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方法論記事

細菌、腸、免疫細胞における毒物学的および免疫調節療法のための非同期システムを開発するための3Dフリップウェル工学

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DOI:

10.3791/68701

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2025年10月17日

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1Division of Pediatric Rheumatology, Department of Pediatrics, University of Michigan, Ann Arbor, 2MetroHealth Medical Center, Case Western Reserve University School of Medicine, Case Comprehensive Cancer Center

この記事について

サマリー

この記事では、3D フリップウェルのエンジニアリングと利用をガイドするための重要な手順を含む詳細なプロトコルを提供します。共培養インサートスタックを組み立て、腸内細菌、腸内上皮、マクロファージの層状層を共培養して腸粘膜環境をモデル化する方法を説明および示します。

要約

免疫細胞の分極と腸粘膜の恒常性における細菌のセクレトームの役割を研究するために、市販のインサートを背中合わせのスタック形式で使用した3次元共培養モデルを開発しました。私たちはこのシステムを3Dフリップウェルと呼び、細菌、結腸上皮、免疫細胞を層状層で共培養して、腸粘膜微小環境を再現することに成功しました。この共培養システムは、膜の片側に結腸上皮細胞を、もう片側に未分化の非接着性単球を播種することができ、前分化マクロファージを剥離して再プレーティングすることなく、単一の共培養内で結腸上皮分極、粘液形成、単球-マクロファージの分化と分極を同期的に進行させることができます。このシステムは構築が簡単で、すぐに入手できる材料とツールがいくつか必要です。一酸化窒素シンターゼ(NOS)の補因子であるBH4 (テトラヒドロビオプテリン)の内因性前駆体であるセピアプテリン(SEP)に対する共培養成分の応答を解析することにより、その有用性を検証しました。3D FlipwellのSEP処理が、腸内細菌によるバイオフィルム形成、結腸上皮による粘液産生、およびマクロファージの免疫原性促進性分極を誘導することを実証しました。これは、SEPが異なる細胞成分間のクロストークを通じて粘膜防御機構の活性化を引き起こすことを示しました。免疫細胞のリプログラミングにつながる粘膜コミュニケーションの役割を調査し、新しい免疫調節療法をスクリーニングするためのこの共培養システムの有用性を評価するには、さらなる実験が必要です。

概要

免疫細胞と腸内マイクロバイオームのクロストークは、さまざまな疾患治療の有効性に大きく影響します。このようなクロストークは、宿主の代謝異常、食事の変化、疾患の発現、および薬理学的治療を含むがこれらに限定されない外部刺激によって著しく変化します。これらの変化は、微生物叢の組成の不均衡、つまり腸内細菌叢の異常と呼ばれる状態につながる可能性があります 1,2,3。

腸内の微生物と宿主免疫細胞との相互作用をよりよく理解するために、腸粘膜環境を要約しようとして、さまざまなグループによって精巧な共培養システムが開発されました。Kimらによって開発されたガットオンチップシステム4 から、特殊な吸収基質5を使用したより複雑なアセンブリまで、これらの共培養システムは構築が単純ではなく、共培養基質による吸収のために分泌成分の全スペクトルを保持することができません。したがって、Noelらは、比較的簡単に作製できる腸粘膜をモデル化するための代替共培養システムを開発しました6。この新しいシステムは、膜の片側に結腸上皮細胞を播種し、もう片側に前分化マクロファージを播種した単一の培養インサートを利用します6。ただし、前分化マクロファージを播種するには、別の場所での前分化と解離と共培養への再培養が必要であり、細胞の完全性と生存率に影響を与える可能性があります。

これらの以前のシステムへの改良を組み込むことにより、3Dフリップウェルシステム7,8と呼ばれる新しい3次元(3D)多層共培養システムを開発しました。このシステムは、細胞培養インサートを背中合わせに積み重ねたもので構成されており、1回の共培養内で結腸上皮分極、粘液形成、マクロファージ分化、分極を同期的に進行させることができます。このシステムにより、腸粘膜環境の変化や、腸内細菌、上皮細胞、免疫細胞間の相互作用を調べることができます。さらに、このシステムは、腸粘膜および体の他の部分に対する細菌代謝産物、毒素、食事栄養素、医薬品などの外部刺激の影響を調べるために使用できます7,8。

新しい共培養インサートシステムを利用して、一酸化窒素シンターゼ(NOS)の補因子であるBH4(テトラヒドロビオプテリン)の内因性前駆体であるセピアプテリン(SEP)に対するさまざまな細胞成分の応答を調べました。以前、SEPが腫瘍関連マクロファージを免疫原性促進型9,10,11,12に再プログラミングすることにより、乳房腫瘍微小環境に免疫原性促進活性を発揮することを示しました。SEPが腸内細菌によるバイオフィルム形成、結腸上皮による粘液産生、および共培養におけるマクロファージの免疫原性促進性分極の同時イベントを誘導し、粘膜防御メカニズムの活性化を示すことを実証しました7。これらの発見は、腸粘膜微小環境のモデル化におけるこの新しい共培養システムの有用性を裏付けています7。

このプロトコルの全体的な目標は、腸内細菌、腸内上皮、粘液、および免疫細胞のこの新しい共培養を構築して、腸粘膜環境をモデル化するための段階的な指示を提供することです。また、SEP処理などの外部刺激の影響下で共培養細胞のクロストークを視覚化する方法も実証します。この共培養システムを利用したさらなる研究は、共培養における異なる細胞間の相互作用を促進する分泌細胞成分を決定し、新しい治療法のハイスループットスクリーニングのためのこの共培養モデルの有用性をテストするために必要です。さらに、腸粘膜環境の生理学的状態を達成するには、この共培養システムにさらなる変更が必要になります。たとえば、好気性哺乳類細胞を嫌気性細菌と共培養するには、他の場所で報告されているように、これらの細菌を酸素を除去する嫌気性培地で別々に培養するか、酸素の侵入を防ぐ液体パラフィンで重ねる必要があります。この共培養システムのこのような高度な有用性と応用は、さらなる調査を正当化するでしょう。

