方法論記事

電気鍼治療による神経回路-内臓機能の調節におけるファイバー測光記録と組み合わせた光遺伝学の応用

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DOI：

10.3791/68667

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2025年9月19日

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Acupuncture and Moxibustion, China Academy of Chinese Medical Sciences, 2Northeast Asia Research Institute of Traditional Chinese Medicine, Changchun University of Chinese Medicine

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

この実験の目的は、光遺伝学、脳内カルシウム信号記録、胃運動性モニタリングを同時に統合するための新しいアプローチを確立し、体細胞刺激と神経回路と内臓機能の相互作用の関係をリアルタイムでモニタリングするための新しいパラダイムを提供することであり、鍼治療研究に適用されます。

要約

このプロトコルは、特定のタイプのニューロンの光遺伝学的操作のための技術と、in vivoでの麻酔下のマウスの核カルシウムシグナルおよび胃運動に対するZusanli(ST36)での電気鍼治療の効果のリアルタイム記録について説明しています。鍼治療の有効性の根底にある中心的なメカニズムの調査は、技術的な制約によって制限されてきました。しかし、光遺伝学および光学イメージング技術の進歩により、神経科学の発展が推進されました。ファイバー測光記録は、当初は遺伝的にコードされたカルシウム指標を利用して、ニューロン活動を示すカルシウム動態の変化を視覚化するもので、生体内での脳と行動の相関関係を特徴付けるための重要な技術として際立っています。光遺伝学の応用により、ニューロンの遺伝子コード化が可能になり、光刺激に応答してニューロンの活性化または抑制が可能になります。この機能により、神経回路機能と行動結果との間の因果関係の確立が容易になります。ファイバー測光、カルシウム記録、光遺伝学的刺激の同時実行は、ニューロン活動をリアルタイムで記録および操作する方法を提供し、鍼治療の中心的なメカニズムを調査するための効果的なアプローチとして機能します。それにもかかわらず、鍼治療研究におけるファイバー測光カルシウム記録、光遺伝学、および内臓機能モニタリングの同時利用を文書化した研究は依然として不足しています。この実験の結果は、EA-ST36 が PBNGlu-NTS Glu-DMV ChAT 回路に関連する胃の運動性を調節する可能性があることを示しています。この回路の光遺伝学的刺激は、同じ効果を生み出します。この2つを重ね合わせた後、カルシウムシグナルと胃の運動性の変化は最大に達します。この研究は、光遺伝学的、脳内カルシウム信号の記録、および胃運動性モニタリングを同時に統合するための新しいアプローチを確立し、体細胞刺激と神経回路と内臓機能の相互作用との関係をリアルタイムでモニタリングするための新しいパラダイムを提供します。

概要

近年、生体分子蛍光センサーの普及により、分子生物学におけるファイバー測光の利用が推進され、 in vivo 記録が容易になりました1。この進歩により、脳内のニューロン活動の変化をリアルタイムで監視できるようになります。光遺伝学の統合により、ニューロン操作が可能になり、光ファイバーを挿入するだけで光遺伝学と光ファイバーの記録をすぐに実行できるという利点があります。内臓機能の記録と組み合わせることで、この方法は良好な時間分解能と核レベルのターゲティングを提供し、鍼治療がニューロン活動の変化を介して内臓機能をどのように調節するかを観察します。

多くの研究が、胃腸機能に対する鍼治療の明確な調節効果を示しています 2,3,4 が、正確な中心メカニズムはとらえどころのないままです。HuangDiNeiJingなどの多くの古代中国の医学書にも、ST36(膝関節の後方の外側、腓骨頭5より約2 mm下)が胃腸疾患の治療によく使用されることが記録されています。最近の研究では、胃の生理学的プロセス (摂食行動6、摂食停止7、食欲抑制8 など) および病理学的プロセス (胃痛9、胃機能障害10 など) に関与する核には、視床傍核 (PSTn)、縫線背側核 (DRN)、外側傍上腕核 (LPB)、孤立路核 (NTS)、迷走神経背側運動核 (DMV) が含まれます。研究によると、ST36 での電気鍼治療は DMV の c-Fos+ 細胞の数を増加させ、それによって NTS11 の尾側亜核における c-Fos+ 発現を増強できることが示されています。さらに、傍中心核(PBN)は、傍中心核複合体の組成に関与しており、胃腸信号などの内臓感覚情報の統合に重要な役割を果たす延髄NTSに投射できることが文書化されています12,13。上記の情報は、鍼治療が胃の運動性を調節する可能性があり、PBNGlu-NTS Glu-DMV ChAT 神経回路に関連している可能性があることを示唆しています。グルタミン酸作動性ニューロンは主に LPB と NTS14 に関与していますが、コリン作動性ニューロンは主に胃の生理学的および病理学的プロセス中に DMV に関与します15。神経回路と内臓機能に対する鍼治療の調節効果を調査することで、鍼治療のメカニズムをより明確に理解し、内臓疾患における臨床鍼治療介入の理論的裏付けを提供することができます。

