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研究記事

心筋虚血再灌流障害におけるNRG1/ErbB4シグナル伝達の保護的役割

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DOI:

10.3791/68671

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2025年8月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiology, First Hospital of Nanping City affiliated to Fujian Medical University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、酸化ストレスとアポトーシスシグナル伝達経路を評価することにより、虚血再灌流障害のラットモデルにおけるNRG1 / ErbB4シグナル伝達の心臓保護効果を評価するプロトコルを提示します。

要約

心筋虚血再灌流障害 (MIRI) は、心血管疾患の管理に対する実質的な障害として持続します。MIRI の病態生理学は複雑で、酸化ストレス、カルシウム過剰、炎症、アポトーシスが関与します。NRG1/ErbB4 シグナル伝達経路は、心臓の酸化ストレス反応の調節に関与しており、フリーラジカルによって引き起こされる細胞損傷を軽減する可能性があります。この研究は、心筋虚血再灌流 (MIRI) 損傷のラット モデルにおいて、NRG1/ErbB4 経路が防御を与える分子メカニズムを解明することを目的としていました。30匹の成体雄のSprague-Dawleyラットを、対照、偽手術、MIRI、組換えNRG1、およびAG1478の5つのグループにランダムに割り当てたラットMIRIモデルが確立されました。心臓組織中のNRG1濃度はELISAによって測定され、p-ErbB4および総ErbB4タンパク質レベルはウェスタンブロットによって評価されました。心筋細胞のアポトーシスと活性酸素種(ROS)レベルをフローサイトメトリーで評価しました。MIRI群では、NRG1レベルは対照群および偽手術群と比較して有意に低下しました(p < 0.05)。組換えNRG1治療は、p-ErbB4/ErbB4発現比(p < 0.05)の増強とともに、心臓組織におけるNRG1レベルの著しい増加をもたらしました。AG1478 グループは、組換え NRG1 グループと比較して、NRG1 レベルが低く、p-ErbB4/ErbB4 比が低下しました (p < 0.05)。アポトーシスとROSレベルに関しては、MIRI群は対照群と偽手術群よりも有意に高い率を示しました(p < 0.05)。組換えNRG1治療は、心筋細胞のアポトーシスとROSレベルを大幅に低下させましたが(p < 0.05)、AG1478もこれらの影響を弱めましたが、程度は低かったです。NRG1/ErbB4シグナル伝達経路はラットのMIRIにおいて極めて重要な保護的役割を果たす外因性 NRG1 の補給は、心臓内の NRG1 レベルを効果的に上昇させ、ErbB4 シグナル伝達経路を活性化し、心筋細胞のアポトーシスを減少させ、ROS レベルを低下させ、それによって MIRI 誘発性損傷を軽減します。

概要

心筋虚血再灌流障害 (MIRI) は、心血管疾患の管理における重要な課題です1。心筋梗塞の治療には虚血性心筋への血流の回復が不可欠ですが、再灌流自体が心臓組織の損傷を悪化させ、治療効果を制限する可能性があります。MIRIの根底にあるメカニズムは複雑で、酸化ストレス、カルシウム過剰、炎症反応、アポトーシスなど、さまざまな病態生理学的プロセスが含まれます2,3,4。

神経成長因子 1 (NRG1) とその受容体 Erb-B2 受容体チロシンキナーゼ 4 (ERBB4) は、心臓の生理学と病理学において極めて重要な役割を果たします。細胞外リガンドであるNRG1は、ErbB4受容体と相互作用して、心臓の発達、構造的完全性の維持、および心臓損傷への反応に不可欠なシグナル伝達経路のカスケードを活性化します5。新たな証拠は、心臓病におけるNRG1/ErbB4シグナル伝達経路が果たす役割を強調しています。心筋虚血再灌流の条件下では、NRG1 の発現と機能が変化する可能性があります6。以前の研究では、NRG1 が ErbB4 を活性化することにより、心筋細胞の生存を促進し、過剰なアポトーシスを阻害することが示唆されています。さらに、NRG1/ErbB4 シグナル伝達経路は、心臓の酸化ストレス反応を調節し、フリーラジカルによって引き起こされる細胞損傷を軽減する可能性があります。したがって、MIRIにおけるNRG1 / ErbB4シグナル伝達経路の機能を解明することは、この損傷の生物学的基盤を理解し、新しい治療戦略を開発するために不可欠です7,8。