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プロトコル

1. 3D フリップウェルエンジニアリング

  1. すべての作業は細胞培養キャビネット内で行う必要があります。すべての消耗品をキャビネット内に入れます。
  2. シャーレのカバーを開けて取っておきます。メスの刃を保護ケーシングから開き、ペトリ皿の底の端に置きます。無菌性を確保します。
    注意: メスの刃は慎重に取り扱う必要があります。必要に応じて、切り傷に強い繊維強化手袋を使用して手を保護してください。
  3. 12ウェル市販のインサートの滅菌保護パッケージを開きます。無菌性を確保します。滅菌ピンセットのセットを取ります。インサートをそっとつかみ、パッケージから取り出します。
  4. インサートの底面が上を向くように持ちます。もう一方の手で、滅菌メスの刃を取り、インサートに近づけます。
  5. C字型の動きでメンブレンの端を突き刺し、メスの刃をインサートの底の周りでそっとスライドさせ、プラスチックの壁に近づけます。
  6. PETメンブレンを切り取り、2セット目のピンセットを使用してメンブレンを取り外します。メンブレンを廃棄します。
  7. メスの刃を使用して白い膜の削りくずをこすり落とし、インサートの端と縁をきれいにします。新しく準備したインサートを元の滅菌パックに慎重に戻します。
  8. 次に、シリコン粘着チューブを取り、メスの刃でノズルの先端を切り取り、開口部を作ります。この開口部の幅は3mmである必要があります。
  9. ペーパータオルの接着剤を絞り出してビーズのサイズをテストします。ビーズの厚さは2〜3mmにする必要があります。ビードが2mm未満でチューブから絞り出すのが難しい場合は、ノズルを調整してください。
    1. グルービーズを塗布して広げる別の方法は、先端を切り取った状態で200 μLのピペットチップを使用することです。はさみで3〜4mm切り取り、へらを使用してインサートの縁の周りに接着剤を広げます。
  10. 2番目のインサートから保護カバーをはがし、取っておきます。滅菌鉗子を手に取り、メンブレンを上に向けてパッケージから2番目のインサートを取り出します。
  11. メンブレンに触れないように注意しながら、インサートの底面の周りに2〜3 mmのシリコンの薄いビーズをそっと広げます。
  12. 滅菌鉗子の2セット目を持ち上げ、最初のインサート(メンブレンなし)を保護パックから慎重に持ち上げます。
  13. 下の縁が揃うように、2つのインサートを下から下に合わせます。余分な接着剤が接合部から押し出される場合があります。接着剤を乾かして放置します。接着剤が完全に乾いた後(24〜72時間)に切り取ることができます。これはオプションです。
    注:最終的なフリップウェル共培養インサート(FCI)スタックには、中央にPETメンブレンが1つだけある必要があります。市販のインサートのL字型のハンドルは、互いに180°離れた位置(3時と6時)に配置するのが最善です。乾燥時間については、シリコーン接着剤メーカーの推奨に従ってください(ブランドによっては24〜72時間です)。ほとんどのシリコーンベースの接着剤では、72時間の乾燥時間が好ましい。接着剤は、UV滅菌で24時間だけ乾燥させることもできます。
  14. FCIスタックを接着したら、元の滅菌パックの中に入れて乾燥させるか、深いペトリ皿の中に置きます。指定されたペトリ皿の蓋を使用して、スタックアセンブリを覆います。
  15. スタックアセンブリを滅菌するには、ペトリ皿の蓋を開けます。滅菌鉗子を使用して、指定された深いペトリ皿の縁にFCIスタックを渡します。
  16. BSCキャビネットのガラスサッシを閉じます。UVライトをオンにします。安全のためにキャビネットから離れ、メンブレンの両面を30分〜1時間滅菌します。各滅菌サイクルが完了したら、UVライトをオフにしてください。
  17. シャーレの蓋(指定どおり)をインサートスタックのあるペトリ皿の上に置き、取っておきます。

2. コラーゲンコーティング前の漏れのテスト

  1. ペトリ皿の蓋を外します。500 μLの滅菌PBSまたは滅菌脱イオン水を加えます。
    注: 視覚補助のために、DMEM を使用して FCI スタックの整合性を視覚化しました。
  2. ペトリ皿に蓋をします。一晩休ませてください。朝にFCIの整合性をチェックします。漏れが検出された場合は、FCI を廃棄します。必要に応じて新しい挿入スタックを作成します。
  3. 試験に使用した液体(PBSまたは水)を吸引します。シャーレに蓋をします。
  4. スタックをBSC内で乾燥させます(1〜2時間)。FCIを使用する準備ができるまでBSCに保存するか、接着細胞を播種するためにコラーゲンでコーティングします。

