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方法論記事

経皮送達のためのCAGEベースのイオン液体システムの開発、特性評価、および評価

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DOI:

10.3791/68658

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2025年9月26日

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1LEO Foundation Center for Cutaneous Drug Delivery, Department of Pharmacy, Faculty of Health and Medical Sciences, University of Copenhagen

この記事について

サマリー

このプロトコルでは、再現性を確保し、さまざまな科学ラボ間で全体的なワークフローを合理化するためのCAGEベースのイオン液体システムの調製の標準化について説明します。

要約

イオン液体は、薬物送達におけるその用途、特に皮膚への薬物浸透を可能にし、薬物の透過性を高める可能性が最近注目に値するようになりました。イオン液体はバリア透過性を高めるだけでなく、優れた溶媒和特性を備えており、難溶性薬物を溶解するという課題に対処します。有機陽イオンと陰イオンの間の非対称性が大きいため、これらの機能性塩は室温でも液体のままです。アプリケーションの観点から見ると、イオン液体は、複数の治療分野に役立つ有望で高度に調整可能なアプローチを提供します。化学量論的イオン比 1:2 のコリンとゼラニン酸 (CAGE) で構成される生体適合性イオン液体は、小分子、ペプチド、タンパク質、核酸などの幅広い医薬品有効成分の経皮送達の計り知れない可能性を秘めています。これは皮膚バリア機能への影響を最小限に抑えます。ここでは、CAGEの調製、特性評価、評価の方法を共有します。NMR分光法、示差走査熱量測定、含水率分析のためのカールフィッシャー滴定、およびブタの皮膚の ex vivo バリア相互作用研究を使用したCAGE特性評価の代表的な結果が示されています。

概要

皮膚は体の最大かつ最も重要な器官であり、水分の損失を防ぐと同時に、有害物質に対する保護バリアとして機能します1。同時に、皮膚に薬を塗布したり、皮膚を通して薬を塗布したりすると、さまざまな利点が得られます。注射剤や経口投与と比較して、皮膚投与は患者のコンプライアンスを高め、肝臓での初回通過代謝を回避します2。特に皮膚疾患の場合、皮膚投与製剤は局所的な効果をもたらし、全身への曝露を減らすことに優れています3.しかし、皮膚のほとんど不浸透性の性質は、皮膚送達の成功を著しく妨げます4。人間の皮膚は、表皮、真皮、皮下組織の3つの異なる層で構成されています4。表皮は皮膚の外層であり、さらにさまざまな下層に分けることができ、角質層は主にケラチノサイトで構成される最外層です。角質層は、ほとんどの分子の顕著な透過バリアとして機能し、皮膚のより深い層への輸送を阻害します5。このバリア機能は、主にリン脂質、ステロール、およびセラミドを含む、密に詰まった脂質配列に埋め込まれた角質細胞の存在から生じ、しばしば実店舗構造6と呼ばれる。この皮膚バリアを克服するために、化学透過促進剤 (CPE) は、角質層に存在する脂質やタンパク質と相互作用することにより角質層の構造を破壊するため、高分子を送達するために導入されています7。

イオン液体(IL)は、次世代のCPEとして登場しました8。これらは、かさばる有機カチオンと陰イオンで構成され、非対称的に配置され、弱い無指向性イオン相互作用によって配位されています9。これらの弱い分子間力により、ILは100°C以下で液体として存在し、明確に定義された結晶構造に詰め込むことができません10。ILは、その有効性が陽イオンまたは陰イオンの選択と、これらのイオン間の化学量論的比に大きく依存するため、高度に調整可能です。したがって、それらは、さまざまな疎水性を持つ薬物に対して高い可溶化および安定化能力を持っています11。ILは、高分子の徐放性とカプセル化をそれぞれ提供することにより、脂質とポリマーの両方のユニークな特性を提供します12。

