コンピュータ数値制御(CNC)マイクロマシニングおよびマイクロモールディング による 超鋭角高分子マイクロニードルの作製

サマリー

この記事では、コンピュータ数値制御(CNC)フライス加工 によって 作成されたマスターモールドからのマイクロモールディングを通じて、非常に鋭い先端を持つポリマーマイクロニードルを製造するためのシンプルでわかりやすく革新的な製造プロトコルを紹介します。開発されたシステムは、費用対効果が高く、構築が容易で、優れた切れ味のマイクロニードルを製造することができ、浸透性が向上し、送達性能が向上します。

要約

マイクロニードルは、その低侵襲で痛みのない性質により、経皮薬物送達の有望な方法として最近認識されており、特定の治療要件を満たすために幾何学的な変更を通じて柔軟に設計できます。そこで、本研究では、CNC(Computer Numerical Control)フライス加工技術を用いて、多様なシャープネスを持つ高分子マイクロニードルを作製し、治療効果を高めるマイクロニードルマスターモールドの開発を目指します。これまで、私たちのチームは、送り速度とランプ角度という2つの重要な加工パラメータを最適化することに成功し、得られた針への影響を分析していました。したがって、この記事では、ポリマーベースのモデル針の性能を製造および評価するための包括的な実験プロトコルのセットを示します。さらに、この作業は、サンプル針の再現性と治療効果を実証するための代表的な結果も提供します。私たちの研究チームは、この簡単なプロトコルにより、研究者が費用対効果の高い高精度のマイクロニードルを作成できるようになり、特にパンデミック時に、さらなる生物医学アプリケーションのためのマイクロニードル技術が進歩すると予想しています。

概要

マイクロニードルは、初回通過の肝臓代謝を回避しながら、痛みを伴わず自己管理可能な性質により、近年、薬物送達の有望な候補として浮上しています¹。マイクロニードルは、多くの生物医学的用途(ワクチン接種、がん治療、診断、化粧品など)で大きな注目を集めており、治療薬やその他の物質を皮膚や下層組織に正確かつ低侵襲に送達し、副作用を抑えて治療効果を高める必要があります²。

意図された用途に応じて、マイクロニードルは多くの形態(すなわち、固体、コーティング、中空、多孔質、膨潤性、および溶解性)で作製することができ、角質層³を貫通することにより、診断および経皮薬物送達アプリケーションのために潜在的に作製できる。エンジニアリングの観点からは、マイクロニードルの製造には数多くの製造技術が利用可能です。その中でも、CNCマイクロマシニングは精密で汎用性の高い方法であり、複雑な3次元構造を高精度かつ適応性で作成するために広く採用されているため、マイクロニードルマスター金型製造⁴に特に適しています。これに対応して、私たちの研究チームは、CNCマイクロマシニング技術⁵を使用して、超鋭い先端を持つマイクロニードルマスターモールドを製造するための最適化された、低コストで、簡単で革新的なアプローチを以前に提案しました。さらに、マイクロニードルは、さまざまな材料(金属、セラミック、ポリマーなど)から作ることもできます。これらの中で、高分子マイクロニードルは、その生体適合性、生分解性、および非毒性のために有望であると浮上しており、生物医学的応用に有用である可能性を秘めています⁶。

本研究では、CNCマイクロマシニングとマイクロモールディングにより高切れ味な針を作製するように設計されたマイクロニードルマスターモールドを作製するための最適なプロトコールを紹介する。このアプローチは、CNCフライス加工 による マスターモールド製造を探求した以前の研究に触発されました。製造パラメータ(送り速度、傾斜角など)の最適化に関連する裏付けとなるデータと数値を確認するには、前の出版物⁵を参照することをお勧めします。さらに、この作業では、新しく開発されたポリマーベースのマイクロニードルモデルの作製を実証することにより、この提案されたプロトコルの有効性も評価します。このプロトコルの利点を最大限に引き出すために、読者はエンジニアリング仕様を検討することをお勧めします。たとえば、重要な考慮事項には、適切な材料、フライス工具、および最適化されたパラメータ(送り速度、スピンドル速度^{など)の選択}が含まれます7。マイクロニードル製造に求められる高精度と精度を考えると、CNCフライス加工プロセスは、フォトリソグラフィー技術と比較して高い柔軟性を提供しながら、先端径や多様な形状などの特定の設計基準を満たす構造を製造できる必要があります⁸。さらに、この方法のPDMSネガティブモールドレプリカは、高い再現性を示し、劣化することなく複数の鋳造サイクルに耐えることができるため、シャープネスの異なるマイクロニードルの単純で費用対効果の高い作製の候補となる可能性があります⁹。

