方法論記事

タンパク質アセンブリ間の動的交換を分析するためのFRET希釈アッセイ

DOI：

10.3791/68678

⸱

2025年9月19日

 , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology and the Institute for Collaborative Biotechnologies, University of California, Santa Barbara

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、リフレクチンA1の精製と共有結合標識、ならびにタンパク質集合体間のリフレクチンタンパク質の動的交換を年齢の関数として特徴付けるためのFRET希釈アッセイを記述する。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

頭足類における調整可能な虹色の分子ドライバーとして、リフレクチンA1タンパク質の調整可能な位相挙動は、生体材料工学の焦点であり続けています。リフレクチンA1の塩濃度とタンパク質の正味電荷密度を調節すると、タンパク質は液液相分離の中間体として動的集合体を形成します。リフレクチンアセンブリは、タンパク質のカチオン性、クーロン反発力の電荷中和の程度によってサイズが制限されますが、最初は周囲の溶液からのモノマーまたはオリゴマーと動的に交換されます。新しい蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)希釈アッセイを動的光散乱(DLS)およびタンパク質濃度アッセイと組み合わせて使用して、リフレクチンA1アセンブリと希薄相の間のタンパク質の双方向フラックスをアセンブリ年齢の関数として特徴付けました。このFRET希釈アッセイは、タンパク質アセンブリに出入りするタンパク質の一方向フラックスと双方向フラックスを区別するため、アセンブリ形成中に適用できます。動的停止タンパク質アセンブリと速度論的に停止したタンパク質アセンブリを区別することは、それらの生物物理学的起源を理解するために重要であり、この新しいFRET希釈アッセイは、他のタンパク質アセンブリの生物物理学的調査を補完するために適応できます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ロリギニドイカの調整可能な虹色は虹彩細胞のリフレクチン蛋白質によって媒介される1,2,3虹彩細胞には、タンパク質密度の高いブラッグラメラのスタックを形成する広範かつ規則的な膜陥入が含まれており、角度および波長に依存する方法で光を反射します1,4,5,6。アセチルコリン誘発シグナルカスケードは、カチオン性リフレクチンタンパク質1,2,7のリン酸化で最高潮に達し、タンパク質内およびタンパク質間の静電反発を減少させ、ブラッグラメラのリフレクチンの凝縮を10〜50 nmの流体力学的半径粒子から高密度の液体凝縮物3,8,9に駆動します。リフレクチンA1は、in vitroでサイズが安定した10 + nm半径アセンブリを形成し、そのサイズはタンパク質の正味電荷密度10,11,12によって正確に調整され、この調整可能なコロイド挙動は、リフレクチンベースの調整可能なバイオフォトニック材料の設計において多くの生物工学的関心を集めています13,14,15,16,17,18.NaClは、疎水性効果のエネルギー寄与をエントロピー的に増加させ、交互カチオン性リンカー19の反発電荷をスクリーニングすることにより、A1アセンブリとLLPS(液液相分離)をリフレクトインで駆動することが最近実証されました。

タンパク質密度の高い液体状凝縮物の場合、全液滴FRAP(光退色後の蛍光回収)20を使用して、緻密相と希薄相の間の動的交換を容易に分析できます。ナノメートルスケールのタンパク質アセンブリには同様のアッセイが必要です。LLPS 19,21,22の中間体としての生理学的に関連するタンパク質アセンブリの最近の報告は、アセンブリと共存する希薄相との間のアセンブリダイナミクスおよび動的交換を調査するための同等の方法の必要性を示唆しました。タンパク質クラスターには、停止したスピノーダル分解によって生成される速度論的に停止したガラス様コロイド、希薄相からモノマーまたはオリゴマーを交換する動的平衡集合体、および準安定クラスター23、24、25、26、27が含まれます。したがって、年齢依存性のタンパク質集合ダイナミクスは、より複雑な相挙動のコンテキスト内でタンパク質集合体の形成を促進する物理的プロセスを理解するための鍵となります。