コリンとゼラン酸 (CAGE) に基づく生体適合性 IL は、化学量論的モル比 1:2 で存在し、親水性化合物と疎水性化合物の両方の経皮送達に重要な用途があります。CAGE は、タンパク質 (インスリン13) と核酸 (siRNA14) の経皮送達を大幅に増強することが報告されています。CAGEは、重炭酸コリンとゼラニン酸の間の塩メタセシス反応によって調製され、副産物としてCO2 が15。塩メタセシス反応は、穏やかな条件下でイオン交換 を介して 、直接的、迅速、かつ高度に選択的な方法で新しい化合物の形成を提供します。一般に、CAGE ILの開発と評価のためのわかりやすいワークフローが不足しています。したがって、ここでは、さまざまな背景を持つ研究者がこの研究分野に参入できるように、CAGE準備の各段階を詳述するそのようなワークフローの1つを提供します。

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プロトコル

すべての実験手順は、欧州連合指令 2010/63 に準拠して実施され、デンマーク獣医食品局によって承認されました (ライセンス番号。DK-13-oth-931833)。

1. 塩メタセシス反応によるCAGE調製

  1. ゲラニン酸の再結晶(純度85%、mol wt 168.23 g / mol)
    1. 500 mLの丸底フラスコを取り、その重量を測定します。
    2. フラスコに40.0 gのゲラニン酸を重ねます。これは0.2モルのゲラニン酸に相当します。
    3. 70:30%(w / w)のゲラニン酸でゲラニン酸を再結晶化する:アセトン:(40 g * 0.85 * 0.30)/(0.70 * 0.784 g / mL)= 18.42 mLのアセトンを丸底フラスコに加えます。
    4. 5Lのビーカーを取り、約0.5Lのドライアイスとエタノールを準備します。
    5. 丸底フラスコをドライアイスとエタノールのコールドミックスに渦巻かずに入れて、外部冷却を可能にします。結晶化が平衡に達したときの固体/再結晶ゼラニン酸からのアセトンと不純物をデカントします(添加されたアセトンのほぼ体積に相当し、通常は0.5〜2時間以内)。この手順を5〜6回繰り返して、十分な純度を確保します。
    6. 真空下で40 rpmで少なくとも20分間、または丸底フラスコに触れたときに冷たく感じなくなるまで回転蒸発することにより、残りのアセトンを除去します(アセトンの蒸気圧は20°Cで240 mbarです)。
    7. フラスコと再結晶ゼラニン酸の質量を量り、メモします。最初の空フラスコの重量に基づいて収量を計算します。予想される収量範囲は60〜80%です。
  2. 塩メタセシス反応
    1. ゲラニン酸:コリンのモル比が2:1の場合、ゲラニン酸の再結晶の収率を考慮して、コリンのモル数を計算します。たとえば、収率が70%の場合、0.07モルのコリンを添加する必要があります(0.2 * 70 / 100 = 0.14、0.14 / 2 = 0.07)。
    2. 重炭酸コリンの純度は 80%、分子量は 165.19 g/mol です。したがって、14.45 g(0.07 * 165.19 = 11.56 g、100/80 * 11.56 g = 14.45 g)の重炭酸コリンを滴下して、こぼれを防ぎます。
    3. 室温(18 ± 3 時間)で 300 rpm (または適切な速度) で、または CO2 の蒸発が止まるまで、サンプルを一晩撹拌します。
    4. 60°C、30 mbarで40分間回転蒸発してサンプルを乾燥させます。まず温度を上げ、次にゆっくりと圧力を下げて泡立ちを防ぎます。
    5. CAGEを、意図した用途に適した容量のガラスバイアルに分注します(例:4 mLのガラスバイアルに2 mLのCAGE)。
    6. バイアルを真空下で60°Cで48時間乾燥させます。

