体外でのブタからの大量採血:最終手順としての心臓内カニューレ挿入と真空ポンプの使用

サマリー

ここでは、最終手順として、真空ポンプに接続された経皮的心臓内カニューレ挿入を使用して、豚から大量の血液を採取する方法を紹介します。

要約

定期的な採血は、多くの基礎研究および応用研究で必要です。豚の採血のための複数の方法がよく説明されています。これらには、少量の血液を採取するために耳介静脈を使用し、より大きな血液量を採取するために頸静脈または頭蓋大静脈を使用することが含まれます。一部の実験では、分析または初代細胞培養での使用のために、一度に1匹の動物から大量の血液が必要ですが、これは失血によって最もよく達成できます。初代細胞培養のために採取された血液は、細胞の完全性を維持するために、新鮮かつ慎重に処理する必要があります。心臓に経皮的に挿入された大口径血管内カテーテルスタイレットと真空ポンプを使用して、麻酔の外科的平面下で豚から無菌的に血液を採取する方法について説明します。この技術は、最終処置として麻酔の外科面で動物に一度実行され、痛みや苦痛のリスクを最小限に抑えます。

概要

豚は、心血管研究から創傷治癒、毒物学、農業ベースの研究、免疫学、疾患研究に至るまでの研究に使用されてきました¹。研究で採取された血液は、病気、薬理学、遺伝学、免疫系研究、バイオマーカーの発見の研究に使用できます。細胞培養は研究で行われる最も基本的な手順の1つであり、研究者は細胞の挙動と機能、疾患モデルと^{ワクチン開発を}研究することができます2。アフリカ豚コレラウイルスなどの病気の原因となる病原体の培養は、厳格な無菌実験室条件下で所定の培地で行われることがよくあります。病気の伝播は、健康で安定した細胞を必要とする侵入、広がり、または付着によって発生する可能性があります³。研究された病原体は、増殖できる特定の細胞向性を持っている可能性があり、大量の血液を持つと、使用する細胞の量が増えます。

個々の動物から高収量の細胞を達成するには、細胞分化のために、細胞分離の前に細胞の完全性を維持するために大量の血液を穏やかに採取する必要があります。ブタでは、総血液量は65 mL / kg ^4,5で計算できます。大量の採集を使用した経験では、動物の総血液量の約半分を回収できます。したがって、体重が最大600ポンド(273 kg)の大型成豚では、6〜8 Lの収量が可能です。ブタでは、カニューレ挿入を介して頭蓋大静脈、外頸静脈、伏在静脈、^{または心臓から}大量の血液を経皮的に採取できます^4,5,6。しかし、大口径カニューレによる心臓内採血により、細胞溶解のリスクを最小限に抑えながら、最大量の血液を効率的に採取することができます。最終処置として、これは麻酔の外科面の下で実行されなければなりません⁵。この記事では、真空ポンプ^7,8に接続された大口径IVカテーテルスタイレットを使用して、心臓への経皮的アプローチを使用して、真空ポンプを使用して豚から数リットルの血液を収集する方法について説明します。

プロトコル

この研究は、Midwest Veterinary Services Inc. 動物管理および使用委員会によって承認されました。IACUCが承認した、この処置中の安楽死の主な方法は失血であるため、一部のブタは失血により心停止に達することが予想されます。このような場合、両側開胸術などの二次安楽死法が行われます。必要な血液量を採取した後、触知可能な心拍がある場合は、安楽死溶液の入った注射器をスタイレットに取り付け、一次安楽死法として心臓内に投与し、続いて二次物理的方法を投与します。豚は、研究および教育における農業動物の世話と使用に関するガイド、実験動物の世話と使用に関するガイド、および該当する場合は動物福祉法に従って飼育されています。

1.材料と動物の調製(材料表と 図1A-C)

1. チューブをステンレス製ストローに組み立て、ホースの端をバブルチューブに取り付けます。
2. 2本の凹凸のある金属製ストローとガラスボトルが付いたゴム栓を使用して、チューブをローラーボトルに取り付けます。
   注:ガラスは真空ポンプによって生成される容器の崩壊を抑制しますが、圧力下で崩壊しない材料であれば何でも使用できます。
3. 凝固を防ぐために、吸引チューブとカテーテルスタイレットを通してヘパリンナトリウム(1,000 USP / mL)10 mLを無菌的に点滴します。各ローラーボトルに50 mLのヘパリンナトリウム(1,000 USP/mL)を無菌的に添加して、各リットルの血液中の最終濃度50 IU/mLを達成し、採取中の血液の凝固を防ぎます。セルの損傷を防ぐために、真空ポンプの引き込みが7ポンド以下に設定されていることを確認してください。