ドナー蛍光色素標識タンパク質の集合体とアクセプター蛍光色素標識タンパク質の集合体との間の相互作用を分析するFRETベースのアプローチは、準安定タンパク質クラスターのダイナミクスを特徴付けるために使用されています21。これらのクラスターを混合すると、FRETの出現は、クラスター21へのタンパク質の交換と輸送を示します。ただし、リフレクチンA1などの一部のタンパク質では、クラスターは実験19の期間中継続的に形成および成長します。このようなタンパク質には、動的に停止したクラスターの継続的な形成中に発生する可能性のあるように、クラスターへのタンパク質の一方向輸送をデコンボリュートするアプローチと、アセンブリ間のタンパク質の双方向輸送が必要です。

FRET希釈アプローチは、蛍光色素希釈(図1)を介してこれを実現し、FRETの減少はアセンブリ間のタンパク質の双方向輸送を意味します。リフレクチンタンパク質のタンパク質アセンブリは、アクセプター蛍光色素またはドナー蛍光色素のいずれかで標識された等量のタンパク質を含むものを調製しました。これらの共標識リフレクチンアセンブリを、非標識リフレクチンアセンブリを含む溶液で希釈し、アセンブリ間のタンパク質の動的交換をアセンブリ年齢の関数として分析しました。この方法は、準安定クラスター、オストワルド熟成または同様の粗大化プロセスによって成長するクラスター、融合によって成長するクラスター、およびLLPSの中間体ではないクラスターを含むがこれらに限定されない、速度論的に停止したタンパク質クラスターの継続的な形成を動的クラスターと区別します。動的交換のこれらの異なるメカニズムを区別するだけではなく、動的光散乱、ナノ粒子追跡分析(NTA)、ブラッドフォードアッセイなどの直交法が必要です19,21。このプロトコルは、リフレクチンA1野生型および単一システイン含有変異体A1-C232Sの精製方法、A1-C232Sの共有結合標識、およびFRET希釈分析について説明しています。

