Method Article

細菌、腸、免疫細胞における毒物学的および免疫調節療法のための非同期システムを開発するための3Dフリップウェル工学

DOI:

10.3791/68701

⸱

October 17th, 2025

 , 
1Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, 2MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この記事では、3D フリップウェルのエンジニアリングと利用をガイドするための重要な手順を含む詳細なプロトコルを提供します。共培養インサートスタックを組み立て、腸内細菌、腸内上皮、マクロファージの層状層を共培養して腸粘膜環境をモデル化する方法を説明および示します。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

免疫細胞の分極と腸粘膜の恒常性における細菌のセクレトームの役割を研究するために、市販のインサートを背中合わせのスタック形式で使用した3次元共培養モデルを開発しました。私たちはこのシステムを3Dフリップウェルと呼び、細菌、結腸上皮、免疫細胞を層状層で共培養して、腸粘膜微小環境を再現することに成功しました。この共培養システムは、膜の片側に結腸上皮細胞を、もう片側に未分化の非接着性単球を播種することができ、前分化マクロファージを剥離して再プレーティングすることなく、単一の共培養内で結腸上皮分極、粘液形成、単球-マクロファージの分化と分極を同期的に進行させることができます。このシステムは構築が簡単で、すぐに入手できる材料とツールがいくつか必要です。一酸化窒素シンターゼ(NOS)の補因子であるBH4 (テトラヒドロビオプテリン)の内因性前駆体であるセピアプテリン(SEP)に対する共培養成分の応答を解析することにより、その有用性を検証しました。3D FlipwellのSEP処理が、腸内細菌によるバイオフィルム形成、結腸上皮による粘液産生、およびマクロファージの免疫原性促進性分極を誘導することを実証しました。これは、SEPが異なる細胞成分間のクロストークを通じて粘膜防御機構の活性化を引き起こすことを示しました。免疫細胞のリプログラミングにつながる粘膜コミュニケーションの役割を調査し、新しい免疫調節療法をスクリーニングするためのこの共培養システムの有用性を評価するには、さらなる実験が必要です。

Introduction

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免疫細胞と腸内マイクロバイオームのクロストークは、さまざまな疾患治療の有効性に大きく影響します。このようなクロストークは、宿主の代謝異常、食事の変化、疾患の発現、および薬理学的治療を含むがこれらに限定されない外部刺激によって著しく変化します。これらの変化は、微生物叢の組成の不均衡、つまり腸内細菌叢の異常と呼ばれる状態につながる可能性があります 1,2,3。

腸内の微生物と宿主免疫細胞との相互作用をよりよく理解するために、腸粘膜環境を要約しようとして、さまざまなグループによって精巧な共培養システムが開発されました。Kimらによって開発されたガットオンチップシステム4 から、特殊な吸収基質5を使用したより複雑なアセンブリまで、これらの共培養システムは構築が単純ではなく、共培養基質による吸収のために分泌成分の全スペクトルを保持することができません。したがって、Noelらは、比較的簡単に作製できる腸粘膜をモデル化するための代替共培養システムを開発しました6。この新しいシステムは、膜の片側に結....

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Protocol

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1. 3D フリップウェルエンジニアリング

  1. すべての作業は細胞培養キャビネット内で行う必要があります。すべての消耗品をキャビネット内に入れます。
  2. シャーレのカバーを開けて取っておきます。メスの刃を保護ケーシングから開き、ペトリ皿の底の端に置きます。無菌性を確保します。
    注意: メスの刃は慎重に取り扱う必要があります。必要に応じて、切り傷に強い繊維強化手袋を使用して手を保護してください。
  3. 12ウェル市販のインサートの滅菌保護パッケージを開きます。無菌性を確保します。滅菌ピンセットのセットを取ります。インサートをそっとつかみ、パッケージから取り出します。
  4. インサートの底面が上を向くように持ちます。もう一方の手で、滅菌メスの刃を取り、インサートに近づけます。
  5. C字型の動きでメンブレンの端を突き刺し、メスの刃をインサートの底の周りでそっとスライドさせ、プラスチックの壁に近づけます。
  6. PETメンブレンを切り取り、2セット目のピンセットを使用してメンブレンを取り外します。メンブレンを廃棄します。
  7. メスの刃を使用して白い膜の削りくずをこすり落とし、インサートの端と縁をきれいにします。新しく準備したインサートを元の滅菌パックに慎重に戻します。
  8. 次に、シリコン粘着チューブを取り、メ....

