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方法論記事

齧歯類の急性肺損傷を誘発するための非侵襲的気管内リポ多糖投与

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DOI:

10.3791/68700

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2025年12月5日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Pharmacology Division, CSIR-Indian Institute of Integrative Medicine, 2Academy of Scientific and Innovative Research (AcSIR), Ghaziabad-201002, India

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

本研究では、非侵襲的な気管内挿入技術が、基本的な喉頭鏡を用いてラットでALIを発生させることが示され、肺へのLPSの正確な供給が保証されています。LPSは喉頭鏡を用いた気管内チューブ から 点滴されます。肺損傷の規模は複数の時点で評価されます。

要約

急性肺損傷(ALI)は、動脈低酸素血症、肺胞浮腫、上皮・内皮毛細血管関門の健全性の低下を特徴とする生命を脅かす炎症性疾患であり、その後炎症細胞が肺組織に浸潤し、しばしば急性呼吸困難症候群(ARDS)へと進行し、最終的には急性呼吸不全に至ることが多いです。ALIマウスモデルは主にリポ多糖(LPS)によって誘導され、肺炎症のメカニズムとその治療法を理解するための重要なツールです。直接型および間接型の齧歯類肺損傷モデルは、特に生存率、炎症解消期の期間、手術的外傷や感染のリスクといった明確な利点と制約の両方を提供します。本研究では、非侵襲的な気管内挿入技術を用いてラットにおける直接ALIモデルの開発が行われました。この技術は、基本的な喉頭鏡の助けを借りて気管内経路 を通じて LPSや検査物質を肺に集中的に届けることを保証します。処置はまずラットを麻酔し、半横たわった姿勢に置くことから始まります。その後、LPS溶液はラットの気管内チューブに取り付けられた注射器を使って気管開口部付近に投与されます。実験終了時に肺または洗浄サンプルを採取し、炎症パラメータや肺構造を評価します。この技術は、速度、特異性、信頼性の面で他のモデルを上回り、組織損傷を最小限に抑え、死亡率リスクが低く、オフサイト炎症もほとんど抑えられません。この方法は、ALI、ARDS、およびアナフィラキシーや心停止などの関連疾患の前臨床研究において特に有用です。比較的、この方法は生命体内顕微鏡などの高度な画像技術と統合され、薬物の分布や疾患進行をリアルタイムで監視します。

概要

急性肺損傷(ALI)は、動脈低酸素血症、肺水腫、内皮上皮バリアの完全性の低下、そして免疫細胞の大量の肺への浸潤を特徴とする生命を脅かす炎症状態です。ALIの病態生理は複雑で、凝固、組織損傷、肺および全身の炎症など、複数の重なり合い相互作用する経路の相互作用と障害を伴います。この炎症反応を迅速に抑制することは、組織の恒常性回復に不可欠です。治療を怠ると、この急速に進行する疾患はしばしば急性呼吸困難症候群(ARDS)へと悪化し、難治性低酸素血症というより重篤な状態に陥ります。ALIの病因は肺損傷および肺胞上皮細胞および微小血管内皮細胞の損傷または死と関連しています1,2,3,4。

ALI/ARDSの病因は、肺損傷の直接的および間接的な原因の両方から生じる、感染性および非感染性の幅広い要因を含みます5。直接的な原因には肺炎6、溺死寸前7、胃内容物誤嚥8、塩素ガスなどの毒素吸入9、細菌感染10、SARS-CoV-211,12,13,14などのウイルス感染が含まれます。間接的な原因は、肺に二次的な影響を及ぼす全身性プロセスに起因し、敗血症15、外傷16、膵炎17、薬物過剰摂取、輸血18などが含まれます。