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プロトコル

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使用する試薬と機器は 、材料表に記載されています。

1. タンパク質精製と共有結合標識

  1. 変換
    1. リフレクチンA1とリフレクチンA1C232S遺伝子(GenBank KF661517.1)をpj411プラスミドにクローンする
    2. 熱ショック処理を使用したプラスミドによるRosetta 2(DE3)細胞のトランスフェクト28.
    3. トランスフェクトした細胞を50 μg/mLのカナマイシンを含む寒天培地にプレートします。
    4. 単離したコロニーを選択し、50 μg/mLのカナマイシンを含む5 mL TB(Terrific Broth)に加え、シェーカーで250 rpmの37°Cで一晩インキュベートします。
    5. シーケンス用のプラスミド単離キットプロトコルを使用してプラスミドを単離します。
  2. タンパク質の発現、溶解、封入体の精製
    1. 50 μg/mLのカナマイシンを含む1 L LB(溶原性ブロス)に5 mLの培養物を加え、振とうしながら37°Cでインキュベートします。0.6〜0.7のA600 で、IPTG(イソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド)を最終濃度5 mMに添加して発現を誘導します。
    2. 16時間後、ペレット細胞を12,000 x g で10分間遠心分離した。上清をデカントし、細胞ペレットを-80°Cの冷凍庫で凍結します。
    3. 細胞ペレットの初期再懸濁後、1 μL(25〜29単位)のベンゾナーゼと3〜5 KUUのリゾチーム精製試薬で20分間処理するなど、メーカーのプロトコルに従って封入体精製試薬を使用して細胞を溶解し、封入体を精製します。精製された封入体は暗褐色のペレットとして現れます。
  3. FPLC(高速タンパク質液体クロマトグラフィー)
    1. 2 Lの8 M尿素:5%v / v酢酸溶液(バッファーA)と1 Lの8 Mグアニジニウム塩酸塩:5%v / v酢酸溶液(バッファーB)を調製します。0.22 μmの真空フラスコフィルターを使用して両方をろ過します。
      注意: 塩酸グアニジニウムの吸入、目、皮膚への接触を避け、取り扱いの際は適切なPPE(個人用保護具)を着用してください。専用の廃棄物容器に入れて処分してください。
    2. 封入体ペレットを8 M尿素:5%酢酸溶液に再懸濁し、磁気撹拌棒で激しく撹拌します。溶液は濁って見えます。遠心分離機を4°Cに予冷し、4°Cで18,000 x g で70分間遠心分離し、FPLC用の上清を収集します。上清は茶色で透明に見えます。
    3. 次のすべてのステップで 2 mL/分の流速を使用して、10 mL の陽イオン交換カラムを 95% バッファー A、5% バッファー B の 5 カラム容量(CV)で平衡化し、サンプルをロードします。結合していないサンプルを5つのCVで洗い流し、ステップグラジエントを実行します:94%バッファーA / 6%バッファーBの5つのCV、次に5つのCVの10%バッファーB。リフレクチンA1は10%バッファーBで溶出します。
    4. SDS-PAGEによって10%バッファーBへの初期ステップ変更に対応する画分の純度を評価し、類似している場合はプールします。遠心分離機を4°Cに予冷し、15 mL 10 kDa MWCOスピン濃縮器を使用して画分を最終容量4〜5 mLに濃縮します。
  4. HPLC(高速液体クロマトグラフィー)
    1. 0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)を含む2 Lの18 mΩ水と、0.1%TFAを含む2 Lのアセトニトリルを調製します。0.22 μmの真空フラスコフィルターを使用して両方をろ過します。
      注意:TFAは強力な発煙酸です。適切なPPEを着用してヒュームフードで取り扱い、ガラスのみを使用して移送してください。アセトニトリルとの吸入、目、皮膚の接触を避け、取り扱いの際は適切なPPEを着用してください。専用の廃棄物容器に入れて処分してください。
    2. 次のすべてのステップで 1 mL/min の流速を使用して、C4 カラムを 85% 18 mΩ の水、0.1% TFA、および 15% アセトニトリル、0.1% TFA の 5 CV で平衡化します。
    3. フローを開始し、サンプルを注入します。2 CVを流し、5 CVにわたって80%アセトニトリル、0.1%TFAまで一定の勾配を開始します。リフレクチンA1は通常、73%アセトニトリルで溶出します。