しかし、技術的な制限により、内臓機能を調節する電気鍼治療の神経回路メカニズムを掘り下げた研究は限られています。したがって、本研究では、ウイルス注入の詳細なプロセスを紹介するための簡略化されたガイドラインを提示します。特に、この論文で説明された方法論は、鍼治療による多様な内臓機能の調節に関与する回路メカニズムを解明するために利用できます。

したがって、この研究は、カルシウムイメージング記録のための光遺伝学とファイバー測光法を組み合わせることにより、PBNGlu-NTS Glu-DMV ChAT 神経回路に関連している可能性のある胃運動に対する鍼治療の調節効果を調査することを目的としています。その目的は、カルシウムイメージングと光遺伝学的同期のためのプロトコルを確立し、内臓機能と神経回路を調査するための新しい研究フレームワークを導入することです。

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プロトコル

すべての手順は、国立衛生研究所によって確立された実験動物のケアと使用に関するガイドラインに従い、中国医学科学院鍼灸研究所の動物ケアと使用倫理委員会から承認を受けました。体重25gの成体雄C57マウスをウイルス注射と光ファイバー移植に用いた。動物実験プロトコルは、国家基準「実験動物福祉の倫理審査ガイドライン」(GB/T 35892-2018)の要件を厳格に遵守し、同機関の倫理委員会によって承認されました。

注:ウイルス注入および光ファイバー移植のプロセス中は、環境を清潔に保ちます。作業中ずっとマスクを着用してください。ウイルスの高発現期間(21〜28日)に続いて、ST36での電気鍼治療と光遺伝学操作を実施して、胃の運動性を記録しました。動物は、中国医学科学院鍼灸研究所の動物施設で、制御された条件(温度:22〜24°C、湿度:50%〜60%、12時間の明暗サイクル)で飼育され、餌と水に自由にアクセスできました。使用する試薬や機器に関する具体的な情報は、 材料表に記載されています。

1. 術前の準備

  1. 高温滅菌を施した手術器具を消毒し、手術部位を70%エタノールで洗浄します。
  2. 麻酔:マウスに1.25%トリブロモエタノール(0.2mL/体重10g)を腹腔内注射します。つま先のつまみ反射がないことを評価して、麻酔の深さを測定します。
  3. 頭から毛を剃り、耳と歯のバーを備えた定位固定フレームにマウスを配置します。エリスロマイシン軟膏をマウスの目に塗布して、手術用光による損傷を防ぎます。
  4. 光ファイバーフェルール(フェルールサイズ:1.25mm、白色フェルール、ファイバータイプ:200/0.37、ファイバー長:5.5mm、フェルール針モデル:V8475)を75%エタノールに30分間浸し、その後、70%エタノールを生理食塩水で洗い流します。
  5. マイクロインジェクター(1 μL)にパラフィン(800〜900 nL)をロードします。ガラス管を溶かし、2つのセクションに描きます。針研削盤を使用して先端の1つのセクションを研ぎ、注入針として機能します。マイクロインジェクターの気密性を確保するために、チューブにパラフィンを充填し、グルーガンを使用して先端のマイクロインジェクターに接続します。