2. CAGEの特性評価

  1. 核磁気共鳴(NMR)分光法
    1. CAGEを重水素化ジメチルスルホキシド(d-DMSO)に25 mg/mLの濃度に溶解し、少なくとも500 μLの最終容量を確保します。
      注:重水素化溶媒は、溶媒中の水素原子からの干渉を避けるためにNMRに不可欠です。
    2. 調製した溶液500 μLを、清潔で乾燥したNMRチューブ(装置によって異なりますが、通常直径5 mm)に移します。蒸発や汚染を防ぐために、チューブをキャップで密封します。
      注: 気泡は磁場の均質性に影響を与える可能性があるため、気泡の導入は避けてください。
    3. 次のパラメータを備えたNMR分光計(例:400 MHz)を使用します。
      -スキャン回数: 1時間NMRで8-16回。 13C NMRの場合は1,000-5,000(濃度と必要な信号対雑音比(S/N)によって異なります。
      -緩和遅延(D1): 1時間および 13°CのNMRで1〜2秒。
    4. 適切なソフトウェアを使用してデータを処理します。
      1. 位相補正とベースライン補正 により 、最適なピーク形状に調整します。
        注:これは通常、NMRソフトウェアの[ 処理] タブまたは [補正 ]タブ(使用するソフトウェアによって異なります)で実行され、位相調整とベースライン補正用の自動ツールが利用可能です。
      2. 残留溶媒ピーク(d-DMSO)を基準として使用します: 1時間で~約2.50 ppm、 13C NMRで~約39.52 ppm。不純物の参照については、Fulmer et al.15を参照してください。
    5. ピークを積分し、構造内の陽子に割り当てます( 図1を参照)。
  2. カールフィッシャー滴定法による水分含有量
    1. 300 mgのCAGEを300 μLのメタノールに溶解します。1 mLのシリンジにロードし、注射の前後に計量します。
    2. 製造元の指示に従って、電量測定カールフィッシャー滴定装置を使用して水分含有量を測定します。
      1. シリンジを使用してセプタムから滴定セルにサンプルを注入し、空のシリンジの重量を入力して、 Enterキーを押します。結果は % w/w として表示されます。
      2. メタノールの含水率を調整して、CAGEの実際の含水率(通常1〜2% w / w)を取得します。(Wサンプル = Wサンプル+希釈液*(mサンプル+m希釈液)-(W希釈液*m希釈液)/mサンプル)。
  3. 示差走査熱量測定(DSC)によるCAGEの熱安定性
    1. 各サンプル3〜5 mgをアルミニウム製のTzeroパンに入れ、密閉蓋で密封します。
    2. 80°Cから-80°Cの温度範囲でDSCを使用して、-80°Cに冷却する前に10分間の等温期間でサンプルを分析します。
    3. 5 °C/minの一定の加熱/冷却速度と50 mL/minの窒素パージを使用します。
    4. 適切なソフトウェアを使用してデータを処理します。

3. 皮膚バリア相互作用の ex vivo 評価

  1. ブタの皮のダーマトーム処理
    1. 発泡ポリスチレン(EPS)をダーマトームブレードに合うようにカットし、グラフトテープで包みます。ブタのロース部分から採取した皮をメスで活用します。ここでは、生後3.5か月の雌のデンマークランドレースまたはヨークシャー豚(30〜40 kg)から皮膚を採取しました。
    2. 筋肉と脂肪組織を取り除きます。組織の皮膚形成を容易にするには、平らで均一な基底外側を確保することが重要です。
    3. ヘアトリマーを使用して、皮膚からできるだけ多くの毛を取り除きます。
    4. リン酸緩衝生理食塩水(PBS、pH 7.4)で皮膚をすすぎ、血液と抜け毛を取り除きます。
    5. EPSブロックに合うようにナイフを使用して皮膚を細かく切ります(5 cm x 15 cm)。
    6. 皮膚を針でEPSブロックに貼り付けます。
    7. ダーマトームを0.5mmの厚さに設定し、皮膚を切片にします。
    8. 皮膚を2層の移植テープの間に保管し、-70°Cで保管します。
  2. 経表皮水分損失(TEWL)
    1. 1錠を200mLの超純水に溶解してPBS(pH 7.4)を調製します。超音波浴中で20分間脱気します。
    2. フランツ拡散セルに接続されたウォーターバスの電源を入れます。脱気したPBSと磁気ビーズを約12mLの各細胞に加えます。磁気撹拌をオンにして(例えば、600 RPMで)、乱流を発生させることなく受容体媒体に均一に分布させます。すべてのフランツセルセットアップで撹拌速度を正確に制御できるわけではないことに注意してください。受容体培地の温度が37°Cに達するように熱源を調整します。
    3. 皮膚分層皮膚をメスで直径約3cm(または適正大きさ)に切り、角質層を上に向けてクランプとシールリングを使用してフランツ拡散細胞に慎重に装着します。
    4. 次に、ガラス製パスツールピペットを使用して受容体チャンバーをPBSで完全に満たし、受容体培地の既知の量を示すマークまで満たされていることを確認します。セルを慎重に反転させて気泡を取り除きます。30分間水分補給します。
    5. TEWLデバイスの電源を入れ、製造元のガイドラインに従って安定するまで20分間平衡化します。
    6. TEWLプローブを各Franzセルに置き、ソフトウェアで [開始 ]を押します。読み取り値が表示されるまで押し続けます。
    7. 300 μLのサンプルを皮膚の上に添加し(3回、n = 3)、フランツ細胞の上に移植テープを貼って閉塞します。37°C(受容体培地温度)で24時間インキュベートします。
    8. 糸くずの出ないワイプでティッシュを拭いてサンプルを取り除きます。30分間放置します。
    9. 各細胞のTEWLを測定して、皮膚バリアに対するサンプルの影響を調べます。曝露前の値に対するTEWL値を計算し、PBSコントロールに対して調整します(相対TEWL=(TEWLポストTEWLプレ/TEWL前)/(TEWL(PBS)ポストTEWL(PBS)プレ/TEWL(PBS)プレ))*100。