この研究では、NRG1/ErbB4 シグナル伝達経路が MIRI で保護的な役割を果たしていると推測しています。そこで本研究では、MIRIにおけるNRG1/ErbB4シグナル伝達経路のメカニズムを体系的に調査するために、心筋虚血再灌流のラットモデルを構築した。NRG1の濃度を調節し、ErbB4活性化状態、心筋細胞のアポトーシス率、酸化ストレスレベルの変化を観察することにより。本研究では、NRG1/ErbB4シグナル伝達経路がMIRIにおいて保護効果を発揮する分子機構を明らかにしようと試みる。この研究の新規性は、心筋虚血再灌流障害におけるNRG1/ErbB4シグナル伝達経路の重要性を明らかにし、この経路に基づく心臓病の治療戦略に新たな視点を提供することにあります。

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プロトコル

実験動物
生後8週、体重180〜200 gの成体雄スプレイグ・ドーリー(SD)ラット30匹を商業販売業者から入手した。これらのラットは、実験の1週間前に特定の病原体のない条件下で収容されました。実験は南平第一病院倫理委員会(NO.NPSY202208010)から承認を受けました。

心筋虚血再灌流障害の動物モデル
ラットに、50 mg/kgの用量で3%ペントバルビタールナトリウムを腹腔内注射して麻酔した。反射がないことを確認した後、動物を仰臥位に置き、首と胸の部分を剃り、75%エタノールで消毒しました。正中線の頸部切開 (~2 cm) を行って気管を露出させ、その後、手術中の気道開存性を維持するために 16 G カテーテルを使用して経口挿管を行いました。続いて、左大胸筋を注意深く解剖して、第3および第4肋間腔を露出させた。これらの空間の間に切開を行って開胸術を行い、心膜を開いて心臓を完全に露出させました。虚血を誘発するために、左前下行冠動脈 (LAD) を 8-0 を使用して結紮しました。ナイロン縫合糸。LAD と結紮糸の間にポリエチレン チューブ (PE-10) を挿入して、可逆的な閉塞を可能にしました。虚血は 45 分間維持され、心筋の白通しと ECG の変化によって視覚的に確認されました。再灌流は結紮糸を解放することによって開始され、血流が 3 時間再開されるようにしました。結紮は45分後に除去されました。

実験的グループ化
ラットをランダムに5つのグループに割り当てました(各n = 6)。(1) 対照群: ラットは外科的介入や治療を行わずに標準治療を受けました。(2) 偽手術群:ラットは結紮を行わずに開胸術と左前下行冠動脈(LAD)の通路を通し、外科的対照として行った。(3)MIRI群:ラットに心筋虚血再灌流障害導入を行い、ビヒクルコントロールとして生理食塩水を胃内投与した。(4) 組換えNRG1群:ラットに、開胸術の30分前に組換えヒトNRG1(rh-NRG1)を5 mg/kgの用量で静脈内注射し、続いてMIRI処置を行った。(5)AG1478群:開胸術の30分前に、ラットにrh-NRG1(5 mg/kg)とErbB受容体キナーゼ阻害剤であるAG1478(20 mg/kg)を併用して静脈内投与し、MIRI処置を受けた。

酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)
動物は、ペントバルビタールナトリウム(150 mg / kg)の腹腔内注射によって安楽死させました。再灌流直後に心臓組織を採取し、適切な量の氷のように冷たいPBSで氷上で均質化しました。次に、ホモジネートを1200 x g で4°Cで10分間遠心分離し、上清を分離しました。上清中のNRG1の濃度は、製造元の指示に正確に従って、市販のNRG1 ELISAキットを使用して定量しました。簡単に言えば、サンプルと標準をELISAプレートウェルに添加し、推奨時間室温でインキュベートした後、洗浄して検出抗体を添加しました。マイクロプレートリーダーを使用して指定された波長で吸光度を測定し、標準曲線に基づいてNRG1レベルを計算しました。サンプル量は100μL、抗体の希釈は1:100、吸光度測定の波長は450nmに設定されました。