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Results

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腸内細菌、結腸上皮、およびマクロファージのフリップウェル共培養の生物学的関連性を判断するために、アルギニン代謝の調節剤であるセピアプテリン(SEP)で共培養物を処理し、対照DMSOと比較して一酸化窒素9,10,11の産生を促進しました。免疫蛍光(IF)顕微鏡と走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて、共培養の各成分に対するSEP処理の効果を測定しました。染色では、上皮マーカータンパク質CK20および粘膜タンパク質MUC2の増加が示すように、SEP処理後の腸上皮コンパートメントにおける粘液分泌の劇的な増加が示されました(図1)。また、SEP治療により、M1マクロファージマーカーCD80のレベルが上昇し、M2マクロファージマーカーCD163がダウンモジュレートされ、M1の分極を示すこともわかりました(

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Discussion

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腸粘膜構造を in vitroで再現するために、腸内細菌、粘液産生結腸上皮細胞、マクロファージの層状層からなるシンプルな共培養システムを設計しました。このマルチ共培養システムにより、細菌のセクレトーム、腸上皮、マクロファージ間のクロストークが免疫原性リプログラミングと粘膜防御機構の誘導に及ぼす影響を研究することができました。

3D フリップウェルを作成する際の重要な注意点の 1 つは、アセンブリを無菌環境で行い、その後細胞を播種する前に数日間 UV 滅菌する必要があることです。機能的なUVライトを備えたBSL2キャビネットを利用して、滅菌プロセスを完了しました。最初の滅菌ステップでは、滅菌されたツールと 70% エタノールが概説どおりに使用されました。構築段階では、数回の試行後に一貫したシリコーン接着ビーズが達成され、再現性の向上につながります。このテクニックを実践し、追加のインサートスタックを準備することが有益な場合があります。インサートアセンブリを反転させた後に気泡を除去するには、15G 強制.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者は利益相反を宣言しません。著者は、明示的か黙示的かを問わず、法律で認められる最大限の範囲で、すべての保証を否認します。いかなる状況においても、著者は、法令、契約、不法行為、またはその他の法理論に基づくかにかかわらず、フリップウェルの構築におけるツールの使用、BSL試薬の使用、細胞株、細菌培養、嫌気性チャンバー内の嫌気性環境下でのフリップウェルシステムの使用に起因または関連する特別、偶発的、間接的、懲罰的、多重、または結果的な損害について責任を負わないものとします。この責任の制限には、本書に明示的に記載されていない不特定のFlipwellの使用方法が含まれますが、これらに限定されません。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