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結果

NMRスペクトル
この手法の目的は、 1H および 13C NMR 分光法を使用して水素原子と炭素原子の化学環境を分析することにより、CAGE の形成に成功したことを確認することです。得られたスペクトルは、合成されたILの分子構造と組成を反映する特徴的な化学シフト、分裂パターン、および積分値を提供します。 図1 のプロトンNMRスペクトルは、ゲラン酸とコリンのモル比が2:1であることを確認します。これは、ゲラン酸に対応するピーク(9)をキャリブレーションの基準として使用した積分値から明らかです。その結果、コリンの積分値はゼラン酸の約半分に見え、予想される化学量論と一致しました。

図1と図2のNMRスペクトルは、Zakrewskyら16によって以前に実証されたように、CAGEの...

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ディスカッション

本研究で記載されているCAGEの調製方法は、文献15から採用された。ただし、合成プロセスはさまざまな外部要因に敏感であり、最終製品の特性に影響を与える可能性があることを認識することが重要です。したがって、調製したら、NMR 分光法などの技術を使用して CAGE システムを特徴付け、CAGE の形成を確認する必要があります。

図1に示すように、CAGEのプロトンスペクトルは、各分子のプロトンの化学シフトを示しています。1H NMRスペクトルと13C NMRスペクトルの両方の詳細なピーク割り当ては、参照文献16に記載されています。水の存在は、COOH、OH、およびH2O基間のプロトン交換の増強により、1H NMRの特定のピークの相対強度を増加させる可能性があることが以前に報告され...

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開示事項

著者らは、競合する金銭的利益を宣言していない。

謝辞

この研究は、LEO財団の助成金番号によって支援されました。LF15007および LF-FE-23-700013。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
5mm NMR管シグマ・オルドリッチ41121705
アセトンVWR23L064039
アルミニウム製TzeroパンTAインスツルメンツ90,16,83,901
アクアフラックス装置バイオックスシステムズ
ブルーカー・アバンスIII NMRブルーカーNMR分光法用の機器
コリン重炭酸塩シグマ・オルドリッチC7519
皮膚腫ジマー・バイオメット
差分走査カロリメーターTAインスツルメンツ
エタノールVWR23J314009
膨張ポリスチレン発泡スチロール
フランツ拡散セルパーメギア
ゼラン酸シグマ・オルドリッチ427764
接ぎ木テープパラフィルム
カール・フィッシャー滴定器メトラー・トレド30252662
メタノールVWR85681.32
PBSフィッシャー・サイエンティフィック10388739
TA ユニバーサル解析 2000 ソフトウェアTAインスツルメンツDSCデータ解析用ソフトウェア
TopSpinソフトウェアブルーカーNMRデータ解析用ソフトウェア

参考文献

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