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タンパク質と糖鎖の相互作用の探索:核磁気共鳴の進歩

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DOI：

10.3791/68674

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2025年8月26日

 ,  , 
1Institute of Medical Biochemistry Leopoldo de Meis (IBqM), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 2National Center for Structural Biology and Bioimaging (CENABIO), Federal University of Rio de Janeiro (UFRJ), 3Laboratory of Connective Tissue, Clementino Fraga Filho University Hospital

この記事について

サマリー

このNMRベースのプロトコルは、シアノビリン-NおよびD-マンノースを使用して弱いタンパク質-糖鎖相互作用を調査します。リガンドとタンパク質の検出方法を組み合わせて、結合部位をマッピングし、アロステリック効果を検出し、遭遇複合体を同定します。このアプローチは、サンプル前処理とデータ分析の概要を示し、糖鎖特異的診断と認識メカニズムに役立つ構造的および動的な洞察を提供します。

要約

タンパク質と糖鎖の相互作用は、多くの生物学的プロセスの中心であり、感染症、炎症性、および腫瘍性疾患の診断戦略の有望な標的としてますます認識されています。ただし、これらの相互作用を特徴付けることは、特に弱く一時的な場合、技術的に依然として困難です。核磁気共鳴 (NMR) 分光法は、生理学的に近い条件下でそのような相互作用を研究する上で独自の利点を提供し、構造的側面と動的側面の両方について原子分解能の洞察を提供します。本研究では、マンノース特異的レクチンシアノビリン-Nと単糖類D-マンノースをモデル系として用いて、低親和性タンパク質-糖鎖相互作用を調査するように設計された統合NMRプロトコルを提示します。このプロトコルは、リガンドおよびタンパク質ベースのNMRアプローチを組み合わせて、結合部位を包括的にマッピングし、潜在的なアロステリック効果や複合体への遭遇を含む微妙な結合イベントを検出します。プロトコルの重要なステップには、慎重なサンプル前処理、濃度の正確な制御、データの再現性と信頼性を確保するためのスペクトル標準化が含まれます。溶液中のNMRは、他の技術ではアクセスできないことが多い過渡的な相互作用の検出を可能にします。弱い相互作用は生命にとって不可欠ですが、低親和性複合体はシグナル伝達や細胞間コミュニケーションなどの多くの重要な生物学的機能に関連しているにもかかわらず、文献には高親和性複合体に偏っています。この技術は、タンパク質-糖鎖認識を調査するための強力なプラットフォームを提供し、糖鎖特異的相互作用に基づいて新しい診断マーカーを特定するための貴重なツールとして役立つ可能性があります。

概要

タンパク質と糖鎖の相互作用は、細胞間認識、免疫応答調節、病原体と宿主の相互作用など、幅広い生物学的プロセスの基礎です1,2。これらの分子相互作用は非常に特異的で動的であり、生理学的および病理学的メカニズムの両方において重要な役割を果たします3,4,5。このような相互作用の典型的な例は、糖鎖を特異的に認識して結合するタンパク質であるレクチンで発生します。たとえば、シアノビリン-N(CVN)は、高マンノースオリゴ糖と高親和性で相互作用する能力があるため、実験モデルとして広く研究されています5,6,7。

レクチンに加えて、インテグリンなどの多くのグリコシル化タンパク質も、認識と細胞シグナル伝達において重要な役割を果たしています。インテグリンは、サブユニットのグリコシル化を頻繁に受ける膜貫通受容体であり、糖鎖5、8、9、10を含むリガンドに対する安定性と親和性に影響を与えます。しかし、糖鎖の固有の不均一性と柔軟性により、これらの相互作用の構造特性評価は依然として困難であり、従来の構造生物学的アプローチを複雑にしています。これに関連して、溶液中のこれらの相互作用を捕捉できる高度な方法論の開発は、この分野、特に糖鎖生物学にとって非常に価値があります11,12。