2.ウイルス注射手術

  1. 目から首の後ろまでの正中線に沿って頭皮を切開し、頭蓋骨を露出させます。続いて、首の筋肉を切除して後頭骨を露出させます。骨の表面をH2O2 で30秒間拭き、乾いた綿棒で洗浄して皮下筋膜と結合組織を取り除きます(図1A)。
    注:このステップは、歯科用セメントを後頭骨に覆いやすくし、光ファイバーをより安定して固定するためのものです。
  2. 頭蓋骨を平らにします。
    1. X軸レベリング:冠状縫合糸のブレゲマ点から3.5 mm離れた2点に印を付け、2点を接続して線を形成します。この線の中点はゼロです。原点から3.5mm離れた骨面のZ軸差の絶対値は0.03mm≤する必要があります。
    2. Y軸レベリング:ラムドイド縫合糸のラムダ点から3.5mm離れた2点に印を付け、2点の中点を設定し、この中点をラムダ点に接続して線を形成します。この線の中点は別のゼロです。このゼロとX軸中に骨面が調整されたゼロとの間のZ軸差の絶対値は、0.03mm≤する必要があります。
  3. マーカーペンでウイルス注射の定位座標をマークします。PBN の場合: -1.1 mm 前後 (AP、Y 軸)、-5.45 mm 内側外側 (ML、X 軸)、-3.3 mm 背腹 (DV、Z 軸) (ブレグマをゼロ点とする)。NTS の場合: -0.35 mm AP、0.2 mm ML、-3.3 mm DV (後頭骨の最高点をゼロ点とする)。DMV の場合: -0.35 mm AP、0.0 mm (後頭骨の最高点)、-3.5 mm DV (後頭骨の最高点をゼロ点とする) (図 1B)。高速マイクロドリル(ドリル径0.8mm)を使用して、頭蓋骨の指定された部位を貫通し、脳表面を露出させます。その後、細い鉗子を使用して硬膜に優しく穴を開けて取り除き、ドリルで開いた開口部に生理食塩水を塗布して脳表面の水分を維持します。
  4. シングルボンドユニバーサル接着剤を頭蓋骨表面(穴あけ領域を除く)に塗布し、30秒間光にさらして硬化させます。強力な接着力を確保するために、シングルボンドユニバーサル接着剤を塗布する前に、頭蓋骨の表面を乾燥した状態に保つことが重要です。さらに、塗布中は筋肉に接着剤を付着させないようにする必要があります。
  5. マイクロインジェクターを定位装置の機械アームに取り付けます。250 nLのウイルス(rAAV-CaMKIIα-CRE-WPRE-hGH polyA)を充填します。針先が脳表面に接触したら、深さ(Z)を0に調整します。針を傍上腕核(PBN)内の標的部位まで下げ、35 nL/分の速度でPBN領域にウイルスを注入します。注射後、針を10分間所定の位置に保ち、6mm/分の速度で引っ込めます。続いて、洗浄のために生理食塩水を含むエッペンドルフチューブに針を浸します(図1C、D)。
    注:以下のすべてのウイルスの注射量は250 nLです。DMV は 100 nL16,17 です。
  6. 同じプロトコルを使用して、rAAV-CaMKIIα-DIO-ChrimsonR-WPREを孤立核(NTS)に注入し、rAAV-ChAT-GCamp6s-WPRE-hGH-polyAを迷走神経の背側運動核(DMV)に注入します(図1D)。すべてのウイルス力価は、1 × 1012 VG/mL≥です。

3. 光ファイバーインプラント手術

  1. 光ファイバーフェルールをオプトロードホルダーで固定し、定位装置の機械アームに取り付けます。DMVウイルス注射部位から約100μm上の位置に対応する移植座標を設定します(図1E、F)。
  2. 1〜3 gの歯科用セメントと1 mLの室温硬化レジンを均一になるまでブレンドします。光ファイバーフェルールの周囲と頭蓋骨表面に混合物を速やかに投与し、光ファイバーフェルールの上部の5mmを露出させたままにします。セメントが固まったら、ホルダーネジを緩め、ホルダーを持ち上げて取り外します(図1G)。
  3. 吸収性外科用縫合糸(6-0)を使用して、マウスの後頭頭皮を縫合します。マウスを定位フレームから取り外し、暖かい環境に置いて麻酔から回復します。動物が制限のない動きを示すと、4〜5匹のネズミが一緒に収容され、餌と水に自由にアクセスできるようにされた、清潔で広々としたケージに移されました。
    注:実験中に、より大きなケージはマウスの正常な動きに有益であり、体重を維持するために重要であることが観察されました。スペースの増加により、埋め込まれたファイバーとの偶発的な接触の可能性も減り、潜在的な損傷が最小限に抑えられます。体重25g以上のマウスでは、鍼治療により胃内圧に有意な変化が見られた。