2.麻酔と動物のポジショニング

1. 手順の24時間以内に動物の体重を量り、麻酔併用薬の必要用量を計算します。
2. テラゾール(3.0〜5.0 mg / kg)、ケタミン(8〜12 mg / kg)、およびキシラジン(4.0〜6.0 mg / kg)を首または他の大きな筋肉腹(例:. 30インチの延長セットと18 G x 1.5インチの針を使用して、深い麻酔を誘発します。
   注:大型豚では、推奨される最大IM注射量は10 mLであるため、10 mLの投与ごとに場所^{を変更する必要がある場合があります}9。このカクテルを選択しましたが、この手順は、外科的麻酔面を生成する IACUC 承認の麻酔プロトコルの下で実行できます。
3. 動物が麻酔の手術面(~5〜8分)にあり、眼瞼反射、緩い顎の緊張、および痛みの刺激に対する反応を示さないことが確認されたら、ブタをリフトテーブル、床、またはその他の平らな面に置き、右側臥位で。
4. 必要に応じて、心臓の上にある胸部の毛をクリップし、肘の先端まで尾側の4番目と5番目の肋間腔の近くにクリップします。
5. 可能な場合は、超音波(図2A)を使用して左心室を特定します。利用できない場合、左心室は、最大インパルス8の点の内側の第4または第5肋間腔に最も近い位置^{にあります。}
6. 4%クロルヘキシジンスクラブに浸した4インチx4インチのガーゼスポンジと、70%イソプロピルアルコールに浸した4インチx4インチのガーゼスポンジでその領域を無菌的にこすります。注射点から外側に回転させ、2 つの消毒剤を交互に繰り返し、円を描くようにこすって皮膚を準備します。

3. 心臓内採血

1. 眼瞼反射、顎の緊張、および足反射をチェックして、動物が麻酔の手術面にとどまっていることを確認します。
   注:動物が麻酔の外科平面にとどまることを確認するために、手順全体を通して麻酔の深さ、心拍数と呼吸数をチェックしてください。
2. IVカテーテルからスタイレットを取り外します。スタイレットを左心室の上に置き、皮膚に対して垂直に進めて、スタイレットを左心室に挿入します(図2B)。血液がスタイレットから脈動し始めたら、ローラーボトルに取り付けられているバブルチューブホースエンドコネクタに取り付けてから、真空ポンプの電源を入れます(図1A および 図2C)。
3. 血液が一定に流れていることを確認します。血液がローラーボトルに引き込まれるときは、ボトルをそっと回転させて、血栓の形成を防ぐために血液と抗凝固剤を混合させます。
4. 1 L の血液が採取されたら、止血剤を使用してローラー ボトルの近くのバブル チューブをクランプします。ゴム栓を外し、次のローラーボトルに当てます。止血剤を取り外し、ローラーボトルをそっと回しながら血液が自由に流れるようにします。
5. 必要な血液が採取されるまで、このプロセスを続けます。完了したら、過剰な血液のこぼれを防ぐためにチューブをクランプし、ポンプをオフにします。
6. カテーテルスタイレットからチューブコネクタを取り外し、ペントバルビタールナトリウムシリンジをスタイレットに取り付けます。注射器を引き戻して血の閃光があることを確認し、安楽死溶液を注射します。心拍、呼吸、筋緊張、反射神経の欠如による死亡を確認します。死亡が確認されたら、心臓から針を抜き、鋭利な容器に入れます。
7. バブルチューブは生物学的廃棄物容器に廃棄します。チューブブラシを使用して残りのステンレス鋼製品(ステンレス鋼ストロー、ホースエンドコネクタなど)から粗大な血液を取り除き、将来の使用のためにオートクレーブします。
8. 洗浄したゴム栓、ストロー、ホースエンドコネクタ、止血剤を新しいオートクレーブポーチに入れ、次回使用する前に滅菌してください。