プロトコル

この研究に使用した試薬、機器、およびソフトウェアは、 資料表に記載されています。

1. ポリメチルメタクリレート(PMMA)を用いたマイクロニードルマスターモールドの作製

1. マイクロニードルマスター金型設計
   注: マイクロニードル マスター モールドの設計は、Fusion 360 (Autodesk、米国、教育機関限定ライセンス) を使用して行われました ( 資料の表を参照)。
   1. デザイン環境でソフトウェアを開き、新しいスケッチを作成します。
   2. 押し出し機能を使用してボックスを描画します。
   3. [押し出しカット]ツールを使用して階段状の空洞を生成します。
   4. 1 つのマイクロニードル本体を円柱として作成します。
   5. 面取りを使用してシリンダーをフライス加工し、円錐形のマイクロニードルを形成します。
   6. Arrayコマンドを使用して、10 x 10マイクロニードルマスターモールドを生成します。
      注:目的のアプリケーションに応じて、マイクロニードルの寸法は異なる場合があります。このプロトコルでは、実証された針は、円錐形、針の高さ:600μm、ベース直径:400μm、および針間の距離:1400μmの寸法で形成されます。
   7. 設計をレビューして、精度と一貫性を確保します。
   8. 最終デザインを互換性のある形式(.f3dなど)で保存し、さらに処理します。
2. コンピュータ支援製造(CAM)のセットアップ
   1. CAM 環境で金型設計を開きます。
   2. 金型の上部にストック付きのPMMAワークピースをセットします。
   3. 平面フライス加工を行い、フラットエンドミル¹⁰を使用して上面を取り外します。
      注意: 工具径 (3 mm)、送り速度 (300 mm/分)、スピンドル速度 (3000 rpm)、切込み (1 mm)、ステップオーバー (1 mm) など、フラットエンドミルのパラメータを設定します。
   4. ポケットミリングを使用して、フラットエンドミル⁵を使用して段付きキャビティを加工します。
      注意: 工具径 (1 mm)、送り速度 (300 mm/分)、スピンドル速度 (4000 rpm)、切込み (0.5 mm)、ステップオーバー (0.3 mm) など、フラットエンドミルのパラメータを設定します。
   5. ポケットミリングを再度適用して、円筒形の構造物を形成します。
      注:工具径(0.8 mm)、送り速度(200 mm / min)、スピンドル速度(4000 rpm)、切込み(0.2 mm)、ステップオーバー(0.2 mm)など、フラットエンドミルのパラメータを設定します。
   6. ボアミリング⁵を使用して、PMMA円錐形のマイクロニードル構造を作成します。
      注意: 工具径 (0.4 mm)、送り速度 (100 mm/分)、スピンドル速度 (4500 rpm)、傾斜角 (1.5°) など、ボアフライス加工のパラメータを設定します。
   7. さらに処理するためのGコードを生成するには、 Setup > Create NCプログラムを右クリックします。 「マシンとポスト 」タブで、目的のポストプロセッサとして Tormach PathPilot を選択します。最後に、ダイアログボックス内の[ 投稿 ]ボタンをクリックして、Gコードを生成します。
3. コンピューター数値制御(CNC)マイクロマシニングセットアップ
   1. ポリメチルメタクリレート(PMMA)ワークピースの準備
      1. 寸法:幅:30 mm、長さ:30 mm、高さ:5 mmのPMMAワークブロックを入手します。
      2. PMMAブロックをクランプを使用して加工テーブルに固定し、フライス加工中の動きを防ぎます。
   2. CNC加工のセットアップ
      1. 最大主軸回転数5140rpmの3軸マシニングセンターを使用してください。
      2. 適切なフライス工具を選択し、ER20コレットに挿入して、スピンドルに適切に固定されていることを確認します。
   3. 切断プロセス
      1. clamp CNCマシンのバイスにPMMAワークピースを固定します。
      2. ゼロ点を設定して、エンドミルとワークピースをx、y、z軸で正確に位置決めします。
      3. Gコードプログラムと切削パラメータによって定義されたツールパスで加工を開始します。
      4. PMMAマスターモールドを製作するための自動切断を開始します。
         注意: 切削プロセス全体を通して、ワークピースにオイル潤滑剤を継続的に塗布することをお勧めします。フライス工具交換後、ゼロ点(Z軸)をリセットしてください。
      5. プロセスの精度とツールの安定性を定期的に監視します。
         注意: フライス加工が完了したら、得られたマイクロニードルマスターモールドをCNCマシンから慎重に取り外します。
      6. 超音波を使用して機械加工された表面を清掃し、余分な潤滑剤と破片を取り除きます。
4. ネガティブモールドレプリカ
   1. ポリジメチルシロキサン(PDMS)キャスティング溶液調製
      1. エラストマーベースと硬化剤を10:1(w / w)の比率で混合します。
      2. 混合物を5分間掃除機で吸い取り、気泡を取り除きます。
   2. PDMSによるネガティブモールド製造プロセス
      1. 脱気したPDMS混合物を、約1mmの厚さのPMMAマスターモールドに注ぎます。
      2. 混合物を含む型をさらに5分間真空にして、気泡を取り除きます。
   3. 硬化プロセス
      1. PDMSモールドを90°Cのオーブンで45分間硬化させ、構造を固めます。
   4. カビの除去と複製
      1. ピンセットを使用して、PDMS硬化した金型をPMMAマスター金型から慎重に取り外します。
      2. レプリケーション プロセスを繰り返して、1 つの PMMA マスター モールドから複数の PDMS ネガティブ モールドを作成します。
         注:PDMSネガティブモールドは、マイクロニードルパッチ作製に再利用でき、高いスループットと効率的な作製アプローチを示しています。