核磁気共鳴 (NMR) 分光法は、タンパク質とリガンドの相互作用を原子レベルで調査するための強力なツールとして登場しました。X 線結晶構造解析やクライオ電子顕微鏡などの他の技術とは異なり、NMR を使用すると、生理学的に近い条件下での生体分子相互作用の研究が可能になり、構造とダイナミクスの両方についての洞察が得られます。この柔軟性により、研究者はpH(通常は4.0〜8.0)、イオン強度(例:0〜500 mM NaCl)、温度(通常は273〜330 K)などの環境パラメータを調節できるため、タンパク質-糖鎖複合体の特異性に合わせて条件を調整できます。さらに、NMRは、タンパク質-糖鎖認識イベントに特徴的であることが多い一過性および弱い相互作用の分析に特に有利です13,14。

タンパク質とリガンドベースのアプローチの両方を利用して、タンパク質と糖鎖の相互作用を調査するために、いくつかのNMR技術が採用されています。タンパク質の観点からは、異核単一量子コヒーレンス(HSQC)滴定は、リガンド添加時の化学シフト摂動を監視することにより、結合部位をマッピングするために広く使用されています。緩和分散実験は、マイクロからミリ秒の時間スケールで発生する立体配座および化学交換プロセスの検出を可能にし、糖鎖認識の動的側面への洞察を提供します15,16。これらのタンパク質ベースの技術では、通常、タンパク質の安定性と標識効率に応じて、50 μM〜2 mMの範囲のサンプル濃度が必要です17,18。

リガンドベースのNMR技術は、結合中の糖鎖の変化に焦点を当てることで補完的な情報を提供します。飽和移動差(STD-NMR)は、タンパク質19,20と密接に接触しているリガンド領域のNMRシグナルを選択的に飽和させるため、認識に関与する糖鎖エピトープを同定するのに特に有用です。勾配分光法(WaterLOGSY)21,22および転移核オーバーハウザー効果分光法(Tr-NOESY)を介して観察された水配位子は、相互作用中のリガンド結合および立体配座変化を評価するための追加の手段を提供します23。さらに、Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)緩和実験は、従来の方法では検出が困難な弱い一過性の相互作用を特定するのに役立ちます24。リガンドベースの実験は、多くの場合、10〜50μMのタンパク質濃度で行われ、混合時間および飽和パラメータ25の最適化が必要になる場合があります。特に、これらの方法は、糖鎖の溶解度が低いか、小さな配位子を扱う場合の信号対雑音比が低いことによって制限される可能性があります。

これらのNMR法は、タンパク質と糖鎖の相互作用の構造的および動的特性を解明するための包括的なフレームワークを提供します。感度と同位体標識戦略の継続的な進歩により、この技術は糖鎖生物学においてますます不可欠になりつつあり、医薬品開発やバイオマーカー発見への応用の可能性を備えた分子認識メカニズムに新たな視点を提供します。それにもかかわらず、これらのアプローチの成功は、サンプルの均一性、糖鎖の複雑さ、およびNMR信号を広げたり、解釈を妨げたりする可能性のある柔軟または無秩序な領域の存在などの要因に依存します26。NMRは、構造生物学における大きな課題である過渡現象を研究するための強力な方法です。

CVNは、ナノモル親和性を持つ高マンノースオリゴ糖に存在するα(1,2)結合マンノシル残基を認識します27,28,29。ただし、単糖類のD-マンノースをよく認識しません。本研究では、NMRが過渡相互作用の理解にどのように強力であるかを説明する方法として、CVNとD-マンノースの相互作用を研究しました。

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プロトコル

注:細菌培養および緩衝液調製を含むすべてのステップは、施設のバイオセーフティプロトコルに従って実行してください。個人用保護具 (PPE) を使用し、オープン培養物や化学物質を取り扱う場合は、必要に応じてバイオセーフティ キャビネットまたは化学ヒューム フードで作業してください。