この方法の主な目的は、内毒素の気管内投与 を通じて 齧歯類におけるALIの再現可能かつ非侵襲的なモデルを構築することです。この技術の開発の根拠は、従来の投与方法の限界にあります。この技術は、肺胞への正確な直接投与を実現し、全身への曝露を最小限に抑え、将来の標的肺治療への有望なアプローチとして実証されました。鼻腔内挿入はいくつかの課題を伴い、その中には深肺領域への標的の低さや動物間の呼吸変異性など、研究結果に大きな影響を与えるものもあります(19)。用量の制限や鼻の刺激の可能性など、他の要因はそれほど重要ではありませんが、継続性に影響を与える可能性があります。比較すると、気管内投与は下気道へのより正確かつ直接的な投与を提供し、動物間ばらつきを最小限に抑えつつ肺の標的化と投与の均一性を確保し、肺曝露においてより効果的かつ信頼性を高めます20。吸入経路は非侵襲的であるため臨床的に重要ですが、上気道薬物の喪失や遠位肺領域を標的とする有効性の低下など、前臨床研究における一定の制約も伴います。これらの制限は、ダブルヒット傷害やノックイン・ノックアウトマウスを含む遺伝子組み換えモデルなど、重度モデルでより顕著になります。これに対し、気管内投与は下気道への直接的な薬物供給により一貫性が高くなり、損失を最小限に抑え、複雑な前臨床モデルでも効果的な標的化を可能にします。前臨床研究で用いられるもう一つの関連的な投与経路は侵襲的気管内投与です。効果はありますが、手術的ストレス、感染、測定値の変動、温度維持の必要性と関連しています。これに対し、気管内法は信頼性の高い非侵襲的な代替手段を提供し、長期観察期間にわたる繰り返し評価を伴う研究に最適です。

この方法は、喘息、肺線維症、COPD、肺炎、感染症性肺疾患など、ALI以外の動物モデルにも応用可能です。また、アナフィラキシー、心停止、心不整脈などの前臨床研究分野にも関連しています。特に、気管内法は、緊急性や臨床状況に応じて特定の薬剤の投与に臨床実践で既に確立されています 23,24,25。

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プロトコル

動物のケアと利用に関して、すべての機関およびCPCSEAのガイドラインが遵守されました。動物は処置後も継続的に監視され、その健康を確保し、CSIR-インド統合医療研究所(IAEC)の動物倫理ガイドラインに準拠し、機関動物倫理委員会(IAEC)承認番号468/87/8/2025に基づきました。このプロトコルは、以前に示されたように、直接視覚的投与法を用いた非侵襲的な気管内リポ多糖(LPS)挿入を概説し、本研究26,27,28でいくつかの方法論的改良が導入されています。この技術は、ALIを制御された一貫した方法で誘導するよう最適化されており、高い動物ケア基準を維持しつつ堅牢な実験結果を保証します。試薬および使用機器は材料表に記載されています。

1. 麻酔およびLPSの調製

  1. 動物体重測定とLPS投与量の計算
    1. 校正された天秤を使って各動物を計量し、正確なLPS投与量を計算します。研究のために体重140〜160gのウィスターラットを選びます。
    2. 凍結乾燥した大腸菌LPSを無菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で希釈して所望濃度を得てLPS溶液を準備します。新たに調製されたLPS溶液(5 μg/g 体重)29,30が使用されます。
  2. 麻酔誘導と臨界タイミング
    1. 新たに調製されたケタミン-キシラジンカクテル(ケタミン:75 mg/kg、キシラジン:10 mg/kg)を1 mLの注射器で腹部内注射して麻酔します。注射後は、動物を起こさずに麻酔が効くまで約2〜5分間待ちます。
    2. 自発的な動きやネガティブなつまみ反射がないことを確認することで、十分な麻酔を確認しましょう。LPSは麻酔誘導後5〜8分後に気管内挿入 で 投与されます。実験終了当日には、麻酔誘導後4〜7分後に気管切開や開胸術などの処置を行います。
      注意:適切な麻酔深度は、気管内圧出の成功に不可欠です。過麻酔は嘔吐反射を抑制し、麻酔不足は処置中に苦痛や動きを引き起こすことがあります。実験ごとに一貫性を保つために、新たに準備したLPSを使いましょう。処置中およびその後も動物の注意深く監視し、適切な福祉を確保してください。