3. フリップウェルメンブレンのコラーゲンコーティング

  1. 3 mg/mLで供給されたコラーゲン溶液を100 μg/mLで1:30希釈に希釈することにより、コラーゲン溶液のワーキングストックを調製します。微量遠心チューブ内の1 mLの滅菌脱イオン水に33 μLの市販のコラーゲン溶液を加えます。ボルテックスで混合します。
    注:より大きな容量の場合は、メンブレンの両側にコーティングするインサートスタックの数に応じて、スケールアップして15 mLコニカルチューブを使用します。毎回新鮮にしてください。作業ストックを再利用しないでください。
  2. シャーレの蓋を開けます。フリップウェルをペトリ皿の縁からぶら下げます。200 μLのコラーゲン溶液をインサートスタックの片側に慎重に加えます。
  3. 1時間放置します。コラーゲン溶液を吸引します。200 μLの滅菌PBSを加えます。PBSを吸引します。
  4. ペトリ皿に蓋をして、キャビネット内でメンブレンを60分間乾燥させます。メンブレンが乾いたら、滅菌鉗子/ピンセットを取り、フリップウェルを反対側にひっくり返し、ペトリ皿の縁からぶら下げます。
  5. 200 μLのコラーゲン溶液をメンブレンのコーティングされていない(現在は上面)側に加えます。1時間放置します。
  6. コラーゲン溶液を吸引します。200 μLの滅菌PBSを加えます。PBSを吸引します。シャーレに蓋をして、キャビネット内でメンブレンを60分間乾燥させます。FCIスタックを一晩乾燥させるか、同じ日に播種します。
    注:コラーゲンコーティングの完全性は、長期保存条件下でテストされていません。フリップウェルがプレコートされたら、24時間以内に使用する必要があります。

4. 細菌培養のための細菌インサート構造

  1. 2セットの滅菌鉗子と24ウェルインサートをBSC内に配置します。インサートを慎重に開け、滅菌パッケージの中に置いてまませます。
  2. 滅菌ピンセットを使用して、インサートを滅菌パックから持ち上げます。ピンセット/鉗子の2セット目で、インサートの下部にある小さなプラスチックの足を折ります。
  3. 24ウェルインサートを滅菌FCIスタックまたは元の12ウェルインサートの1つに取り付けてテストします。
  4. インサートがウェルに滑り込まない場合は、ピンセットをもう一度使用して、リムと足が接するリムからさらにプラスチック材料を剥がします。
  5. 24ウェルインサートが12ウェルインサートウェル内をスライドできるようになるまで、フィットを再度テストします。インサートを滅菌パック内または滅菌ペトリ皿の中に入れます。
  6. インサートをUV滅菌またはエタノールします(オプション)。パックを元に戻すか、使用する準備ができるまでペトリ皿の蓋で覆います。

5. 針の構造

  1. 工具とすべての消耗品をBSC内に持ち込みます。ノーズプライヤーで針を慎重に持ちます。
  2. 定規を使用して、針の各曲がりの位置を測定します。2セット目のノーズプライヤーで、選択した位置で針を握り、針を曲げます。
  3. 2 番目のベンドを作成します。針をねじるには、針の根元とU字型の曲がりをペンチで握り、反対方向にひねって4〜5mmのねじれを作ります。このステップは、気泡を除去するためにフリップウェル内に針を簡単に挿入するために重要です。
  4. 針を滅菌された3mmまたは5mmの注射器に取り付けます。針とシリンジベースを50 mLのコニカルチューブ内の20 mLの70%〜95%エタノールで滅菌します。
  5. 針と注射器にエタノールを通し、注射器の針と根元が滅菌されていることを確認します。
  6. エタノールを入れた円錐形のチューブから注射器と針を取り出し、ペトリ皿の上に置いて自然乾燥させます。針を空気でパージして乾燥させ、数分間乾燥させます。

6. 結腸上皮Caco-2:HT29-MTX-E12細胞株の播種

  1. 実験の2〜3週間前に、Caco-2およびHT29-MTX細胞株を、それぞれの増殖培地で別々の100 mm TCコーティング皿で培養を開始します。
    1. HT-29-MTX培地には、高グルコース(4.5 g/L)および1%(v:v)グルタマックス培地を含むDMEM440 mLと、50 mLの10%(v:v)熱不活化FBS、5 mLの1%(v:v)ペン型連鎖球菌、および5 mLのHEPES 10 mM最終濃度を使用します。
    2. Caco-2培地の場合、高グルコース(4.5 g/L)および1%(v:v)グルタマックス培地を含むDMEM440 mLと、50 mLの10%(v:v)熱不活化FBS、5 mLの1%(v:v)ペン型連鎖球菌、および5 mLの非必須アミノ酸を使用します。
      注:組織培養でコーティングされた12ウェルプレートウェルを使用して、Caco-2細胞株の播種密度を決定します。開始播種密度に応じて、100%コンフルエントまでの日数を計算します。ガイドラインとして播種密度を提供します。ただし、これは、使用する成長培地の配合、ベンダー、および FBS によって異なります。このステップは、THP-1細胞をプレーティングし、細菌/SEP処理を行った後、フリップウェルの腸上皮側の単層を確保するために重要です。
  2. Caco-2およびHT-29細胞を継代するには、培地を吸引します。10 mLのPBSで洗浄します。
  3. 2 mLの0.25%トリプシン-EDTAを添加して細胞をトリプシン化します。5%CO2で37°Cで5〜10分間インキュベートします。
  4. 細胞型増殖培地7 mLをプレートに加えます。細胞を別々の滅菌15 mLコニカルチューブに移します。
  5. 室温で500 x g で5分間遠心分離してペレット化します。細胞ペレットを乱すことなく上清を吸引します。
  6. ペレットを予熱したDMEMベースのHT-29培地1 mLに再懸濁します。血球計算器またはセルカウンターで細胞をカウントします。
  7. 2つの細胞タイプのCaco-2:HT-29細胞を、必要な数のフリップウェルに必要な細胞数に応じて、新しい15 mLまたは50 mLのコニカルチューブで9:1の比率で組み合わせます。
  8. 以下の手順では、コラーゲンでプレコートされたフリップウェルを使用してください。コラーゲンでコーティングされたFCIスタックを深いペトリ皿の縁から吊るします。
  9. フリップウェルの頂端側あたり 500 μL の 7.5 x 104 細胞/cm2 (2.6 x 105 細胞/12 ウェル インサート) を播種します。使用されているスタックの数に基づいて開始セル数を計算します。これには、両方の細胞タイプが 9:1 の比率で含まれます。
  10. アセンブリをペトリ皿の蓋で覆います。細胞が付着するまで、37°Cで5%CO2 とともに一晩インキュベートします。細胞は培養で約7〜10日で粘液を生成し始めます。文化を維持するために、一日おきにメディアを交換します。
    注:処理による培養の合計日数は、事前に計算する必要があります。反転と初期シード密度は、その期間によって異なります。