1. シアノビリン-Nの発現

  1. pET26aベクターに挿入されたCVN遺伝子をコードするプラスミドで 大腸 菌BL21細胞を形質転換します。
  2. カナマイシン(50 μg/mL)、0.5%(w/v)グルコース、および1.6 mM MgSOを添加した1 Lのスーパーブロス(トリプトン32 g、酵母抽出物20 g、NaCl 5 g/L)で細胞を培養します4。37°Cで~250 rpmの連続攪拌下でインキュベートします。
  3. 15N標識CVNを産生するには、唯一の窒素源として15NH4Clを使用して、修飾されたM9ミニマル培地で細胞を増殖させます。
    1. 64 g/LのNa2HPO4、15 g/LのKH2PO4、2.5 g/LのNaCl、5 g/LのNH4Clを含む200 mLの滅菌5x M9塩溶液を混合して、1 LのM9ミニマル培地を調製します。
    2. 2 mLの1 M MgSO4 (0.22 μmフィルター滅菌)、0.1 mLの1 M CaCl2 (0.22 μmフィルター滅菌)、および4 gのグルコース(最終濃度0.4%、滅菌蒸留水に溶解し、0.22 μmフィルター滅菌)を加えます。
    3. 滅菌蒸留水で最終容量を1Lにします。
      注:アミノ酸やビタミンなどのサプリメントは、必要に応じて追加できます。
  4. 約1.2の光学密度(OD600)に達するまで培養物を監視します。次に、イソプロピル-ベータ-D-チオガラクトピラノシド(IPTG)を最終濃度1.0 mMまで添加して、タンパク質発現を誘導します。
  5. 37°Cで誘導後20時間インキュベートします。
  6. 7,000 × g で 4 °C で 10 分間遠心分離して細胞を回収します。
  7. ペリプラズム画分を次のように単離します。
    1. 細胞ペレットを20%スクロースと1 mM EDTAを含む0.4容量の30 mM Tris-HClバッファー(pH 8.0)に再懸濁し、室温で10分間振とうしながらインキュベートします。
    2. 10,000 × g で 4 °C で 10 分間遠心分離します。
    3. 得られたペレットを0.4容量の氷冷蒸留水に再懸濁し、氷上で10分間振とうしながらインキュベートします。
    4. 10,000 × g で 4 °C で 10 分間再度遠心分離します。
    5. ペリプラズム画分に対応する上清を採取し、タンパク質抽出を行います。
      注:すべてのバッファーには、タンパク質の分解を防ぐためにプロテアーゼ阻害剤カクテルが含まれている必要があります。