主著者は、古田沙織先生の優れたメンターシップスキル、長距離にわたる継続的な指導とサポート、そして素晴らしい学習機会を育む巧みで継続的なプロジェクト設計に心から感謝の意を表します。著者らはまた、微生物学の専門知識と指導を提供してくれたVandana Sharma博士と、THP-1マクロファージの調製についてVeani R. Fernando博士に感謝します。 さらに、著者らは、電子顕微鏡施設のアンドリュー・クラインヘンツ博士とウィリアム・T・ガニング博士、トレド大学計装センターのカサンドラ・サモラ博士とクリスティン・キルシュバウム博士に、EMイメージングに関する建設的な提案をしてくれたことに感謝しています。この研究は、トレド大学健康科学キャンパス、医学生命科学部、がん生物学部からSFへのスタートアップファンドによって支援されました。SF へのオハイオ州がん再検索助成金 (プロジェクト #: 5017)。医学研究協会(トレド財団、#206298)SFへの賞。SF への米国癌協会研究奨学生助成金 (RSG-18-238-01-CSM)。SFへの国立がん研究所研究助成金(R01CA248304)。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0.4%PFA(試薬および溶液のレシピ参照)本文で説明されています
10ml血清学ピペットコーニング4488
12井TCプレート、および共演者コーニング3513
15ml円錐管、SpectraTubeアルカリ・サイエンティフィックC2715
200 & マイクロ;l tips  USAサイエンティフィック1111-1700
24ウェルインサート - 24ウェルプレート、PET 0.4およびマイクロ用の培養インサート;m ブランドテック・サイエンティフィック782710
3Dフリップウェルは既製でUV滅菌処理済みです。ラボで作る
4%PFA(試薬と溶液のレシピを参照)本文で説明されています
50 mMセピアプテリンストック(SEP、試薬および溶液のレシピを参照)経歴 河南化工有限公司CAS#: 17094-01-8
50ml円錐管グライナー・バイオ・ワン227261
5ml血清学ピペットコーニング4487
エタノール(エチルアルコール)70〜95%デコン・ラボ04-355-151
アルミホイルフィッシャー・サイエンティフィック01-213-100
動物用餌針、20ゲージ 1.5インチ長さ、単回使用 フィッシャー・サイエンティフィック01-208-87
抗体希釈バッファー(試薬および溶液のレシピ参照)本文で説明されています
アットフルア細胞室 サーモフィッシャー・サイエンティフィックA7816
オートクレーブテープフィッシャー・サイエンティフィック15-901-111
グリセロールストック中のバチルス・サブティリス(3A1T)株()バチルス遺伝ストックセンター(https:// bgsc. org/
BioGrip ピンク ニトリルパウダーフリーのラテックスフリー手袋最高品質の製造P2810
ブロッキングバッファー(レシピ「Reagents and Solutions」参照 - PBSの10%通常のヤギ血清)本文で説明されています
ブロッキングバッファ(試薬と溶液のレシピを参照)本文で説明されています
ブライトフィールド顕微鏡(ニコンまたは同等の機器)エクリプスTs2ニコンTS2
カコ-2細胞ATCCHTB-37
細胞培養インキュベーター、37°C、5% CO2(Eppendorf CellXpert)エッペンドルフ6734010015
遠心分離機(エッペンドルフ、遠心分離機5804/5804 Rまたは同等品)エッペンドルフ22622501
遠心分離機管 50 ml SpectraTubeアルカリ・サイエンティフィックC2750
12ウェルプレート、PET、0.4およびマイクロの培養インサート;M、不妊ブランドテック・サイエンティフィック、BRAND Insert 2in1、BIO-CERT782730
DAPI VectaShieldマウントメディアベクター研究所H-1000
深いペトリ皿の底、100 x 25 mmの深層ポリスチレン積み式ペトリ皿、無菌 USAサイエンティフィック8609-0625
ドラモンド・ピペット・エイドXPDrummondとnbsp;4-000-101
エッペンドルフ5804 スイングバケットローター付き遠心分離機(50ml円錐管用)エッペンドルフ22622501
鉗子、ステンレススチール、滅菌高圧滅菌、2セットVWR82027-438
鉗子、ステンレス製、滅菌高壓滅菌器、2セット、標本鉗子VWR82027-438
ガラスフラスコ 500mlコーニング 4980-500
ヘマサイトメーター(カバースリップ付きノイバウアー)サーモフィッシャー・サイエンティフィック50-312-90
HT-29-MTX-E12細胞ミリポール・シグマ12040401
ImmunoPen(任意)フィッシャー・サイエンティフィック4021761EA
ケブラー製またはその他の耐切り手袋(オプション)ホームセンターかAmazon
ラボテープまたは出荷用テープフィッシャー・サイエンティフィック 159015R
層流フード 1300シリーズ A2 BSC クラスIIサーモフィッシャー・サイエンティフィック1375
UVライト付き層流フード SterilGARDベイカー・カンパニーSG403A-HE
マーカーの溶剤耐性VWR52877-310 または 95042-566
Caco-2細胞用培地(DMEM高グルコースベース、試薬および溶液のレシピを参照)説明は以下に記載されています。テキスト
HT-29細胞用培地(DMEM高グルコース、試薬および溶液のレシピ参照)本文で説明されています
THP-1細胞用培地(RPMI、試薬および溶液のレシピを参照)本文で説明されています
マイクロ遠心分離機チューブ、1.7 ml、無菌・nbsp;アルカリ・サイエンティフィックC3017-ST
マイクロ遠心分離機チューブサーモ・フィッシャー3451
ミラーLBメディア(試薬と溶液のレシピを参照)シグマ・オルドリッチ L3522
ニードルノーズプライヤー、2セットホームセンターかAmazon
ニトリルパウダーフリーラテックスフリー手袋 オーレリア アメイジング中等科学92885