7. THP-1細胞の播種準備として3Dフリップウェルを反転させる

  1. Caco-2:HT-29細胞が付着して増殖し始めたが(正確なコンフルエンスは、使用した培地/FBSと培養期間に基づいて推定する必要があります)、100%コンフルエントではない場合は、フリップウェルを裏返して、膜の反対側にTHP-1細胞を播種します。
    注:THP-1細胞は、この時点で別の培養で増殖している必要があり、必要な正確な細胞数は、使用されたFCIスタックの数に基づいて推定されます。
  2. ペトリ皿の蓋を開き、FCIスタックの頂端(腸上皮)側からDMEM培地を吸引します。
  3. 滅菌鉗子を使用して、フリップウェルをフックで慎重に持ち上げ、180°回転させます。滅菌鉗子の2セット目で、上を向いているもう一方のフックでFCIスタックをつかみます。
  4. アセンブリをペトリ皿に戻し、フックをペトリ皿の縁に掛けます。THP-1細胞を播種する準備ができていない場合は、深いペトリ皿に十分な培地を追加して、培地のレベルを上げてメンブレンの上部に上げます。
    注:フリップウェルはこの位置で安定している必要があり、THP-1細胞の播種と培地の添加を今すぐ検討する必要があります。これらの手順は迅速に実行されます。THP-1細胞をカウントし、プレーティングの準備をする必要があります。THP1細胞を最初に播種して、安定性と最終重量を高めるためにFCIスタックの重量を量りました。次に、DMEM培地を深いペトリ皿に加え、培地レベルを膜の下側まで上げました。次に、カスタムメイドの針を使用して気泡を除去し、FCI スタックをさらに安定させ、最終的な音量調整を可能にしました。
  5. 次の手順で説明するように、針を使用して気泡を取り除きます。

8. 気泡の除去

  1. 使用前に針と注射器をエタノールで事前に滅菌し、自然乾燥させます(手順5を参照)。シリンジプランジャーを突っ込みます。
  2. 滅菌鉗子でFCIスタックを腕で持ちます。針をインサートアセンブリの内と下に慎重に下げ、強制経口針の柔らかい先端を気泡まで非常に穏やかに置きます。
  3. シリンジプランジャーを慎重に非常にゆっくりと引き上げ、気泡がゆっくりと消えるのを見てください。気泡の直径が約2 mmになり、結腸上皮細胞のDMEMカバレッジを良好に保つのに十分になったら停止します。
  4. フリップウェルから針と注射器を慎重に取り外します。深いペトリ皿の他のインサートアセンブリに進みます。

9. THP-1播種とPMA処理

  1. 420 mLのRoswell Park Memorial Institute(RPMI)-1640培地、50 mLの10%(v:v)熱不活化FBS、5 mLのGlutamax 1%(v:v)、5 mLのHEPES(最終濃度10 mM)、11 mLのグルコース(4.5 g/Lの最終濃度)、および5 mLのPen-Strep(1%v:v)でTHP1培地を作成します。
    注:THP-1細胞は、インサートに播種する前に、RPMIベースの培地で数日間増殖させる必要があります。シード前にセル数を計算し、使用するFCIスタックの数に基づいてスケールアップします。
  2. 細胞懸濁液は、500 μLの容量と、THP-1培地500 μLあたり0.5 x 10 6細胞で調製します。PMAを分化と分極に使用する必要がある場合は、100 ng/μLでRPMI培地に添加します。
    1. PMAを作るには、5mgのホルボールミリスチン酸酢酸(PMA)を1mLのDMSOに再構成して、5mg/mLのストック溶液を作ります。ボルテックスで混合します。微量遠心チューブにそれぞれ20 μLで分注し、-20°Cで保存します。
    2. PMAを使用するには、1 μLの5 mg/mLストックを99 μL(1:100)の完全増殖培地で希釈して、50 μg/mLのワーキングストックを作成します。1 μLのワーキングストックを500 μLの培地に加えるか、20 μLのワーキングストックを10 mLの培地に加えます。
  3. THP-1細胞を94 x g でRTで5分間遠心分離してペレット化します。5〜10 mLのRPMI培地に再懸濁します。任意の計数方法でTHP-1細胞をカウントします。
  4. RTで94 x g で5分間再度遠心分離します。THP-1培地500 μLあたり0.5 x 10 6細胞で再懸濁します。
  5. 500 μLのTHP-1細胞懸濁液を共培養インサートスタックの頂端側に加えます。ディープウェルペトリ皿に培地を加えることにより、結腸上皮細胞用のHT-29培地を調整します。
  6. 必要に応じて、ステップ8に従って強制経口針で気泡を取り除きます。細胞培養インキュベーターで、THP-1細胞が付着するまで(一晩)、1〜2日間増殖するまで、37°C、5%CO2、100%湿度で両方の細胞型を培養します。
  7. SEPまたは他の薬剤による治療を行うか、細菌インサートの準備をします(ステップ4を参照)。次のFCIスタックフリップの1日前に細菌の培養を開始します。