    4. エタノールとドライアイス浴を使用して、5 mLチューブにリフレクチンタンパク質を含むシェル凍結画分。凍結乾燥し、-80°Cで保存します。 タンパク質は薄い白いシートとして現れます。
  5. 非標識プロテインストック調製
    1. 氷酢酸と酢酸ナトリウム三水和物を使用して、4 LのpH 4、25 mM酢酸緩衝液(21.05 mM酢酸、3.95 mM酢酸ナトリウム三水和物)を調製します。必要に応じて、4 M HClまたは4 M NaOHでpHを調整します。0.22μmの真空フィルターを使用してフィルターを切り替えます。
      注意: 強酸/強塩基は、適切なPPEを着用して取り扱ってください。濃い強酸や強塩基に水を加えないでください。
    2. 凍結乾燥リフレクチンタンパク質を含むチューブを解凍し、チューブを氷浴に入れて、pH 4、25 mM酢酸緩衝液で再溶解します。完全に再溶解されたタンパク質溶液は、目に見える濁りや沈殿物がなく、無色に見えます。
      1. 分子量10 kDaのカットオフ透析カセットを使用して、4°Cで2回の12時間の変化を使用して、4°Cに予冷したpH 4、25 mM酢酸緩衝液の1000倍のサンプル量で再溶解したリフレクチンタンパク質を透析します。
    3. サンプルをpH 4、25 mMの酢酸緩衝液で希釈して、最終タンパク質濃度100 μM、最終体積150 μL以上を得る。UV-VIS分光計を使用して、280 nmでの吸光度を測定し、リフレクチンA1(123,685 M-1 cm-1)のモル吸収係数29を使用してタンパク質濃度を決定します。
    4. リフレクチンタンパク質ストックを0.5 mLスナップキャップ微量遠心チューブに移し、4°Cで最大7日間保存します。実験の直前に、リフレクチンタンパク質ストックを4°Cで18,000 x g の予備冷却マイクロ遠心分離機で15分間遠心分離します。123,540 M-1 cm-1のモル吸収係数を使用して、同様にリフレクチンA1 C232Sストックを調製する。
  6. タンパク質標識
    1. 10 mgの蛍光プローブとピペットの混合を含むバイアルに1 mLの乾燥ジメチルスルホキシド(DMSO)を加えて、FMTS(フルオレセイン-メタンチオスルホン酸塩)およびSRMT(スルフォルホダミンメタンチオスルホン酸)の10 mg / mLストックを別々に調製します。
      注意:メタニチオスルホン酸試薬との吸入、目、皮膚の接触は避けてください。
    2. 7.7 μLの10 mg/mL FMTSストックまたは10.4 μLの10 mg/mL SRMTストックをpH 4、25 mM酢酸バッファーに加え、最終容量は150 μL、最終濃度は500 μM FMTSまたはSRMTにします。溶液は濁って見えます。残りの蛍光プローブストックを分注し、-80°Cで凍結します。
    3. 150 μLの100 μMリフレクチンプロテインストックと組み合わせ、完全にピペットで混合します。最終タンパク質濃度は50 μM、最終蛍光プローブ濃度は500 μMです。溶液の濁度が下がります。
    4. ホイルで包み、室温で穏やかな軌道攪拌で4時間、次に4°Cで一晩インキュベートします。 溶液の濁度は変化してはいけません。
    5. 沈殿物が存在する場合は、ピペットを激しく混合して再懸濁します。溶液は濁ります。10,000 kDa MWCO遠心フィルターを使用して、リフレクチンを目標体積100 μL、濃度150 μMまで濃縮します。
    6. タンパク質精製と同じHPLCおよび凍結乾燥法を使用して、結合していない蛍光プローブを除去し、ホイルに包んでタンパク質を-80°Cで保存します。標識されていないタンパク質に対して同じ方法を使用して、標識タンパク質を再溶解します。ラベル付けの程度を決定します。
      注:再溶解された蛍光標識リフレクチンタンパク質は、濁りや沈殿のない黄緑色(C199-F)または暗赤色(C199-R)に現れます。
  7. 共標識タンパク質ストック調製
    1. 27 μLの100 μM A1タンパク質ストックを0.5 mLスナップキャップ微量遠心分離機に加えます。
    2. 1.5 μLのフルオレセイン標識リフレクチンA1-C232S(フルオレセインのアミノ酸位置を示すためにC199-Fと呼ばれる)を同じチューブに加えます。
    3. 1.5 μLのスルホルホダミン標識リフレクチンA1-C232S(フルオレセインのアミノ酸位置を示すためにC199-Rと呼ばれる)を同じチューブに加えます。最終濃度は90 μM A1、5 μM C199-F、および5 μM C199-Rです。
    4. ホイルで包み、4°Cで最大7日間保存します。