結果

採血前に、雌豚はマイ コプラズマ・ヒオプニューモニア、ブタ・アデノウイルス、ブタ・パルボウイルス、ブタ・コロナウイルス(伝染性胃腸炎、ブタ流行性下痢)、ブタ血凝集性脳脊髄炎、ブタ生殖呼吸器症候群、インフルエンザ・グループA、サーコウイルス1・2、セネカウイルスAについて事前スクリーニングされた。体重300〜600ポンドのヨークシャー交配雌豚でこの手順を複数回繰り返しました。採血により、小型ブタから3Lから大型雌豚から8Lが得られました。2 つの症例で血栓形成が疑われる場合、良好な血流を取り戻すために最初のスタイレットの取り外しと交換が必要でした。外科的麻酔面は維持されました。採取中は、血栓の形成を軽減するために、採取全体を通してローラーボトルをそっと回転させることが重要です。分化後の細胞品質の考慮事項は、マクロファージが細胞培養フラスコにどれだけよく付着するかに反映されました。接着に加えて、細胞の形態と生存率も評価されました。健康なマクロファージは中型から大型に見え、滑らか、丸みを帯びた、または細長い外観をしています。生存率は、細胞集団の全体的な健康状...

ディスカッション

ここでの手順では、雌豚の心臓から一度だけ大量の血液を採取するためのカテーテルスタイレットから真空ポンプへのアセンブリについて説明します。痛みや苦痛が生じる可能性があるため、この処置は麻酔の外科的面にある動物にのみ実行する必要があります。麻酔による不動により、この手順は初心者が学び、すぐに習得することができます。複数の静脈を使用して、動物から血液を採取できます。最も一般的でアクセスしやすい経路は、頸静脈、頭蓋大静脈、および耳静脈であり、尾静脈、大腿静脈、または頭静脈が追加の可能性があります ^5,6。

豚では、頸静脈と頭蓋大静脈により、大量の血液を採取することができます。しかし、真空ポンプを使用して心臓から採取された血液は、心臓から採取できる量をはるかに超えています。これらの血管から血液を採取するには、大きな注射器またはバキュテナー血液チューブに加えて、安定した手が必要です。バキュテナーの血液チューブや...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1/8馬力のラボモデルダイアフラムポンプ–115 Vac、最大60 PSIおよびNBSP;	基地補給センター	80058845
針を越えたカテーテルで10 G x 6	コヴェトラス・ノースアメリカン獣医用品	024616
50 mL注射器、ルアーロック	フィッシャー・サイエンティフィック	13-689-8
アクアソニック100超音波ジェルブルー	ミッドウエスト獣医供給	001.02109.2
アルガイルバブルチューブ、非伝導性(¼「nbsp;	フィッシャー・サイエンティフィック	NC2282605(ベンダーカタログ#8888280412)
クロルヘキシジンQスクラブ2%	ミッドウエスト獣医供給	562.30804.3
コーニング使い捨てローラーボトル	フィッシャー・サイエンティフィック	06-413
コーニングのPYREXナローマウス、重厚なガラスフラスコ、Erlenmeyerフラスコなどで吸引を生み出します。	フィッシャー・サイエンティフィック	10-040F
Eiscoナイロン試験管ブラシ	フィッシャー・サイエンティフィック	S13962
フィッシャーブランド製2穴ラバーストッパー	フィッシャー・サイエンティフィック	サイズによります。
ケタミン(10 mg/mL)およびnbsp;	ミッドウエスト獣医供給	275.22100.3
MLLから6mmホースエンド(ステンレス製)まで、nbsp;	ケイデンス・サイエンス	6547IND
MLLから8mmホースエンド(ステンレス製)まで、nbsp;	ケイデンス・サイエンス	6549IND
Vベートガーゼスポンジ 不織布 4 x 4 4合板	ミッドウエスト獣医供給	000.30156.2
MVetイソプロピルアルコール70%	ミッドウエスト獣医供給	000.50054.3
MVet Kelly止血鉗子 ストレート5.5インチ	ミッドウエスト獣医供給	000.36800.2
ナトリウムヘパリン(1000 U/mL)とnbsp;	ミッドウエスト獣医供給	191.46701.3
ナトリウムペントバルビタール(390 mg/mL)とnbsp;	ミッドウエスト獣医供給	749.20000.3
ステンレス製ストロー	ホビー・ロビー	1893635
テラゾール(100 mg/mL)	ミッドウエスト獣医供給	275.40000.3
キシラジン(100 mg/mL)とnbsp;	ミッドウエスト獣医供給	310.01150.3