10. SEPおよび細菌インサートのセカンドフリップウェルフリップと気泡除去

  1. シャーレの蓋を開けます。RPMI培地を頂端側から吸引します。滅菌ピンセットでフリップウェルの腕を持ち、スタックを持ち上げます。
  2. スタックを逆さまに回転させます。ピンセットの2番目のセットを使用して、スタックアセンブリを利用可能なアームで保持します。
  3. スタックを新しい滅菌深い井戸のペトリ皿に下げ、縁にぶら下がります。500 μLのDMEM培地を、現在のエピカル/腸上皮側に加えます。
  4. 培地が膜のちょうど上部になるまで、深いペトリ皿に十分なRPMI培地を追加します。RPMIの体積は約40〜55mLと推定されましたが、深いペトリ皿あたり使用するFCIスタックの数によって変化します。
  5. ステップ8を使用して気泡を取り除き、2〜3mmの気泡を残します。必要に応じて RPMI メディアを調整します。プレートを覆います。
  6. 結腸上皮細胞が粘液を産生し始めるまで培養します。メディアは1日おきに部分的に交換します。
    注:結腸上皮細胞が十分に長く培養され、すでに粘液を産生している場合は、細菌インサートまたは治療に進むことができます。下部コンパートメントのメディアがインサートのメンブレン下側の下に入らないようにしてください。DMEM培地を追加して、メンブレンの培地レベルを維持します。培地を交換する理想的な方法は、基底外側コンパートメントから培地の半分を取り除き、空気の浸透を防ぐために頂端コンパートメントに少量の培地を残すことです。
  7. SEP処理では、細菌培養を使用しない場合は、この時点でSEPを最終濃度100μMまでウェルに添加します。細菌培養とインサートを使用する場合は、細菌培養物にSEPを添加します。細菌培養については、ステップ11を参照してください。
    1. SEPを作るには、100 mgのL-セピアプテリンを84.3 mLのDMSOに加え、ボルテックスして混合します。マイクロ遠心チューブにそれぞれ100 μLで分注します。-20°Cで保管してください。 SEPアリコートをインサートアセンブリあたり500 μL培地あたり1 μLで使用します(最終濃度は100 μM)。

11.細菌培養の開始(オプション)

  1. 免疫細胞、粘液、結腸上皮に対する細菌代謝産物の影響を研究するには、インサートアセンブリの頂端側に細菌インサートを追加します。細菌インサート構造の場合は、手順4に従ってください。 Bacillus subtilis は、細菌インサート使用の前日に培養しました。
  2. バクテリアインサートを使用する2日前にミラーLBを作成し、オートクレーブします。LBを作るには、6.25 gのミラーLBと250 mLの脱イオン水を500 mLのガラスフラスコに入れて混ぜます。アルミホイルで覆います。オートクレーブ、室温まで冷却します。滅菌LBは4°CまたはRTのいずれかで保存できます。
  3. バクテリアインサートを使用する前日にグリセロールストックから枯 草菌 の増殖を開始します。
  4. 細菌培養を開始するには、滅菌50 mLのコニカルチューブ内の凍結グリセロールストックから枯 草菌 を10 mLのMiller LBに接種します。グリセロールストックを解凍させないでください。
  5. 滅菌200 μLチップを使用して、グリセロールストックから少量の細菌をピックアップします。滅菌50 mLコニカルチューブ内の10 mLのLBにチップを排出します。
  6. SEPを使用する場合は、20 μLのSEPストックで処理を開始します(最終濃度は100 μMである必要があります)。50 mLコニカルチューブスターター培養物の10 mL細菌培養物に直接添加します。
  7. 枯 草菌 を220rpm、37°Cの振とうインキュベーターで8時間培養します。 一日の終わりにSEPの2回目の処理を追加します-20 μLのSEPを100 μMの最終濃度まで、細菌を含む10 mLのLBに加えます。
  8. 220 rpm、37°Cで一晩培養します。 翌朝、枯 草菌 を含む10 mLのLBに20 μLのSEPの3回目の処理を加え、細菌インサートを行う準備ができるまで振とう続けます。

12. フリップウェルへのバクテリアインサートの追加(オプション)

  1. 手順4で説明したように、細菌インサートの構築を実行します。手順11で説明したように細菌培養を行います。
    注:別の細胞培養キャビネットが利用可能な場合は、それが最適です。それ以外の場合は、細胞培養キャビネット内の作業領域を半分に分割します。細菌と細胞の培養を分離して維持します。細胞培養物は細胞培養インキュベーターに戻さないでください。BSC は滅菌し、この方法を実行した後 24 時間以上 UV にさらす必要があります。
  2. 以下の手順では、2組の滅菌鉗子を使用します。以下のすべての手順はBSCで行う必要があります。
  3. 鉗子を使用して、既製の滅菌24ウェルインサートをパッケージから持ち上げます。インサートを滅菌ペトリ皿内にセットし、蓋をします。
  4. 必要な細菌インサートの数について繰り返します。フリップウェル付きのペトリ皿をインキュベーターからBSCに移し、細菌インサートで皿の反対側に取っておきます。
  5. フリップウェルの頂端(上面)側から300 μLのDMEM培地を取り出し、細菌インサートを可能にします。FCIスタックの上面に約200 μLを残します。ペトリ皿の蓋をインサートアセンブリの上に置きます。
  6. 50〜100 μLの枯 草菌 培養物を24ウェル細菌インサートに加えます。バクテリアインサートの外壁や縁をこぼしたり汚染したりしないように注意してください。OD600 は、培養物の成長段階を監視するために摂取できます。
  7. 滅菌鉗子を使用して、培養物を含む細菌インサートを持ち上げ、フリップウェルの上面側に慎重に挿入します。アームを回転させて、FCIスタックの縁から吊るします。2セット目の滅菌鉗子でスタックを保持します。
  8. 残りの FCI スタックについて繰り返します。シャーレに蓋をして、BSC内で3時間休ませます。インキュベーター内に持ち込まないでください。
  9. 3時間後、滅菌鉗子を使用して、フリップウェルから細菌インサートを除去します。残りのインサートアセンブリについても繰り返します。バクテリアインサートを廃棄します。
    注: 細菌および細菌インサートは、施設のバイオハザード廃棄物処理ポリシーおよび安全衛生ガイドラインに従って廃棄してください。細菌成分や細菌自体は検査されませんでした。
  10. 粘膜、上皮、および免疫細胞コンパートメントの変化を分析するには、膜を洗浄し、イメージングの準備に進みます。
  11. フリップウェル上部からDMEMメディアを吸引します。500 μLの滅菌PBSで洗浄します。鉗子を使用して、FCIスタックをペトリ皿から持ち上げ、新しいペトリ皿に移します。
  12. フリップウェルを裏返して、ペトリ皿の縁に掛けます。メンブレンを500 μLの滅菌PBSで洗浄します。
  13. 保管が必要な場合は、FCIスタックを50 mLコニカルチューブ内の滅菌PBSに短期間(30分〜一晩)保存します。
    注:次にどのイメージング方法を使用するか、および電子顕微鏡と蛍光抗体標識の両方でメンブレンを半分に切断するかどうかを決定することが重要です。