2. 高分子マイクロニードルパッチの作製

(注)提案システムの有効性を評価するため、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリビニルピロリドン(PVP)、水溶性キトサン(WCS)からなるポリマーベースのモデルマイクロニードルを作製するサンプル作製プロセスを実演しました。

1. 高分子溶液の調製
   1. WCS溶液の調製
      1. WCS粉末を蒸留水に直接溶解することにより、3%(w / v)WCS溶液を調製します。
         注:マグネチックスターラーを使用して溶解速度を加速します。
   2. PVA/PVP溶液調製
      注:PVA/PVPソリューションは、マイクロニードルパッチを支持材料として提供することにより、マイクロニードルパッチの構造的完全性を向上させます。
      1. 各物質について7.5%(w / v)の濃度でPVA / PVP溶液を調製します。
      2. 計算された量の蒸留水を粉末混合物に加えます。
      3. マグネチックスターラーを使用して溶液を連続的に混合し、70°Cで4時間加熱し、均一になるまで加熱します。
      4. 溶液含有ビーカーをフィルムで覆い、蒸発を防ぎます。
2. マイクロニードルパッチ作製
   注:溶媒鋳造技術を使用して、得られたPDMS金型からのPVA / PVP / WCSマイクロニードルパッチの作製。
   1. 得られたWCS溶液400μLをマイクロピペットを使用してネガティブPDMSモールドに分注します。
   2. 金型を真空チャンバーに入れ、15分間真空にして気泡を取り除き、溶液が金型の空洞に適切に充填されていることを確認します。
   3. PVA/PVP溶液の別の層を基材として金型の表面に塗布します。
   4. 金型をオーブンに移し、65°Cで4時間乾燥させて、マイクロニードルパッチを完全に固化させます。
   5. 乾燥したら、ピンセットを使用して、得られたパッチをPDMSから慎重に分離します。