ウェスタンブロット分析
麻酔をかけたラットから心臓組織を切除し、氷冷のPBSですすぎ、残留血液を除去しました。各心臓について、約0.5 gの左心室組織を計量し、新たに調製したRIPA溶解バッファー500 μLに入れました。次に、組織を完全に溶解するまで機械式組織グラインダーを使用して氷上で均質化し、続いて氷上で30分間インキュベートして、完全なタンパク質抽出を確実にしました。ライセートを12,000 × g で4°Cで15分間遠心分離し、破片を除去しました。タンパク質濃度は、BCAアッセイキットを使用して測定されました。同量の総タンパク質(例えば、レーンあたり30 μg)をロードし、SDS-PAGEによって分離しました。次に、タンパク質を100 Vの湿式転写システムを使用してポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜に90分間転写しました。膜を、0.1%トゥイーン-20(TBST)を含むトリス緩衝生理食塩水中の5%脱脂粉乳で室温で1時間ブロックしました。続いて、膜をリン酸化ErbB4(p-ErbB4)および総ErbB4に対する一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートし、それぞれ1:1000に希釈した。洗浄後、メンブレンを西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体と室温で1時間インキュベートした。タンパク質バンドは、強化化学発光(ECL)基質を使用して視覚化され、ゲルイメージングシステムを使用してキャプチャされました。ImageJソフトウェアを使用してバンド強度を定量化し、総ErbB4に対するp-ErbB4の比率を計算してリン酸化レベルを評価しました。

フローサイトメトリー
心筋細胞のアポトーシスは、フローサイトメトリーによって評価されました。心臓組織を細かく刻み、コラゲナーゼII型(1 mg / mL)とプロテアーゼ(トリプシンなど、0.25%)の混合物を37°Cで20〜30分間穏やかに攪拌して酵素的に消化しました。酵素消化は、同量のウシ胎児血清 (FBS) を添加することによって終了しました。細胞懸濁液を70μmのナイロンメッシュでろ過し、300× g で4°Cで5分間遠心分離して細胞を回収した。細胞ペレットを結合バッファーに再懸濁し、メーカーのプロトコルに従ってアネキシンV-FITCおよびヨウ化プロピジウム(PI)とインキュベートしました。暗所で室温で15分間インキュベートした後、サンプルを直ちにフローサイトメトリーで分析しました。初期のアポトーシス細胞はアネキシンV陽性およびPI陰性として同定されましたが、後期アポトーシスまたは壊死細胞は両方のマーカーで陽性でした。アポトーシス率を定量化し、実験群間で比較しました。ゲート戦略は、クロスゲート/長方形のゲート設定を採用しています。オンマシン検出を行う際には、クロスゲートを点線として設定し、データスクリーニングの一貫性を確保するためにすべてのパラメータを適用しました。細胞濃度に応じて流量を調整し(1000細胞/秒に維持)、低速サンプルローディングでノズルの目詰まりを回避できます。

活性酸素(ROS)レベルの検出
心筋細胞を心臓組織から単離し、続いて300 × g で5分間遠心分離し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄しました。次に、細胞を10 μM 2',7'-ジクロロフルオレセインジアセテート(DCFDA)色素とともに、製造元の指示に従って、37°Cで暗所で30分間インキュベートしました。染色後、細胞をPBSで2回洗浄し、余分な結合していない色素を除去しました。細胞内ROSレベルは、フローサイトメトリーによって直ちに測定され、DCFDAの酸化時に放出される蛍光強度が検出されました。各サンプルの平均蛍光強度 (MFI) は、FlowJo ソフトウェアを使用して定量化され、実験グループ間の ROS レベルが比較されました。ゲーティング戦略は上記のとおりです(フローサイトメトリーセクション)。

統計分析
データ分析は、標準偏差 (SD) の平均値として表示された SPSS ソフトウェアを使用して実施±。複数のグループを比較するために Tukey の事後検定による一元配置分散分析を実行し、ペアワイズ比較にはスチューデントの t 検定を使用しました。0.05

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結果

NRG1はMIRI誘発性心筋細胞アポトーシスに対して保護効果を発揮する
フローサイトメトリー分析では、対照群と偽群の両方と比較した場合、MIRI 群のアポトーシス率が顕著に上昇していることが示されました (P < 0.05)。組換えNRG1群とAG1478群はどちらも、MIRI群と比較してアポトーシス率の有意な低下を示しました(P < 0.05)。対照的に、組換えNRG1群は、AG1478群と比較してアポトーシス率の低下を示しました(P < 0.05)(図1 および 表1)。これらの発見は、NRG1 が MIRI 誘発性心筋細胞アポトーシスに対して保護効果を発揮することを示しています。

NRG1はMIRIによって誘発される酸化ストレスを緩和します
フローサイトメトリー分析により、対照群と偽群の両方と比較して、MIRI 群の心筋 ROS レベルが有意に上昇していることが明らかになりました (P ...