13. 走査型電子顕微鏡(SEM)のためにフリップウェルを分解する

注:SEP/細菌処理後の結腸上皮細胞およびマクロファージの形態学的変化を調べるために、膜を固定バッファーに固定し、走査型電子顕微鏡(SEM)用にフリップウェルを分解しました。PFAは固定剤として使用されました。ただし、グルタルアルデヒドも使用できます。顕微鏡コアの好みの固定バッファー、特定の脱水ステップ、および初期固定バッファーの濃度について相談することが重要です。保管が必要な場合は、膜を固定バッファーに保管できます。作業はBSCの外で行うことができます。イメージングコアがメンブレンを接着する場合は、メンブレンを半分にカットして、両面を別々にイメージングするように配置できます。

  1. 耐溶剤マーカーを使用して、FCIスタックのプラスチック面に、使用するセルタイプのシンボルコーディングでラベルを付けます。または、メンブレンにドット、チェックマーク、またはxのいずれかで直接ラベルを付けて、使用する細胞タイプをラベル付けします。
  2. Flipwellを分解せずに50 mLのコニカルチューブに入れます。スタックを沈めるのに十分な 4% PFA を追加します。4%PFAを一晩中保持します。
    1. 4%PFA(メタノールフリー)を作るには、40 gのパラホルムアルデヒドを800 mLの1x PBSに溶解します。0.4%PFAを作るには、4 gのパラホルムアルデヒドを800 mLの1x PBSに溶解するか、100 mLの4% PFAを900 mLの1x PBSに加えて、4% PFAを1 x PBSで1:10に希釈します。
  3. PFAを0.4%と交換すると、より長い貯蔵が可能になります。保存期間とバッファーについては、顕微鏡コアを参照してください。
  4. フリップウェルを分解するには、両手で持ち、スタックの接着部分をひねって外します。スタックは2つの部分に分解されます:1つの部分には膜があり、もう1つの部分には膜のないインサートになります。メンブレンのないインサートを廃棄します。
  5. インサートをメンブレンと一緒に回転させ、メンブレンを上に向けて置きます。膜の端に小さな点またはxで膜をラベル付けして、どちら側がどの細胞型を持っているかを知ることができます。
  6. 鉗子でインサートを壁で保持します。メスの刃でメンブレンを慎重に切り取り、500 μL〜1 mLの0.4%〜4%PFA溶液の入った1.7 mLチューブまたは小さなガラス瓶の中に入れます。
  7. 脱水ステップとイメージングのために顕微鏡コアに提出します。脱水ステップは、Beamer etal 7 に記載されています。
  8. PFAまたはその他の固定剤は、組織が規定する有害廃棄物処理ポリシーおよび健康と安全のガイドラインに従って廃棄します。

14. 共焦点顕微鏡検査のためにフリップウェルを分解するための大きな液滴法

注:メンブレンを染色して画像化するための新しい方法が作成されました。共培養インサートスタックは、50 mLのコニカルチューブ内で最初の固定、透過処理、およびブロッキングステップを行い、無傷に保ちました。免疫蛍光標識と共焦点顕微鏡を使用して、膜の両面を画像化しました。一晩のインキュベーションステップには新しく呼ばれた12ウェルプレート法が使用され、分解されたインサートの底面を染色するために大きな液滴法が使用されました。共焦点Zスタックを使用して、メンブレンの両側をイメージングしました。染色された膜は2つの円形のガラスカバーガラスの間に挟まれ、挟まれたアセンブリは、市販の丸いチャンバーの2つの金属リングの間の中央に配置されて画像化されました。多光子レーザー走査型共焦点顕微鏡は、市販のイメージングソフトウェアとともに使用されました。