4. バルーン挿入手術

  1. ウイルス発現のピーク(21〜28日)に、マウスを4〜5時間絶食します。続いて、1.25%トリブロモエタノール(0.1 mL / 10 g体重)の腹腔内注射 によって マウスを麻酔します。15分後、10%カルバメートエチル溶液(0.15 mL / 10 g体重)の腹腔内注射を投与します。つま先ピンチ反射がないことを確認して、麻酔の深さを評価します。
  2. 腹部とST36領域の髪を剃ります。温熱パッドの電源を入れ、体温を一定に保つために手術中は温熱パッドの上に置いたまま、温度を37°Cに保つように設定します。
  3. ラテックスバルーンをシリンジに接続し、空気を注入して、ラテックスバルーン(BS4 73-2787)に空気漏れがないことを確認します。
  4. 剣状突起の下に胃と十二指腸の一部を露出させます。十二指腸に長さ約0.3 cm、幽門の遠位0.5〜1 cmの小さな切開を行います。
  5. 十二指腸切開部から腸の方向に沿ってバルーンを胃に挿入し、結び目を幽門洞に配置します。
  6. 注射器の針を外し、5mLの純水を入れて空気を排出し、バルーンのもう一方の端を注射器に接続します。シリンジのルアーロックを上に引いてバルーンからガスを排出し、ルアーロックを下げて純水をバルーンに注入します。アセンブリを三方活栓と圧力トランスデューサーに接続します。

5. 胃内圧とカルシウムイメージングの同期記録

  1. Neurolog Digitimer Model、CED Micro1401-4、Inper Studio、マルチチャンネル光ファイバー記録システム、Inper Signalソフトウェア、およびSpike 2ソフトウェアをオンにします。Inperソフトウェア、カルシウム信号記録をSpike2ソフトウェアと光遺伝学的刺激装置によってトリガーするように設定し、Inperソフトウェアによるレーザー刺激とカルシウム信号の取得がSpike2ソフトウェアによる胃内圧記録と一致するようにします。
  2. バルーンに接続されているすべての三方活栓を開き、Neurologデジタイマーモデルの ZERO ノブを回して、ベースラインがポイント0に調整されているかどうかをSpike 2ソフトウェアで観察します。バルーン内の圧力を大気圧で均一にした後、胃内圧が15〜35 cm H2Oになるまでバルーンに純水を注入します。胃内圧とカルシウム信号の両方が安定した状態に達したら、DMVで胃内圧とカルシウム信号の60秒のベースラインを記録します(図2A)。

6. ST36での電気鍼治療とレーザー刺激

  1. 左ST36ツボに鍼(0.25mm×25mm)を挿入し、電気鍼治療装置(10Hz、1mA)に接続します。胃内圧とカルシウム信号の変化を記録しながら、電気鍼治療を60秒間行います。
  2. ベースラインの胃内圧とカルシウム信号が安定化した後、ファイバーを介して光遺伝学的刺激 (635 nm、5 ms、5 Hz、30 mW) を 60 秒間送達し、胃内圧とカルシウム信号の変化を監視します。
  3. 胃内圧とカルシウム信号のベースラインが再び安定したら、ST36 (10 Hz、1 mA) での電気鍼治療と光遺伝学的刺激 (635 nm、5 ms、5 Hz) を 60 秒間組み合わせ、胃内圧とカルシウム信号の変化を記録します。

7. ウイルス注射と繊維配置の組織学的検査

  1. 前述のプロトコルの完了後、マウスに生理食塩水を灌流し、直ちに心臓 を介して 4%パラホルムアルデヒドで固定します。ネズミの脳を収穫します。20%および30%のスクロース溶液を使用して勾配脱水を行い、急速凍結包埋剤で包埋した後、切片します。脳スライスとマウスの脳マップを比較し、ウイルス注入と光ファイバー移植の位置が正確であるかどうかを観察します。ウイルス注射とファイバーインプラントの正確な位置決めにより、胃内圧とカルシウムシグナルデータの妥当性が維持されました(図1H、I)。