2. LPSの気管内挿入

  1. 麻酔の適正性の評価:麻酔カクテル投与後、優しい足つまみ刺激を加えて麻酔の深さを評価します。麻酔状態が確認されたら、挿入プロトコルを進めます。マウスを半横たわりの姿勢で、切歯でしっかりとした支持プラットフォームに吊るします。
  2. 気管可視化:麻酔された動物の口を開け、鉗子で優しく舌を掴み、喉頭鏡を慎重に挿入し、気管開口部を最適に視認できるように正確に位置を合わせます。光が喉頭部を正しく照らし、障害物のないアクセスを可能にしてください。
  3. 舌の操作:湾曲した鈍いピンセットを使って舌を繊細に掴み、上方かつ横方向に優しく引き戻します。
    注意:喉頭解剖学の鮮明さを高めるために携帯型拡大鏡を使用し、挿入装置の精密な整列を確実にしてください。
  4. LPS投与:100μLのLPS溶液を注射器に取り込み、16Gのラット気管管に接続します。気管開口部付近にLPS溶液を投与します。挿入直後は、鈍頭の鉗子を使って2〜4秒ほど鼻孔を優しく塞ぎ、LPS溶液が気管を通じて肺に吸引されるように促します。光源付き喉頭鏡を用いて投与を継続的に監視し、正確かつ完全な投与を確認しましょう。
  5. 術後のモニタリング:LPS分娩に成功した後、舌を適切な解剖学的向きに慎重に再配置します。動物をケージに移し、呼吸機能障害や窒息の兆候がないか少なくとも1分間注意深く観察してください。
  6. 主な考慮事項
    1. 視力:正確なLPS投与のために喉頭鏡の最適な位置合わせを確保しましょう。拡大ツールを使って精度と効果を高めましょう。
    2. 舌を慎重に掴み、下顎や口の縁に当てて安定させます。

3. サンプル採取

  1. 以前の研究で記述された通り、わずかな修正を加えて気管支肺泡洗浄(BAL)を行います。気管切開後、冷たいPBS2mLを肺に優しく注入し、液体を採取します。
  2. 5000 x g で4°Cで5分間遠心分離し、上清液を使って炎症マーカーの検出を行います。肺を採取して組織病理学的検査を行うか、ミエロペルオペルオキシダーゼ(MPO)活性の均質化を行います。採取中はサンプルの完全性を保つために冷蔵保存してください。

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結果

このモデルは、LPS挿入後24時間および120時間の炎症マーカー(IL-1βレベル、MPO活性、総タンパク質含有量、組織病理学)を測定することで検証されました。研究には3つの実験群が含まれ、対照群(未治療)とLPS挿入を受けた2群で、1つは24時間で安楽死、もう1つは120時間で安楽死(機関承認プロトコルに従い)でした。

対照群と比較して、24時間で安楽死したLPS曝露群はIL-1βレベルが有意に増加し、MPO活性および総タンパク質含有量も上昇しました(図1A-C)。肺組織病理学では、肺胞構造の崩壊、肺泡壁の腫れ、溶血、重度の好中球浸潤(図2)が示され、LPS滴入後24時間でALIが誘導されたことを裏付けました。しかし、LPS挿入から120時間後には炎症はほぼ減退し、IL-1β、MPO、総タンパク質レベルがほぼ基準値に戻った(図<...

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ディスカッション

気管内挿入法は、非侵襲的で再現性が高く、標的を絞った肺給付法を提供し、外科的介入を効果的に回避します。この方法は、組織損傷などの外科的外傷に伴うリスクを大幅に減らし、術後の感染症や侵襲的な処置による意図しない臓器損傷の可能性も最小限に抑えます。気管内投与は、薬剤を直接肺に届けることで、正確な局所治療を実現し、治療効果を高めつつ良好な安全性を維持します。これにより、実験モデルにおける気管内挿入術のような侵襲的な方法よりも有利で信頼性の高い代替手段となっています。

本研究では、LPS(5 μg/g体重)を気管内チューブを用いて非侵襲的に肺に投与し、肺葉に有意な炎症反応を引き起こし、信頼性の高いALIモデルを確立しました。ラットはケタミンとキシラジンのカクテルで麻酔されました。ラット気管内チューブを用いて気管を通じて肺にLPSを送り込み、光源付きの喉頭鏡の補助を得ました。BALはLPS投与後24時間および120時間後にこれらの動物に対して実施されました。BAL液から炎症カスケードに関与する主要な炎症促進...