2. FRET時系列

  1. バッファーの調製とろ過
    1. 500 mLの25 mM 3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸(MOPS)バッファーを調製します。4 M水酸化ナトリウムをゆっくりと加えて、溶液のpHを7に調整します。10 mLシリンジと0.22 μmシリンジフィルターを使用して10 mLをろ過します。
  2. タンパク質の遠心分離
    1. 卓上微量遠心分離機を4°Cに予冷します。 標識なしおよび共標識リフレクチンA1ストックを18,000 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
  3. ラベル付き A1 アセンブリの準備
    1. 3回の複製を調製するには、9.6 μLのMOPSバッファー(pH 7、25 mM)を3本の0.5 mLスナップキャップ微量遠心チューブにピペットで入れます。
    2. すでに9.6 μLのMOPSバッファーを含む各チューブに0.4 μLの標識タンパク質ストックを添加し、最終タンパク質濃度を4 μMにします。サンプル量全体を吸引して分注して、ゆっくりとピペットで2回混合します。
    3. すぐに錫箔で包み、25°Cのインキュベーターに入れます。 これおよび以下のすべての集合体溶液は、インキュベーションの前後に見かけの濁りや沈殿を欠いています。
  4. ラベルなしの A1 アセンブリの準備
    1. 3つの反復を調製するには、38.4 μLのMOPSバッファーを3本の0.5 mLスナップキャップマイクロ遠心チューブにピペットで移します。
    2. 38.4 μLのMOPSバッファーをすでに含んでいる各チューブに1.6 μLのリフレクチンA1タンパク質ストックを、最終タンパク質濃度4 μMまで添加します。サンプル量全体を吸引して分注して、ゆっくりとピペットで2回混合します。
    3. すぐに錫箔で包み、25°Cのインキュベーターに入れます。
  5. 共ラベル付きおよび非ラベル化A1アセンブリのタイミングと混合
    1. アセンブリの準備を次のように注文します:実験用1つの共標識リフレクチンと実験用1つの非標識リフレクチンのアセンブリを同時に別々に準備します。手順 2.3 と 2.4 を繰り返します。
    2. 40 μLの非標識A1アセンブリ実験をそれぞれの共標識実験用10 μLに加えて混合し、全容量を吸引して2回分注して穏やかにピペットで混合します。測定は、このステップの 24 時間後に実行されます。
    3. MOPSバッファー(pH 7、25 mM)への希釈によるリフレクチンA1の駆動アセンブリと、標識されたアセンブリと標識されていないアセンブリの混合の間の時間がアセンブリ年齢です。このデータに使用されたアセンブリの年齢は、0 分、1 分、10 分、30 分、60 分、120 分、180 分、540 分、1080 分、1620 分でした。
  6. コントロール
    1. ポジティブコントロール
      1. A1および標識タンパク質ストックから、80 μM A1および20 μMの共標識タンパク質ストックである20 μLのタンパク質ストックを調製します。
      2. 38.4 μLのMOPSバッファーを0.5 mLのスナップキャップマイクロ遠心チューブに加え、1.6 μLの80 μM A1/20 μM標識タンパク質を加え、ピペットミックスを2回ゆっくりと吸引して全容量を分注します。すぐにホイルで覆い、25°Cのインキュベーターに入れます。 合計9サンプルを繰り返します。
    2. ネガティブコントロール
      1. すでに9.6 μLのMOPSバッファーが入っている0.5 mLスナップキャップ微量遠心チューブに0.4 μLの標識ストックを加えます。サンプル量全体を吸引して分注することにより、ゆっくりとピペットで2回混合します。
      2. 40 μLのMOPSバッファーとピペットミックスを2回添加し、サンプル量全体を吸引して分注します。すぐにホイルで覆い、25°Cのインキュベーターに入れます。 合計9サンプルを繰り返します。
  7. キュベットとバッファーブランク
    1. 蛍光計を488 nmで励起するように設定し、520〜700 nmの連続スペクトルを記録します。
    2. 清潔な石英サブマイクロ蛍光計キュベットに50 μLのMOPSバッファー(pH 7、25 mM)を充填し、測定します。
    3. バッファーを削除します。
  8. 実験手順
    注:すべての実験は、共標識および非標識リフレクチンA1アセンブリを混合してから24時間後に記録する必要があります。50 μLの実験液をキュベットにそっとピペットで入れ、測定します。
    1. サンプルを取り出し、500 μLの酢酸緩衝液ですすぎ、次に500 μLの0.22 μmろ過した18 mΩの水ですすぎます。バッファブランクを実行します。
  9. コントロール
    1. コントロールを準備してから1440分、1960分、3060分で測定します(0分、520分、1620分の組み立て時間に対応)。これらの測定は、プロトコルの実験部分を終了します。