2. NMR実験

注:すべての実験は、298Kで 1H / 15N / 13Cトリプル共鳴逆検出プローブ( 材料表を参照)を使用して14.1 Tで取得しました。

  1. リガンドベースの実験
    1. サンプル前処理
      1. CVNを含むサンプルとCVNを含まないサンプル(リガンドのみのコントロール)の2つのサンプルを準備します。各サンプルには、50 mM NaCl を含むリン酸ナトリウム緩衝液 (pH 7.4) に 600 μL の 80 μM CVN が含まれています。
      2. D-マンノースを最終濃度4 mMまで添加します。
      3. 各サンプルに5%(v / v)D2Oを加えます。
      4. サンプルを5 mm NMRチューブに移します。
      5. タンパク質に対してリガンドの50倍のモル過剰を使用します。
        注:通常、10倍から1000倍の範囲のリガンド過剰が推奨され、小さなタンパク質にはそれより低い過剰が好まれます。
    2. D-マンノース割り当てのためのスペクトル取得
      1. 標準パルスシーケンスを使用して、2D TOCSYおよび2D 1 H-13C HMBCスペクトルを取得します。
        2D TOCSY:水抑制のための励起スカルプティングによる位相感応全相関分光法(TOCSY)(DIPSI2ESGPPH)。
        2D HMBC:勾配選択および非デカップリング取得(HMBCGPNDQF)による 1 H-13C異核多重結合相関。
        注:これらの実験は、D-マンノースの割り当てを目的として実施されましたが、化学シフトの割り当てはこの研究の範囲外であるため、示されていません。
    3. リガンドの化学シフト摂動(CSP)によるリガンド結合のマッピング
      1. ¹H-¹³C HSQCスペクトルのサンプル調製および取得には、50 mM NaClおよび5%D2Oを含むリン酸ナトリウムバッファー(pH 7.4)中のD-マンノースの4 mM溶液を調製します。溶液を2つのサンプルに分けます:1つは80 μM CVNともう1つはCVNなし(リガンドのみの参照)。
        注: これらのスペクトルは、CVN との相互作用時に D-マンノースの CSP を決定するために使用されます。
      2. 1 H-13C HSQC 取得パラメータの設定には、標準パルスシーケンス HSQCETGPSI (勾配選択と感度強化 1 H-13C HSQC) を使用します。取得のために以下のパラメータを設定します。
        時間領域(TD):1024×128の複素点(¹H×¹³C次元)
        スペクトル幅(SW):¹Hで10.0171 ppm(6009.615 Hz)、¹³Cで80 ppm(12069.106 Hz)
        キャリア周波数:¹Hで4.7ppm、¹³Cで75ppm
        - スキャン数: 448。
      3. 次の式を使用して CSP を計算します。
        figure-protocol-1
        ここで、 figure-protocol-2 と figure-protocol-3 は、CVN(図1A、赤でラベル付け)と遊離Dマンノース(図1B)の存在下でのD-マンノースの化学シフトの違いを表します。
    4. 飽和移動差(STD)によるリガンド結合のマッピング
      1. 新しいデータセットを作成し、STD-NMR実験のパラメータを設定します。2 つの実験戦略を適用できます: (i) 信号対雑音比を最適化するための異なる飽和周波数のスクリーニング。(ii)蓄積を評価するために、飽和周波数を固定し、飽和時間を変化させます。
      2. zgprパルスシーケンスを使用して1D¹H NMR実験を設定します。分光計を¹Hに調整し、シミングを実行し、90°のハードパルス(たとえば、-10.6dB減衰で~10μs、~11.482Wに相当)を測定します。
      3. ¹H キャリア周波数を約 4.7 ppm に中央に配置し、水信号に対応します。
      4. STDDIFFESGP.3パルスシーケンスを選択し、次のように取得パラメータを設定します。
        サンプルの要件に応じてスペクトル幅を設定します。
        スキャン間遅延(d1)を4秒に設定します。
        目的の実験に基づいて飽和時間(d20)を定義します。
        オフ共鳴飽和周波数(-40 ppm)とオン共鳴周波数を含むFQ2LISTをロードして、タンパク質シグナルのみを飽和させます。
        注:共鳴周波数はタンパク質プロトンに対応し、直接飽和を避けるためにリガンド信号から少なくとも1000Hz離れている必要があります。
      5. 次のオン共振飽和周波数をテストして、最適な条件を決定します:-0.59 ppm、0.73 ppm、および8.1 ppm( 図2Aを参照)。
        注:0.73 ppmは、最高のS/N比を提供するため、オン共振飽和周波数として選択されました。この周波数を使用して、STD増幅因子(A STD)を飽和時間の関数として定量化しました。この目的のために、STDスペクトルを異なる飽和時間(0.5、1、1.5、2、2.5、3、および4秒)で取得して、STDビルドアップ曲線を構築しました(図2B)。次に、対応するASTD 値を飽和時間の関数としてプロットし(図2C)、タンパク質へのリガンド水素の時間と近接性に比例する飽和移動の効率を評価できるようにしました。性病 因子は次のように定義されます。