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開示事項

著者たちは競合する金銭的利害関係がないと宣言しています。

謝辞

通信著者のSRは、ラマリンガスワミ・フェローシップからの財政的支援に感謝の意を表します(参考文献番号:BT/RLF/Re-entry/2019年13月13日)、インド政府バイオテクノロジー省。著者たちは、ゴーヴィンド・ヤダヴ博士、ラマジャヤン・パンディアン博士、そしてCSIR-IIIM動物館のスタッフの支援に感謝しています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
 プリズム8グラフパッドhttps://www.graphpad.com/features
ブラッドフォード試薬 ヒメディア、インドML106-500 ML     
DL-ジチオスライトールヒメディア、インド RM525-25G
エオシン ロバ・ケミー、インド3660
エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)ロバ・ケミー、インド6381926
鉗子 -
ホルマリン 10% シグマ・オルドリッチ、アメリカ、nbsp;HT501320
ヘマトキシリンSDFCL74108G05
ヘペスヒメディア、インドMB016
過酸化水素  アヴラ、インド7722841
ケタミン Neon Laboratories Ltd、インド- 
喉頭鏡医療源株式会社(中国)およびnbsp;MS-LA500FV 
大腸菌由来のリポポリ糖O55:B5     シグマ・オルドリッチ、アメリカL2880     
o-ジアニシジンジヒドロ塩化物 シグマ・オルドリッチ、アメリカD3252-5G 
リン酸緩衝食塩水(PBS) インビトロジェン、アメリカ合衆国3002
二水素正リン酸カリウムヒメディア、インドIN26185530500
タンパク質阻害剤カクテルシグマ・オルドリッチP8340
ラットIL-1&β;ELISA キット サーモフィッシャー、アメリカBMS630
塩化ナトリウムヒメディア、インドTC046M
フッ化ナトリウムヒメディア、インドGRM7502
オルトバナデートナトリウムシグマ・オルドリッチ、アメリカS6508
ピロリン酸ナトリウムメルク、アメリカMA3M722243
硫酸シグマ・オルドリッチ、アメリカ339741
トライトン X-100サーモフィッシャー、アメリカT8787
キシラジン インディアン・イノミゾロジカルズ社、インド-

