標準的な飼育の一部として構造化されたトレーニングプロトコルを実装すると、ストレス誘発性の生理学的反応によって引き起こされる変動性が減少し、実験結果の信頼性が向上する可能性があります^39,40。これは、ストレスが重大な交絡因子となる神経科学や代謝研究などの分野に特に関係します。意図しないエンリッチメント効果を回避するには、トレーニング手順の慎重な報告と標準化が不可欠です。

今後、将来の研究では、代替強化スケジュール、トレーニング手順の自動化、種全体の長期的な影響を探る必要があります。科学的裏付けが増えるにつれ、クリッカートレーニングは、データ品質と動物福祉の両方を強化できる貴重な改良戦略となります。研究室全体でトレーニングと取り扱いプロトコルを標準化することは、再現性を向上させ、生物医学研究における人道的で効果的な実践のより広範な採用をサポートするのに役立つ可能性があります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ケージ	Zoonlab GmbH	3010006	590 x 380 x 200 mm;1.815 m2
カメラ	Sony	HDR-CX240E	デジタル HD ビデオ カメラ レコーダー
フードペレット	Ssniff	V1644-000	Art. Nr. I-Clicker-Blau
フットクリッカー		https://www.hundeschulen.com
GraphPad プリズム	GraphPad Software, Inc	https://www.graphpad.com/features	バージョン10 for windows
フィールドボックス	Noldus	MXO1S-M001	オパール 100 x 100 x 40 cm
ボチャの種	REWE	8820911	REWE Bio
Pylon viewer	Basler	https://www.baslerweb.com/de-de/software/pylon/
ヒマワリの種	Seeberger	4744292
三脚	マンフロット	GT- mkbfra4gtxp bh	Befree GT
トンネル	Plexx	14179	152 x 76 x 3 mm