  1. メンブレンを洗浄するには、共培養インサートスタックを50 mLのコニカルチューブに直接入れ、15 mLの滅菌PBSを加えるか、両面を別々に洗浄します(後述)。
  2. DMEMを吸引し、300 μLの滅菌PBSを頂端側に加えます。PBSを吸引し、ペトリ皿からスタックを慎重に取り除きます。
  3. フリップウェルを反転させ、FCIスタックの上向きのRPMIに300 μLのPBSを追加します。PBSを吸引します。
  4. 耐溶剤性マーカーを使用して、スタックの上面と下面にラベルを付けて、どちら側がどの細胞タイプを持っているかを把握します。
  5. フリップウェルを50 mLの滅菌コニカルチューブに入れます。15 mLの滅菌4%PFAを初期固定バッファーとして10分間加えます。一晩インキュベーションが必要な場合は、PBS中の0.4%PFA 15 mLと交換し、蓋をして一晩放置します。
  6. 免疫染色を進めるには、大きな液滴法用のベンチスペースを作ります。
    10 x 14 インチのラップをはがし、ベンチの角にテープで貼り付けて滑らかな表面を作ります。
  7. 200 μLのピペットを使用して、200 μLのPBSを含む大きな液滴を作成します。インサートアセンブリをひねって外して、インサートに分離します。
  8. 耐溶剤性マーカーを使用して、膜の片側の端近くに小さなドットを配置して、染色とイメージングに使用される細胞タイプを確認します。
  9. メンブレン付きのインサートに接着剤が残っている場合は、インサート底部からシリコンガスケットが残っている場合は取り外します。これは、以下の手順でインサートが直立したままになるようにするためです。
  10. FCIスタック(THP-1細胞を含む)を200 μLの大きなPBS液滴の上に慎重に配置します。結腸上皮細胞を含む上面に200 μLの透過処理バッファーを加え、10分間保持します。
    1. 透過処理バッファーを調製するには、PBS中の0.1%v / v Triton-X100を使用します。
  11. 200 μLのPBSを吸引して加えます。この洗浄を2回繰り返します。250 μLのブロッキングバッファーで新しい液滴を作成します。
    1. ブロッキングバッファーを作るには、250 μLの正常なヤギ血清を5 mLの1x PBS(最終5%血清)に加えます。15 μLのTriton-X100(最終0.3%v:v)を加えます。よく混合し、4°Cで1〜2日間保存します。
  12. インサートをブロッキングバッファの上に置きます。室温で30分間ブロックします。頂端側からPBSを吸引し、インサートの上部に200 μLのブロッキングバッファーを加えます。これで、膜の両面が一晩抗体染色の準備が整いました。

15. 免疫蛍光(IF)染色

注:染色は、12ウェルプレート法を使用して一晩、または大きな液滴法を使用してベンチで行われます。

  1. メンブレンの両側を4°Cで一晩染色するか、RTのベンチで染色するために必要な抗体を調製します。すべての抗体をPBS中の1%BSAで1:100に希釈します。または、メーカーの推奨に従い、染色を最適化して、理想的な濃度と抗体希釈バッファーを決定します。
  2. 大液滴法
    1. ベンチの上にラップを使って大きな長方形を作り、角をテープで留めます。プラスチックの上に希釈した200 μLの抗体をピペットでピペットで取り、大きな液滴を作ります。インサートメンブレンを大きな液滴の上に置きます。
    2. 200 μLの一次抗体をインサートの上部に加えます。RTで2時間インキュベートします。
  3. 12ウェルプレート法
    1. 12ウェルプレート法を一晩使用する場合は、300 μLの一次抗体をインサートの上部に加えます。
    2. 300 μLの一次抗体を12ウェルプレートのウェルに加えます。インサートを液滴の上の12ウェルプレートウェル内に置きます。プレートに蓋をして、4°Cで一晩置きます。
  4. 染色が完了したら、膜の両面をPBSで洗浄します。ピペットと200 μLのチップを使用して、インサートの底面を200 μLのPBSで3回慎重にすすぎます。インサートの上部については、上部に200 μLのPBSを加え、吸引し、洗浄を3回繰り返して洗浄します。
  5. すべての二次抗体(使用する特定の抗体については 材料表 を参照)をメーカーの推奨に従って調製するか、PBSまたはその他の1%BSAで1:1000に希釈します。二次抗体染色は暗闇の中で行う必要があります。段ボール箱やキャビネットの引き出しを使って、光のない環境を作りましょう。
  6. 大きな液滴法または12ウェルプレート法のいずれかを使用して、新しい滅菌プレートを準備します。暗い環境でRTで2時間インキュベートします。15.4 で説明されているように洗浄します。

16:共焦点イメージングの準備

  1. ステップ14で説明したようにメンブレンがまだ標識されていない場合は、細胞タイプの位置を知るためにメンブレンを標識します。任意の位置に耐溶剤性マーカーを使用して小さなマーク(ドット、x、チェックなど)を配置します(エッジが推奨されます)。
  2. 丸いカバースリップを保存容器から慎重に取り外し、ベンチ面にそっと置きます。
  3. DAPIをPBSで1:100希釈で希釈します。液滴ディスペンサーでDAPIを分注するには、カバースリップの中央に1〜3滴を追加します。それ以外の場合は、カバースリップの中央にDAPIの1〜3滴をピペットで入れます。
  4. 鉗子でインサートを持ちます。メスの刃で、縁/下端の周りを円を描くように膜を慎重に切り取ります。メンブレンをベンチに落とさないでください。プラスチックインサートをベンチに置き、鉗子で膜を持ちながら、メスの刃で最終的な繊維を切り取ります。
  5. インサートをDAPIの上に置きます。1〜3滴のDAPI(1:100希釈)をメンブレンの上部に分注し、メンブレンの両側にDAPIがあるようにします。
  6. 2 番目のラウンド カバー スリップを指で持ち上げます (PPE を着用します)。カバースリップは非常に壊れやすいため、鉗子は使用しないでください。
  7. 2番目のカバースリップを最初のカバースリップの上に合わせ、メンブレンの上に慎重に下げます。
  8. 耐溶剤性マーカーを使用して、必要に応じてカバーのスリップ面に慎重にラベルを付け、細胞の種類/向きをコーディングします(オプション)。メンブレンにラベルが貼られている場合は、このステップをスキップします。
  9. 画像化するカバーガラスの数と利用可能な金属リングの数に応じて、市販の金属リングの間にカバーガラスを取り付けて、丸いカバーガラスを一緒に保持してイメージングするか、イメージングするまで暗所に保管します。
  10. 画像化するには、セルチャンバーの金属リングの間に膜でカバースリップを取り付け、共焦点顕微鏡ホルダーに入れます。丸いカバースリップを画像化するためにどのホルダーが必要かを確認する前に、共焦点顕微鏡コアに連絡してください。
  11. イメージングの準備ができたら、サンドイッチをアルミホイルで包み、施設に持ち込みます。
  12. Zスタック機能を使用して、使用する蛍光色素に応じて適切な波長を使用してメンブレンの両側を個別にスキャンします。2番目の面を裏返してイメージします。カバーガラスを保管するには、4°Cの暗所に保管してください。