        figure-protocol-4
        ISTD はオン共鳴スペクトルとオフ共鳴スペクトル間の信号強度の差、I0はオフ共鳴スペクトルの信号強度、[L]Tは総リガンド濃度、[P]はタンパク質濃度です。この正規化により、濃度効果が考慮され、さまざまな実験条件間での比較が可能になります。STDは、スピン拡散とゆっくりとした分子タンブリングに依存して、タンパク質から結合したリガンドに飽和を効率的に伝達します。より大きなタンパク質(遅いタンブリング)は、タンパク質内の磁化のより効率的な飽和と広がりを可能にします19,30,31,32。
      6. スキャン回数(ns)を64に設定し、実験l4(ループ4)を平均します。
      7. スキャンの総数を次のように計算します:総スキャン数= ns×l4。スペクトル幅 (SW) が 10.0171 ppm (6,009.615 Hz) の直接次元 (TD) で 32,768 個の複素点を使用します。
      8. スキャン間遅延(d1)を4秒に、取得時間(AQ)を2.7262976秒に設定します。総緩和遅延はd1 + AQに等しくなります。
      9. 飽和パルスを次のように構成します。持続時間50ミリ秒。形状ガウス(p42);成形プログラム9(SP9) で 制御。
      10. T1ρフィルターを含むSTDパルス配列バリアントを使用して、残留タンパク質シグナルを抑制します。タンパク質の分子量に基づいてスピンロック時間(d29)を設定します。大きなタンパク質の場合は、より短いスピンロック時間(~20 ms)を使用し、より小さなタンパク質の場合は、より大きい(>40ミリ秒)を使用します。
        注:すべてのSTDスペクトルは599.93 MHz(BF1)で取得されました。d29の調整は、リガンドシグナルの完全性を維持しながらタンパク質のバックグラウンドを最小限に抑えるために重要です。必要に応じて、このパラメータを経験的に最適化します。
    5. 1H-R2 によるリガンド結合のマッピング
      1. ブルカー標準ライブラリからCPMG_ESGP2Dパルスプログラムを選択します。このシーケンスは、Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)実験に基づいており、水抑制のための励起彫刻が組み込まれています33。
      2. 実験を2D取得として設定します。
        注:これは、化学シフト情報に直接次元のみが使用される擬似2D実験です。
      3. 取得パラメータを次のように設定します。
        時間領域(TD):直接¹H次元の32,768個の複素点。
        (TD1): 2ポイント。
        スペクトル幅(SW):7.9932 ppm(4,795.396 Hz)。
        スキャン間遅延(d1):4秒。
        搬送周波数(o1):4.7ppm(水信号中心)。
        スキャン数(ns):8。
        ダミースキャン数(ds):4。
        CPMG 遅延 (d20): ≤1 ミリ秒 (つまり、1/3 J_HH 未満)。
        平均数(TDav):200。
      4. 実験をそれぞれ8回のスキャンを200サイクル実行すると、合計1,600回のスキャンが蓄積されます。CPMGサイクルの希望の合計時間(TCPMG)に応じて、可変カウンタリスト(vclist)を調整します。ここでは、TCPMG=8 ミリ秒に対して 2 サイクルが選択され、TCPMG=800 ミリ秒に対して 200 サイクルが選択されました。
      5. タンパク質を含むサンプル(4 mM D-マンノースおよび80 μM CVN)と遊離D-マンノース(4 mM D-マンノース)の2つの 1H-CPMG実験を実行します。
      6. コマンドefp(指数関数的乗算とそれに続くフーリエ変換と位相補正)またはsinm(90°シフトされた正弦乗算、SSB = 2)とfp(フーリエ変換と位相補正)のコマンドを使用して、各TCPMGの1Hスペクトルをプロットします。最適な処理戦略に従ってウィンドウ機能を調整します。
        注:この実験では、sinmとfpを使用しました。1番目の シリアルは、TCPMG が8ミリ秒(vclistの1番目)のスペクトルであり、2番目の シリアルは800ミリ秒(vclistの2番目)になります。処理された 1Hスペクトルを 図3にプロットします。
      7. 式 3 を使用して CPMG 商 (Q) を計算します。
        ​figure-protocol-5
  2. タンパク質ベースの実験
    1. サンプル前処理
      1. 50 mM NaClおよび5%酸化重水素(D2O)を添加したリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.4)に436 μMを均一に15N標識CVNを含む600 μLのサンプルを調製します。D-マンノースをサンプル中に最終濃度60 mMまで滴定します。滴定には、5 mm NMRチューブを使用します。