3. データ分析

  1. 実験スペクトルからバッファブランクのスペクトルを差し引きます。
  2. Em588/Em520 の比率を決定します。
  3. 次に、各反復について、3つの反復の各グループの平均と標準偏差を決定します。Em588/Em520 を組み立て年齢の関数としてプロットします。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ドナー蛍光色素標識タンパク質とアクセプター蛍光色素標識タンパク質の両方を含むリフレクチンA1アセンブリを非標識リフレクチンA1アセンブリで希釈した後、希釈されていないアセンブリと比較して588 nmでのFRET発光の初期減少が観察されました(図2A)。0分齢のアセンブリのFRETはポジティブコントロールと同様であり、1620分齢のアセンブリのFRETは(アセンブリ形成から非標識リフレクチンアセンブリと標識リフレクチンアセンブリの混合までの時間)はネガティブコントロールよりも短かった(図2A)。Em588 / Em520 をアセンブリ年齢の関数としてプロットすると、アセンブリ集団全体が最初は完全に動的であり、動的交換の程度はアセンブリの年齢が上がるにつれて徐々に減少したことがわかります(図2B)。人口のわずか19%が24時間前のアセンブリの動的交換に参加しました(図2B

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ディスカッション

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精製中のタンパク質損失の共通点は、封入体精製プロトコルのすべてのステップで封入体ペレットの不完全な再懸濁、および精製された封入体の最終的な8M尿素5%v / v酢酸への再浮遊です。封入体の再溶解には、40 mLのコニカルチューブ内の小さな磁気撹拌バーを使用して、最大24時間の激しい攪拌が必要です。フィルターへのタンパク質の大幅な損失を避けるために、FPLCおよびHPLCに先行するろ過を15,000 x g で70分間遠心分離に置き換えて、溶液を清澄化し、液体クロマトグラフィーシステムを詰まらせる可能性のある大きな粒子を除去しました。封入体の相対的な純度により、精製プロセスからFPLCを省略することができ、HPLCだけでリフレクチンA1を精製するのに十分である可能性があります30;ただし、逆相HPLCカラムのより頻繁なディープクリーニングが必要になります。完全性を保つために、このプロトコルにFPLCを含めました。