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ディスカッション

虚血性心臓組織への灌流の再確立が逆説的に心筋損傷を悪化させる可能性があることを考えると、MIRI は心血管疾患の管理において重大な障害をもたらし続けています。MIRI の発生は多因子性であり、酸化ストレス、カルシウム過剰、炎症反応、およびミトコンドリア機能障害が関与します 9,10。

細胞外リガンドであるNRG1は、心筋細胞表面のErbB4受容体に結合することにより、下流のシグナル伝達経路を活性化します11,12。p-ErbB4 は受容体活性化の特徴であり、PI3K/Akt や MEK/ERK などの複数の下流シグナル伝達経路をさらに活性化できます。生理学的状態では、NRG1 と ErbB4 の相互作用により、心筋細胞の生存、増殖、分化、代謝の調節に不可欠な PI3K/Akt や M...

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開示事項

著者には宣言すべき利益相反はありません。

謝辞

本研究は、福建省自然科学基金(助成番号.2024J011604,2023J011877)および福建省囲炉裏委員会青少年研究プロジェクト(助成番号.2019-9-25)の支援を受けました。

著者の貢献:
Maozhi Huang は、研究プロジェクトの構想と設計を主導し、実験プロトコルを計画および詳細に説明し、主要な実験に参加し、原稿の初稿を作成しました。Jianping Zheng は、デザイン、データ収集、原稿の起草など、研究全体に等しく貢献しました。Xianlu Cheng は研究設計に貢献し、サンプルを収集し、データを分析しました。Chaoqun You は原稿の執筆と構成を支援しました。Ziguo Chen はデータをチェックし、方法と材料セクションの改善を支援しました。Ling Jiangは、研究プロセス全体を通じて学術的な管理と指導を提供しました。Shanghua Xu は、プロジェクトの全体的な方向性を指導し、リソースを調整し、最終原稿をレビューおよび修正しました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
AG1478バイオラボテクノロジーWD102925介入薬AG1478
アネキシン V-FITC/PI アポトーシス検出キットメイルンMA0220フローサイトメトリーアポトーシス
BCAプロテインアッセイキットメイルンビオMA0082-2WBタンパク質の定量
化学発光イメージングシステムバイオ・ラッド(米国)ケミドックタッチウェスタンブロットイメージング
塩酸シアメマジンHuamuアニマルヘルス20220601動物造形用麻酔薬
ECL検出キットメイルンビオMA0186-1WB化学発光
ERbB4プロテインテック19943-1-APのWB一次抗体
フローサイトメーターBDのFACSカリバーフローサイトメトリーのアポトーシス検出
GAPDHプロテインテック60004-1-IGWBローディングコントロール抗体
HRP結合ヤギ抗マウスIgG(H+L)プロテインテックSA00001-1免疫組織化学
HRP結合ヤギ抗ウサギIgG(H+L)プロテインテックSA00001-2免疫組織化学
マイクロプレートリーダー熱K3ELISA検出
PAGEゲル調製キット 15%メイルンビオMA0384WB電気泳動
p-ERbB4親近感AF3445WB一次抗体
染色済みタンパク質マーカーメイルンビオMA0342WB電気泳動
ラットニューレグリン-1(NRG-1)ELISAキットメイミアンMM-61434R2ELISA検出
活性酸素種(ROS)アッセイキットメイルンMA0219WBアッセイ
rhNRG1バイオラボテクノロジーWD091127介入薬NRG1
RIPA溶解バッファーメイルンビオ MA0151       ウェスタンブロットのタンパク質抽出
SDS-PAGE ローディングバッファ (5x)ビヨタイムP0015LWB電気泳動
ドデシル硫酸ナトリウムシグマ151-21-3WB電気泳動
スータイ50ヴィルバック(フランス)8X22A動物造形用麻酔薬
縦型タンパク質電気泳動システムバイオ・ラッド(米国)パワーパック200ウェスタンブロット電気泳動

参考文献

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