3. マイクロニードルパッチの評価

1. 機械的強度評価
   1. マイクロニードル構造完全性測定のための実験セットアップ
      (注)この実験は、自社開発のシステムを使用して行われました。簡単に言うと、この装置は、(1)力試験ステーション、(2)ソフトウェアインターフェース、(3)USB顕微鏡、および(4)10Nロードセルで構成されています。
   2. 測定ソフトウェアのインストール
      1. ソフトウェアパッケージ「自動注射針設定<.exe>」から、、、補足ファイル1、補足ファイル2、補足ファイル3の3つの操作ファイルをダウンロードします。これらのファイルは、この機械測定ソフトウェアのインストールに対応しています。
         注意: システムを操作するために、ユーザーは<.exe>を開くだけです file、他のファイルは構成ファイルであり、直接の操作は必要ありません。
   3. 測定手順
      1. マイクロステージの表面に1本のマイクロニードルを置き、両面テープで貼り付けます。
      2. 移動速度を40mm/hに調整します。
      3. センサーが針先に直接接触するまで、センサーとマイクロ針先の間の距離を調整します。
      4. 測定ソフトウェアによって生成された得られた力-変位グラフを記録します。
      5. 各サンプルについて実験を3回繰り返します。
2. 浸透評価
   1. マイクロニードル貫通測定のための実験セットアップ
      1. パラフィンフィルム(PF)シートをそれぞれ125μmの厚さで8層に積み重ねます。
      2. PFスタックをマイクロステージの表面に置き、固定して、実験中の安定性を確保します。
   2. マイクロニードルアタッチメント
      1. 1本のマイクロニードルを機械式ロードセルに取り付けて、適切に垂直に挿入します。
   3. 挿入手順
      1. マイクロニードルで取り付けたロードセルを、PFスタック内に40 mm/hの一定速度で下方に移動するように設定します。
   4. データ収集と分析
      1. PFスタックからマイクロニードルを取り外します。
      2. PF層を慎重に広げて、各シートを露出させます。
      3. 展開したPFスタックを顕微鏡で観察し、各層の貫通穴の数をカウントします。
      4. 各サンプルについて実験を3回繰り返します。

結果

この研究では、CNCマイクロミリングを使用して非常に鋭いマイクロニードルを実現するように設計されたマイクロニードルマスターモールドを作製するためのプロトコルを紹介します。先端のシャープネスに関するデータを調べるには、読者は以前の出版物⁵を参照することをお勧めします。 図1 は、マイクロニードルマスター金型の設計とその寸法の概略図を示しています。 図2 は、CAM を介した 回路図設計からフライス加工指示への変換を示しています。CAMのセットアップに続いて、 図3に示すように、マスターモールドのマイクロミリング加工はCNCマイクロマシニングを使用して実行されます。マスターモールドが形成されると、 図4に示すように、マイクロニードルパッチを製造するための一連のモールディングのテンプレートとして機能します。製造を成功させるために、PDMSマス...

ディスカッション

本研究では、CNCマイクロマシニングとマイクロモールディングにより、優れた切れ味を持つ高分子マイクロニードルを作製するためのマスターモールドを作製する独自の実験プロトコルを開発しました。主に、このアプローチには、概略設計とCNCフライス加工 による マスターモールドの製造を統合し、その後、マイクロニードルパッチを作成するための一連のマイクロモールディングプロセスが含まれます。マイクロモールディングは、複雑で再現性のある微細構造を高精度に作製できることから、コスト効率を維持しながら大規模製造に適していることから、古くから広く利用されてきた¹¹。

提案された製造プロトコルの再現性を確保するために、 図5A は、金型充填プロセスのさまざまな段階での視覚的なチェックポイントを示しています。真空適用前は、PDMS金型内の未充填のマイクロキャビティが簡単に見えました(赤い矢印)。真空処理では、PDMSの...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3軸マシニングセンタ	Tormach PCNC 1100		CNCミル 材料切削用
自動ニードル射出構成	自社開発		の機械測定ソフトウェア
留水	Cole-Parmer WS-200シリーズ スチュアート水蒸留器
Fusion 360ソフトウェア、教育版オート	デスク、米国	デザインソフトウェア (https://www.autodesk.com/asean/products/fusion-360/overview?term=1-YEAR&tab=subscription)
ImageJ software	Institutes of Health, USA		画像解析
ポリジメチルシロキサン	SYLGARD 184 シリコーンエラストマーキット	1330-20-7	ネガ金型に使用 ポリ
メチルメタクリレート			マスターモールド
に使用ポリビニルアルコール	シグマ・アルドリッチ、米国	9003-39-8	マイクロニードル素材
ポリビニルピロリドン	シグマ アルドリッチ、米国	9002-89-5	マイクロニードル材料
ローダミン B	シグマ アルドリッチ、米国	83689-1G	モデル医薬品
水溶性キトサン			マイクロニードル素材