参考文献

  1. Rayees, S., et al. Macrophage TLR4 and PAR2 signaling: Role in regulating vascular inflammatory injury and repair. Front Immunol. 18 (11), 2091(2020).
  2. Bernard, G. R., et al. The American-European Consensus Conference on ARDS. Definitions, mechanisms, relevant outcomes, and clinical trial coordination. Am J Respir Crit Care Med. 149 (3), 818-824 (1994).
  3. Banavasi, H., Nguyen, P., Osman, H., Soubani, A. O. Management of ARDS - What works and what does not. Am J Med Sci. 362 (1), 13-23 (2021).
  4. Bellani, G., et al. Epidemiology, patterns of care, and mortality for patients with acute respiratory distress syndrome in intensive care units in 50 countries. JAMA. 315 (8), 788-800 (2016).
  5. Rubenfeld, G. D., et al. Incidence and outcomes of acute lung injury. N Engl J Med. 353 (16), 1685-1693 (2005).
  6. Aliberti, S., Dela Cruz, C. S., Amati, F., Sotgiu, G., Restrepo, M. I. Community-acquired pneumonia. Lancet. 398 (10303), 906-919 (2021).
  7. Gregorakos, L., et al. Near-drowning: clinical course of lung injury in adults. Lung. 187 (2), 93-97 (2009).
  8. Hu, X., Lee, J. S., Pianosi, P. T., Ryu, J. H. Aspiration-related pulmonary syndromes. Chest. 147 (3), 815-823 (2015).
  9. Wang, L., Wu, D., Wang, J. Chlorine gas inhalation manifesting with severe acute respiratory distress syndrome successfully treated by high-volume hemofiltration: A case report. Medicine. 97 (30), e11708(2018).
  10. Sung, P. S., Peng, Y. C., Yang, S. P., Chiu, C. H., Hsieh, S. L. CLEC5A is critical in Pseudomonas aeruginosa-induced NET formation and acute lung injury. JCI Insight. 7 (18), e156613(2022).
  11. Al-Kuraishy, H. M., Al-Gareeb, A. I., Alblihed, M., Cruz-Martins, N., Batiha, G. E. COVID-19 and risk of acute ischemic stroke and acute lung injury in patients with type II diabetes mellitus: The anti-inflammatory role of metformin. Frontiers Med. 19 (8), 644295(2021).
  12. Al-Kuraishy, H. M., Al-Gareeb, A. I., Al-Niemi, M. S., Alexiou, A., Batiha, G. E. Calprotectin: The link between acute lung injury and gastrointestinal injury in Covid-19: Ban or boon. Curr Protein Peptide Sci. 23 (5), 310-320 (2022).
  13. Al-Kuraishy, H. M., et al. COVID-19 and phosphodiesterase enzyme type 5 inhibitors. J Micros Ultrastruc. 8 (4), 141-145 (2020).
  14. Al-Kuraishy, H. M., Al-Gareeb, A. I., Qusty, N., Alexiou, A., Batiha, G. E. Impact of sitagliptin on non-diabetic COVID-19 patients. Current Mol Pharmacol. 15 (4), 683-692 (2022).
  15. Yu, X., et al. Loss of PADI2 and PADI4 ameliorates sepsis-induced acute lung injury by suppressing NLRP3+ macrophages. JCI Insight. 9 (22), e181686(2024).
  16. Calfee, C. S., et al. Acute respiratory distress syndrome network, national heart, lung, and blood institute. Trauma-associated lung injury differs clinically and biologically from acute lung injury due to other clinical disorders. Crit Care Med. 35 (10), 2243-2250 (2007).
  17. Zhou, M. T., Chen, C. S., Chen, B. C., Zhang, Q. Y., Andersson, R. Acute lung injury and ARDS in acute pancreatitis: mechanisms and potential intervention. World J Gastroenterol. 16 (17), 2094-2099 (2010).
  18. Roubinian, N. TACO and TRALI: biology, risk factors, and prevention strategies. Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 1, 585-594 (2018).
  19. Fernandes, C. A., Vanbever, R. Pre-clinical models for pulmonary drug delivery. Expert Opin Drug Deliv. 6 (11), 1231-1245 (2010).
  20. Yu, P., et al. Non-invasive intratracheal lipopolysaccharide instillation in mice. J Vis Exp. (193), e65151(2023).
  21. Price, D. N., Muttil, P. Delivery of therapeutics to the lung. Methods Mol Biol. 1809, 415-429 (2018).
  22. Driscoll, K. E., et al. Intratracheal instillation as an exposure technique for the evaluation of respiratory tract toxicity: uses and limitations. Toxicol Sci. 55 (1), 24-35 (2000).
  23. Hendrix, J. M., Regunath, H. Intubation endotracheal tube medications. [Updated 2025 Jan 19]. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2025).
  24. DeMasi, S. C., Casey, J. D., Semler, M. W. Evidence-based emergency tracheal intubation. Am J Respir Crit Care Med. 211 (7), 1156-1164 (2025).
  25. Greenberg, M. I. The use of endotracheal medication in cardiac emergencies. Resuscitation. 12 (3), 155-165 (1984).
  26. Rayees, S., et al. PAR2-Mediated cAMP generation suppresses TRPV4-dependent Ca2+ signaling in alveolar macrophages to resolve TLR4-induced inflammation. Cell Rep. 27 (3), 793-805 (2019).
  27. Arfath, Y., et al. TRPV4 facilitates the reprogramming of inflamed macrophages by regulating IL-10 production via CREB. Inflamm Res. 73 (10), 1687-1697 (2024).
  28. Rochford, I., et al. Evidence for reprogramming of monocytes into reparative alveolar macrophages in vivo by targeting PDE4b. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 321 (4), L686-L702 (2021).
  29. Liu, F., Li, W., Pauluhn, J., Trübel, H., Wang, C. Lipopolysaccharide-induced acute lung injury in rats: comparative assessment of intratracheal instillation and aerosol inhalation. Toxicology. 8 (304), 158-166 (2013).
  30. Hagawane, T. N., Gaikwad, R. V., Kshirsagar, N. A. Dual hit lipopolysaccharide and oleic acid combination induced rat model of acute lung injury/acute respiratory distress syndrome. J Med Res. 143 (5), 624-632 (2016).
  31. Rayees, S., et al. Protease-activated receptor 2 promotes clearance of Pseudomonas aeruginosa infection by inducing cAMP-Rac1 signaling in alveolar macrophages. Front Pharmacol. 20 (13), 874197(2022).
  32. Rayees, S., et al. Therapeutic effects of R8, a semi-synthetic analogue of Vasicine, on a murine model of allergic airway inflammation via STAT6 inhibition. Int Immunopharmacol. 26 (1), 246-256 (2015).
  33. Joshi, J. C., et al. SPHK2-Generated S1P in CD11b+ Macrophages blocks STING to suppress the inflammatory function of alveolar macrophages. Cell Rep. 30 (12), 4096-4109 (2020).
  34. Balzer, C., Cleveland, W. J., Jinka, T. R., Riess, M. L. Video laryngoscopic oral intubation in rats: A simple and effective method. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 318 (5), L1032-L1035 (2020).

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