野生型リフレクチンA1は、pH値4.5...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

研究は、米国陸軍研究局からの助成金W911NF-19-2-0026およびW911NF-23-1-0330を通じて、共同バイオテクノロジー研究所によって支援されました。情報の内容は、必ずしも政府の立場や政策を反映しているわけではなく、公式の支持を推測すべきではありません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10 & ムー;L容量マイクロピペット
2 &ミュー;L容量マイクロピペット
2-[(5-フルオレセイニル)アミノカルボニル]メタンチオスルホン酸エチルサンタクルーズバイオテクノロジーズSC-216155CAS 351330-42-2
20 & ムー;L容量マイクロピペット
200 & ムー;L容量マイクロピペット
3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸、4-モルホリンプロパンスルホン酸シグマ・アルドリッチM1254CAS 1132-61-2
酢酸シグマ・アルドリッチA6283CAS 64-19-7
アセトニ トリルシグマ・アルドリッチ34851-1LCAS 75-05-8
寒天粉末カロライナバイオロジカル842133CAS 9002-18-0
アルミホイル
Amicon 超遠心フィルター、10 kDa MWCOミリポアシグマUFC501008容量0.5ml
Amicon 超遠心フィルター、10 kDa MWCOミリポアシグマUFC90100815ml容量
分析天びん
ベンゾナーゼミリポアシグマ70664-3CAS 9025-65-4
BugBuster タンパク質抽出試薬ミリポアシグマ70584-3
ケーリー・エクリプス蛍光分光計キャリー・エクリプス
Cary Eclipseソフトウェア
コーニング 50 ml 遠心分離管ミリポアシグマCLS430829
使い捨てシリンジ、ルアーロック 10 mLコール・パーマーUX-12915-02
DMSOのシグマ・アルドリッチD8418CAS 67-68-5
ドライアイス
デュアルポンプFPLCシステム
デュアルポンプHPLCシステム
エタノールミリポアシグマEX0280-3CAS 64-17-5
床置き遠心分離機ローター 500 ml バイアル容量
床置き型遠心分離機 
冷凍庫、-80°C
ヒュームフード
塩酸グアニジンサーモサイエンティフィックAAA135430B50-01-1
HiTrap SP HP カチオン交換クロマトグラフィーカラムサイトバ17115101
塩酸シグマ・アルドリッチ258148-25MLですCAS 7647-01-0
孵卵器
イソプロピル&β;-D-1-チオガラクトピラノシドシグマ・アルドリッチI6758-1G
硫酸カナマイシンシグマ・アルドリッチK1637CAS 25389-94-0
凍結乾燥機
リゾチームサーモサイエンティフィック90082
マグネティックスターバー
磁気撹拌プレート
マイクロpH電極 S7メトラー・トレド51343160
温度制御付きマイクロ遠心分離機
Millex PVDFシリンジフィルターミリポールSLGVR33RS0.22 & ミュー;m、直径33mm。
Milli-Q ミリパックフィルターミリポアシグマMPGP002A1
Milli-Q UltraPure浄水システムミリポアシグマ
NaClサーモサイエンティフィックAA12314A9CAS 7647-14-5
Nalgene遠心分離機ボトル、スタイル3120ミリポアシグマB1283-4EAバクテリアのペレット化用
オービタルラボ インキュベーター付きシェーカー
パソコン
ペトリ皿シグマ・アルドリッチP5731-500EA
PJ411プラスミドDNA2.0
プロテインLoBind コニカルチューブエッペンドルフEP301083025ml容量
プロテインLoBind マイクロ遠心チューブエッペンドルフEP022431102容量0.5ml
パイレックスバッフル三角フラスコ 1,000 mlミリポアシグマCLS44501細菌培養のインキュベーション用
パイレックス グリフィン ビーカー 2,000 mLミリポアシグマCLS10002Lすべてのバッファーおよび溶液の調製 用。
パイレックス丸型メディア保存ボトル 1,000 mlミリポアシグマCLS13951Lすべてのバッファーおよび溶液調製の保管には、真空フラスコフィルターと一緒に使用してください
Qiaprep スピン ミニプレップキットキアゲン27104
冷蔵庫
Rosetta 2(DE3)コンピテントセルノヴァゲン71397-3
スライドライザー透析カセット 10K MWCOサーモサイエンティフィックPI66383容量0.5ml
酢酸ナトリウム三水和物シグマ・アルドリッチS8625CAS 6131-90-4
水酸化ナトリウムシグマ・アルドリッチ567530-250GMのCAS 1310-73-2
Steritop真空ボトルトップフィルターミリポアシグマS2GPT05RE0.22 & ミュー;m 滅菌フィルター
サブマイクロキュベット、50 uL容量スターナ細胞16.40F-Q-10/Z15
スルホルダミンメタンチオスルホン酸塩サンタクルーズバイオテクノロジーズSC-220172CAS 386229-71-6
トリフルオロ酢酸シグマ・アルドリッチ106232-25GCAS 407-25-0
トリプトンスペクトラムケミカル T1333
尿素サーモサイエンティフィックAAA123600ECAS 57-13-6
紫外可視分光計
酵母エキスギブコ211929

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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