    2. 共振割り当て(オプションの検証ステップ)
      1. 以前に報告された化学シフト値を使用して、溶液中の遊離CVNの割り当てを確認します34。HNCO、HNCA、HNCACB、およびCBCACONH35、36、37のトリプル共鳴スペクトルを取得します。
        注:これらの実験は割り当てを検証するためのものであり、化学シフト割り当てはこのプロトコルの主な目的ではないため、示されていません。
    3. タンパク質の化学シフト摂動によるCVN上のD‐マンノースの結合のマッピング
      1. 298 Kで15N標識CVNの1 H-15N HSQCスペクトルを取得します。D-マンノースを添加して滴定を行い、次の最終濃度に達します:0、1、2、5、10、20、40、および60 mM。
      2. ブルカー標準ライブラリの位相感応FHSQCF3GPPHパルスシーケンスを使用して、 1 H-15N Fast-HSQC実験をセットアップします。次のパラメーターを使用します。
        時間領域(TD):1H次元×15N次元の1024140の複素点。
        スペクトル幅(SW): 1H次元で16.0274ppm(9615.385Hz)、 15N次元で34ppm(2067.119Hz)。
        キャリア周波数:4.7 ppm(1H)および119 ppm(15N)。
        スキャン数:128。
      3. 次の式を使用して、化学シフト摂動(Δδ)を計算します。
        figure-protocol-6
        ここで、 figure-protocol-7 と figure-protocol-8 は、D-マンノースの存在と非在におけるCVN間の化学シフトの違いです(図4A)。
        注:係数10は、陽子と窒素の次元の間のスペクトル幅の違いを説明します。
      4. 解離定数(KD)を、各残基のCSP値をD-マンノース濃度の関数としてプロットすることにより計算します。次の式(5)を使用して、結果のデータを単一部位結合等温線に当てはめます。
        figure-protocol-9式5
        ここで、[PT]は滴定(CVN)に使用されるタンパク質濃度、[PT]はリガンド濃度(D-マンノース)、CSPmaxはリガンドの飽和濃度でのCSPであり、リガンドがない場合のCSPminです。
    4. タンパク質の15N-R2位を介したCVNへのD-マンノースの結合をマッピングします。
      1. 60 mM D-マンノースの存在下で、CVNの個々の残基の 15N-R2 値を測定します。すべての実験を298Kで実行します。
      2. ブルカー標準ライブラリからHSQCT2ETF3GPSI3Dされた位相感応性CPMGベースのパルスシーケンスを使用して、 15N-R2 実験をセットアップします。次のパラメーターを使用します。
        時間領域 (TD): 1H 次元× 15 N 次元に 1024 128個の複素点があり、擬似次元に 8 点があります。
        スペクトル幅(SW):16.0274 ppm(1H、9615.385 Hz)および34 ppm(15N、2067.119 Hz)。
        キャリア周波数:4.7 ppm(1H)および119 ppm(15N)。
        スキャン数:32。(v)変数カウンタリスト:1、8、2、6、3、5、4、および7、それぞれ16.96、135.68、33.92、101.76、50.88、84.96、67.84、および118.72ミリ秒の緩和遅延(T弛緩)に対応します。
      3. ソフトウェアチュートリアルに従って、NMRPipe38を使用して、擬似3Dスペクトルを一連のHSQCのような1H/15N相関緩和スペクトルとして処理します(チュートリアルへのリンクについては、材料表を参照)。
      4. 処理されたスペクトルを適切なNMR分析プラットフォーム(CCPNMR39など)にインポートします。すべてのスペクトルを選択し、「強度の変化を追う」ツールを適用します。各クロスピークの強度をT弛緩 の関数としてプロットし、崩壊を単指数関数に当てはめて、各残基の 15個のN-R2 値を抽出します。
      5. 67.84 msでのHSQCライクスペクトルの信号対雑音比から実験誤差を計算します。ノイズのみを含むスペクトルの領域を処理し、次のコマンドを使用してテキストファイルに変換します。
        pipe2txt.tcl ./PROCs/ft/R2_67_84.ft2 > noise67_84.txt"
      6. 統計ソフトウェア(Origin(Pro)、バージョン2021など)を使用して、ノイズ領域の標準偏差を決定します。この値をノイズ強度 Iノイズとして定義します。
      7. 次の式を使用して、各残基の実験誤差を計算します。
        figure-protocol-10
        注:フィッティング誤差ではなく、実験誤差を使用することが重要です。実験誤差は、D-マンノースの存在下で 15N-R2 を比較する際の解釈限界を定義します。