8. データ分析

  1. Inper Data Analysisソフトウェアを使用してカルシウムシグナルデータを分析し、Spike2ソフトウェアを使用して胃運動性データを分析します。刺激時(60秒)と刺激前(60秒)のカルシウム信号または胃運動振幅の違いを比較して、胃運動性およびカルシウム信号に対するさまざまな刺激の調節効果を観察します。 図 2 に示されているすべてのデータは、元のデータ グラフです。

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結果

ウイルスをマウスの傍上腕核(PBN)、孤立核(NTS)、および迷走神経の背側運動核(DMV)に注射し、DMVにファイバーを移植しました(図1A-G)。ウイルス発現のピーク期間中、ST36 での電気鍼治療と光遺伝学的刺激の後に、DMV 内の胃内圧とカルシウムシグナルの変化が記録されました。この研究の目的は、PBNGlu-NTS Glu-DMV ChAT 神経回路に関連している可能性のある胃運動に対する ST36 での電気鍼治療と光遺伝学的刺激の調節効果を観察することです。

ベースライン条件下では、胃内圧とカルシウムシグナルのピークは、記録された180秒以内に有意な変化を示さなかった(図2A)。ST36 に光遺伝学的刺激または電気鍼治療を適用すると、胃内圧のピークとカルシウムシグナルの両方に顕著な増加が見られました。しかし、カルシウムシグナルはST36で電気鍼治療よりも...

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ディスカッション

鍼治療の中心的な科学的探求は、自律神経のツボ刺激による標的臓器の調節に関するものです。Q. Ma が示唆した調査結果は、遠隔臓器機能調節に対する鍼治療の影響は、交感神経および/または副交感神経経路、特に胃腸疾患および全身性炎症に関連する経路を活性化する体性自律神経反射から生じることを示唆しました18。それにもかかわらず、現存する研究は主に末梢神経の調査または孤立した脳領域に集中しています19,20。個々のニューロンは、特定の投影関係を持つ神経回路で連携して情報を処理します21。これらの神経回路は、鍼治療による標的臓器の調節の根底にあるメカニズムを解明する上で極めて重要です。しかし、鍼治療に反応して核内のニューロンの活性化を記録したり、鍼治療が内臓機能に及ぼす影響を評価したりするだけでは、ツボ刺激、自律神経調節、および標的臓器調節との関連性を直接確立するには不十...

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開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金(第82174518号、82474661)、中央公共福祉研究所基礎研究費(ZZ-2023008)、および中国中医科学院の科学技術革新プロジェクト(CI2021A03402)の資金提供を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ウイルス
rAAV-CaMKIIα-CRE-WPRE-hGH ポリA (AAV2/9)ブレインVTAカタログ#PT-0020
rAAV-CaMKIIα-DIO-クリムソンR-WPRE(AAV2/9)ブレインVTAカタログ#PT-12637
rAAV-ChAT-GCamp6s-WPRE-hGH-ポリA (AAV2/9)ブレインVTAカタログ#PT-10973
その他
1 & ムー;Lマイクロインジェクターハミルトン80135
3M EPSPシングルボンドユニバーサル接着剤デンタルワールド公式41269
鍼治療針中燕泰和0.25/13秒
CEDマイクロ1401-4CED(イギリス)1401-4
歯科用セメント/常温硬化樹脂ヤマハチデンタル該当なし
細い鉗子RWDのF11028-13
試験管世界の精密機器504949
ハンス-200AHANS研究所ハンス-200
インパーシグナル(ソフトウェア)インパー該当なし
インパースタジオ(ヴィーナス)インパーB1502
ラテックスバルーンハーワード装置BS4 73-2787
マルチチャンネル光ファイバ記録システム(Vista Pro)インパーR5268
ニューロログデジチマーモデル デジタイマーNL900D
光ファイバーフェルール インパーV8475
スパイク2(ソフトウェア)CED(イギリス)該当なし
定位固定装置(座標計算機付き)デビッド・コップ・インストゥルメンツKOPF 942
トリブロモエタノールシグマT48402
トリブロモエタノールシグマ T48402

参考文献

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