ペトリ皿の蓋、無菌ファルコンペトリ皿 無菌100x15mmスタイルコーニング社351029
フォボルミリステート酢酸(PMA)(100 ng/μl、試薬と溶液のレシピを参照) インビボジェンTLRL-pma
ピペットチップ(10 & micro;l、200 & micro;l、1000 & micro;l) PurePointまたは同等のものアルカリ科学 ST1010-CS、ST1200-CS、ST1000-CS
ラップ乾物屋
純粋化作業コラーゲナーゼ溶液(100 & micro;g/mL)高度なバイオマトリックス5005-100ML
丸いカバースリップ #1 1オンス(コーニングフロートグラスまたはフィッシャーブランド)コーニングまたはフィッシャーブランド50143822または12-546-2 25CIR-2
メス刃、無菌、使い捨てなど;モペックかフェザー #10AJ136または2975#10
セピアプテリン(SEP、100および微量;M、試薬と溶液のレシピを参照してください)経歴 河南化工有限公司CAS#: 17094-01-8
振動インキュベーターは220rpm、37度、Cエッペンドルフ・ニューブランズウィック・サイエンティフィックM12990080
シリコーン接着剤 ロクタイトクリア シリコーンIDHまたは3Mマリングレードシリコーンシーラント ノーズチップ付きクリアロックタイトまたは3M1745658かPN08019
シングルチャネルピペット Eppendorf Research Plus、200 & micro;lエッペンドルフ
シングルチャネルピペット(10およびマイクロ;l、200 & micro;l、1000 & micro;l)エッペンドルフ2231001122
分光光度計 NanoDropOneCサーモフィッシャー・サイエンティフィック13-400-519
滅菌脱イオン水  
カルシウムやマグネシウムを含まない無菌リン酸塩緩衝セリン(PBS)フィッシャー・サイエンティフィック BSS-PBS-1X6
注射器 3mlまたは5ml、Luer-Lokチップ付きBD309585か309603
THP-1細胞ATCCTIB-202
トランスファーピペット、滅菌フィッシャーブランド13-711-20
トライトン X-100ミリポール・シグマX100
トリパンブルー溶液VWR97063-702
トリプシン-EDTA 0.25%サーモフィッシャー・サイエンティフィック25200-056
Kimwipes ProfessionalをLintGuard Anti-Stat Polyshieldで拭くキンバリー・クラーク34120
<強力>一次抗体: 
反人間CD163アブカム156769
反人間CD68ノバス・バイオロジカルズNB100-683-0.1 mg
反ヒトCD80、E3Q9V細胞シグナル伝達技術15416
反ヒューマンCK20 ライフ・テクノロジーズPA5-82875
反ヒトMUC2(996/1)サーモフィッシャーMA5-12345
<強い>二次抗体:
Alexa Fluor 488 ヤギ抗ウサギIgG(CD80およびCK20用)サーモフィッシャーA11008
Alexa Fluor 594 ヤギ抗マウスIgG(MUC2およびCD68またはCD163用)サーモフィッシャーA11005
<強力>試薬および溶液:  
<ストロング>カコ-2 ミディアム:
高グルコース(4.5g/L)および1%(v:v)GlutaMax を含むDMEM;サーモフィッシャー・サイエンティフィック35050061
FBS 10%(v:v)熱不活性化シグマF2242-500ML
非必須アミノ酸はCaco-2培地に1%サーモフィッシャー・サイエンティフィック11140076
ペン溶連菌 1%(v:v)シグマF2242-500ML
<ストロング>HT-29-MTX中
高グルコース(4.5g/L)および1%(v:v)GlutaMax を含むDMEM;サーモフィッシャー・サイエンティフィック35050061
FBS 10%(v:v)熱不活性化シグマF2242-500ML
HEPES(最終濃度10 mM)サーモフィッシャー・サイエンティフィック15630080
ペン溶連菌 1%(v:v)シグマF2242-500ML
<ストロング>THP-1 ミディアム:
FBS(10% v:v)熱不活化胎児用牛血清シグマ F2242-500ML
グルコース(最終濃度4.5 g/L)サーモフィッシャー・サイエンティフィックA249001
グルタマックス 1% (v:v) 最終濃度2 mMサーモフィッシャー・サイエンティフィック35050061
HEPES(最終濃度10 mM)サーモフィッシャー・サイエンティフィック15630080
ペン溶連菌 1%(v:v)シグマF2242-500ML
ロズウェル・パーク記念研究所(RPMI)-1640中型サーモフィッシャー・サイエンティフィック11875119
ピルビン酸ナトリウム(最終濃度1 mM)サーモフィッシャー・サイエンティフィック11360070
<ストロング>純酸の作動コラーゲナーゼ溶液(希釈して1:30 100 & micro;g/ml):
ピュアコール3mg/ml、1:30から100mg、マイクロ量;g/ml 高度なバイオマトリックス5005-100ML
無菌脱イオン水
<強力>L-セピアプテリンストック溶液(50 mM):
L-セピアプテリン(SEP)経歴 河南化工有限公司CAS#: 17094-01-8
<ストロング>フォボルミリステート酢酸ストック溶液(PMA、5 mg/mL)<ストロング>インビボジェンTLRL-pma
BSA 1% 牛血清アルブミン シグマ・オルドリッチ5470
DMSO シグマ D2650
ミラーLBシグマ・オルドリッチ L3522
二次抗体と同じ種の正常な血清シグマ NS02L-1ML
パラホルムアルデヒドシグマ・オルドリッチ441244

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications. J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).
  2. Xuan, C., et al.

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