figure-protocol-11
図1:CVNの存在下でのD-マンノースの化学シフト摂動。 (A)CVNの存在下でのD-マンノースの 1 H-13C-HSQCスペクトル。(B)遊離D-マンノースの 1 H-13C-HSQCスペクトル。スペクトル内のラベルは、それぞれの化学シフトの割り当てとそれぞれのアノマー配置(αまたはβ)を示しています。赤のラベルは結合したコンフォメーションに割り当てられたラベルであり、黒のラベルは自由コンフォメーションに割り当てられたラベルです。(C)CVNの存在(緑)と非在(青)における 1 H-13C-HSQCスペクトルの重ね合わせ。(D)式(1)に従って計算された観測されたCSPを強調するα-およびβ-D-マンノースの化学構造。CSP 値は、緑色の円の下に示されています。赤い円は、CVNの存在下で消えたβアノマー水素を表しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-12
図2:CVNの存在下でのD-マンノースの飽和移動差(STD)スペクトル。 (A)異なる飽和周波数で獲得されたSTD:-0.59、0.73、および8.1 ppm。(B)異なる飽和時間で獲得されたSTD:0.5、1、1.5、2、2.5、3、および4秒。(C)飽和時間の関数として式2に従って計算されたSTD増幅係数(A STD)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-13
図3:CVNの存在下および非存在下でのD-マンノースの1H-R2。 (A)CVNの非存在(下)および存在(上)で8および800ミリ秒のR2緩和時間で獲得されたバインダーおよび非バインダーの予想されるD-マンノース1H-CPMGスペクトルの表現。Q は式 3 に従って計算されました。相互作用がない場合(Q ≈ 1)、シグナル強度は、タンパク質の有無にかかわらず、リガンドの両方の緩和時間で同様のままです。結合(Q < 1)すると、タンパク質を含むサンプルの緩和が増加するにつれてシグナル強度が低下します。(B)D-マンノースの自由状態と結合状態の間の化学交換の概略図。化学シフト差 (Δω) と交換レート定数 (kex = kオン + kオフ) の相対値に応じて、システムは低速、中間、または高速の交換体制に分類されます。(C)1CVNの存在下での遊離D-マンノースとD-マンノースのH NMRスペクトルは、8msおよび800msの緩和時間でのシグナル強度の違いを示しています。特定の水素(H6β、H3β、H5α、H4β)の計算されたQ因子が示されており、Q値が低いほどCVNとの相互作用が強いことを示し、結合に関与する糖の領域が特定されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-14
図4:D-マンノース結合に関与するCVN残基を明らかにする化学シフト摂動(CSP)分析。 (A)10 mM(上)および60 mM(下)濃度のD-マンノースで滴定した場合のCVNの骨格アミド(15 N-1H)CSPを示す棒グラフ。水平線は、平均 CSP に 1 つまたは 2 つの標準偏差 (av + sd、av + 2 sd) を加えたものを示し、これらは有意に摂動された残基を特定するためのしきい値として使用されました。(B)二糖類Manα1-2Manα(PDB ID:1IIY40)と複合体を形成したCVNの構造への有意に摂動された残基のマッピング。av + 2 sdしきい値を超えるCSPの残基は赤で強調表示され、av + sdとav + 2 sdの間の残基は青色で表示されます。二糖類のManα1-2Manα分子は、結合位置を示すためにオレンジ色で表示されています。(C)D-マンノース濃度の関数としてCSPを表す選択された結合曲線。データは、式5に従ってKDを推定するための単一部位結合モデルとして適合され、D44が最も強い相互作用(KD = 1.1 ± 0.35 mM)、E41が最も弱い(KD = 35 ± 29 mM)という、さまざまな親和性が明らかになりました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:CVN遊離およびD-マンノースに結合した15N-R2の分析。 (A、B)(A)遊離状態および(B)D-マンノース結合状態のCVNの各残基について測定された横方向緩和率(15N-R2)。(C)残基ごとにプロットされたR2値の差(ΔR2 = R2束縛-R2自由)。青と赤の線は、それぞれ平均からの1標準偏差と2標準偏差(av ± sdとav ± 2 sd)を表します。有意なΔR2値を持つ残基にはラベルが付けられます。(D)二糖類Manα1-2Manα(PDB ID:1IIY40)と複合体を形成したCVNの構造に対するΔR2値のマッピング。ΔR2 が av± 2 sd より上または下にある残基は赤で示されます。AV± SDとAV±2 SDの間のものは青色で示されています。D-マンノース分子は、結合位置を示すためにオレンジ色で表示されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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結果

本研究では、タンパク質と糖鎖の相互作用を調べるためのNMR実験を発表しました。タンパク質-糖鎖分子認識は、細胞接着、遊走、増殖、その他のさまざまな形態の細胞コミュニケーションの調節を含む、細胞外マトリックス (ECM) を含む多くの生物学的プロセスの根底にあります。

ここでは、弱い結合剤として説明されている単糖類D-マンノースを使用することを選択しました。目的は、過渡相互作用を測定する方法を説明し、結合メカニズムの解明におけるその重要性を強調することでした。リガンドの相互作用部位を特徴付けるために、3つの異なるリガンドベースのNMRアプローチが採用されました。

最初の方法は、CVNの存在下でD-マンノースの化学シフト摂動(CSP)を評価することでした。この目的のために、CVNと比較して50倍のD-マンノース(図1A)と遊離D-マンノースを含むサンプルの1つのH-13 C-HSQCスペクトルを、同一のバッファ条件下で記録しました(

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ディスカッション

NMR分光法は、特にCVNとD-マンノースの間で観察されるような弱く一過性の相互作用を検出できるため、タンパク質と糖鎖の相互作用を調査するための汎用性の高いアプローチです。ここで説明するプロトコルは、リガンドおよびタンパク質ベースのNMR法を組み合わせており、相互作用界面のより包括的な特性評価を可能にします。

プロトコルの重要なステップには、タンパク質とリガンドの濃度を正確に制御した慎重なサンプル調製、スペクトルパラメータの標準化、およびNMR実験の適切な選択が含まれます。データの再現性は、特に溶媒飽和の影響を受けるSTDやWaterLOGSY21,43などの高感度実験において、サンプルの安定性に大きく依存します。

この研究でリガンドとタンパク質の両方の観点から相補的なNMRアプローチを使用することで、結合部位の検証と、潜在的なアロステリック効...

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開示事項

著者らは、競合する利益はないと宣言する。

謝辞

NMR分光計の使用について、Centro Nacional de Ressonância Magnética Nuclear Jiri Jonas(CNRMN)に感謝します。Manα1-2Manαとの複合体におけるCVNの化学シフト割り当てを共有してくれたCarole Bewley博士に感謝します。また、資金提供機関のFAPERJとCNPqにも感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
13CグルコースCambrige同位体ラボCLM-481
15N塩化アンモニウムCambrige同位体ラボNLM-467
塩化カルシウムシグマ・アルドリッチC4901
コケテルはプロテアーゼを阻害しますシグマ・アルドリッチ4693159001
D2OCambrige同位体ラボDLM-4
D-マンノースシグマ・アルドリッチM2069-5G
塩化マグネシウムシグマ・アルドリッチM8266
NMRパイプソフトウェアチュートリアルへのリンク: https://www.ibbr.umd.edu/nmrpipe/demo.html
塩化カリウム(K2HPO4)シグマ・アルドリッチP3786
塩化カリウム(KCl)シグマ・アルドリッチP3911
塩化カリウム(KH2PO4)シグマ・アルドリッチP0662
重見管ブルカーZ1Z10684A
塩化ナトリウム(NaCl)シグマ・アルドリッチS9625
リン酸ナトリウム(Na2HPO4)シグマ・アルドリッチ567545
リン酸ナトリウム(NaH2PO4)シグマ・アルドリッチS97263
分光器 Bruker 600 MHzブルカー
分光器 Bruker 800 MHzブルカー
チアミンシグマ・アルドリッチT1270
トリプル共振TXIプローブブルカー
トリプトンシグマ・アルドリッチ93657
酵母エキスシグマ・アルドリッチY1625

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