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結果

腸内細菌、結腸上皮、およびマクロファージのフリップウェル共培養の生物学的関連性を判断するために、アルギニン代謝の調節剤であるセピアプテリン(SEP)で共培養物を処理し、対照DMSOと比較して一酸化窒素9,10,11の産生を促進しました。免疫蛍光(IF)顕微鏡と走査型電子顕微鏡(SEM)を用いて、共培養の各成分に対するSEP処理の効果を測定しました。染色では、上皮マーカータンパク質CK20および粘膜タンパク質MUC2の増加が示すように、SEP処理後の腸上皮コンパートメントにおける粘液分泌の劇的な増加が示されました(図1)。また、SEP治療により、M1マクロファージマーカーCD80のレベルが上昇し、M2マクロファージマーカーCD163がダウンモジュレートされ、M1の分極を示すこともわかりました(

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ディスカッション

腸粘膜構造を in vitroで再現するために、腸内細菌、粘液産生結腸上皮細胞、マクロファージの層状層からなるシンプルな共培養システムを設計しました。このマルチ共培養システムにより、細菌のセクレトーム、腸上皮、マクロファージ間のクロストークが免疫原性リプログラミングと粘膜防御機構の誘導に及ぼす影響を研究することができました。

3D フリップウェルを作成する際の重要な注意点の 1 つは、アセンブリを無菌環境で行い、その後細胞を播種する前に数日間 UV 滅菌する必要があることです。機能的なUVライトを備えたBSL2キャビネットを利用して、滅菌プロセスを完了しました。最初の滅菌ステップでは、滅菌されたツールと 70% エタノールが概説どおりに使用されました。構築段階では、数回の試行後に一貫したシリコーン接着ビーズが達成され、再現性の向上につながります。このテクニックを実践し、追加のインサートスタックを準備することが有益な場合があります。インサートアセンブリを反転させた後に気泡を除去するには、15G 強制...

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開示事項

著者は利益相反を宣言しません。著者は、明示的か黙示的かを問わず、法律で認められる最大限の範囲で、すべての保証を否認します。いかなる状況においても、著者は、法令、契約、不法行為、またはその他の法理論に基づくかにかかわらず、フリップウェルの構築におけるツールの使用、BSL試薬の使用、細胞株、細菌培養、嫌気性チャンバー内の嫌気性環境下でのフリップウェルシステムの使用に起因または関連する特別、偶発的、間接的、懲罰的、多重、または結果的な損害について責任を負わないものとします。この責任の制限には、本書に明示的に記載されていない不特定のFlipwellの使用方法が含まれますが、これらに限定されません。

謝辞

主著者は、古田沙織先生の優れたメンターシップスキル、長距離にわたる継続的な指導とサポート、そして素晴らしい学習機会を育む巧みで継続的なプロジェクト設計に心から感謝の意を表します。著者らはまた、微生物学の専門知識と指導を提供してくれたVandana Sharma博士と、THP-1マクロファージの調製についてVeani R. Fernando博士に感謝します。 さらに、著者らは、電子顕微鏡施設のアンドリュー・クラインヘンツ博士とウィリアム・T・ガニング博士、トレド大学計装センターのカサンドラ・サモラ博士とクリスティン・キルシュバウム博士に、EMイメージングに関する建設的な提案をしてくれたことに感謝しています。この研究は、トレド大学健康科学キャンパス、医学生命科学部、がん生物学部からSFへのスタートアップファンドによって支援されました。SF へのオハイオ州がん再検索助成金 (プロジェクト #: 5017)。医学研究協会(トレド財団、#206298)SFへの賞。SF への米国癌協会研究奨学生助成金 (RSG-18-238-01-CSM)。SFへの国立がん研究所研究助成金(R01CA248304)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.4%PFA(試薬および溶液のレシピ参照)本文で説明されています
10ml血清学ピペットコーニング4488
12井TCプレート、および共演者コーニング3513
15ml円錐管、SpectraTubeアルカリ・サイエンティフィックC2715
200 & マイクロ;l tips  USAサイエンティフィック1111-1700
24ウェルインサート - 24ウェルプレート、PET 0.4およびマイクロ用の培養インサート;m ブランドテック・サイエンティフィック782710
3Dフリップウェルは既製でUV滅菌処理済みです。ラボで作る
4%PFA(試薬と溶液のレシピを参照)本文で説明されています
50 mMセピアプテリンストック(SEP、試薬および溶液のレシピを参照)経歴 河南化工有限公司CAS#: 17094-01-8
50ml円錐管グライナー・バイオ・ワン227261
5ml血清学ピペットコーニング4487
エタノール(エチルアルコール)70〜95%デコン・ラボ04-355-151
アルミホイルフィッシャー・サイエンティフィック01-213-100
動物用餌針、20ゲージ 1.5インチ長さ、単回使用 フィッシャー・サイエンティフィック01-208-87
抗体希釈バッファー(試薬および溶液のレシピ参照)本文で説明されています
アットフルア細胞室 サーモフィッシャー・サイエンティフィックA7816
オートクレーブテープフィッシャー・サイエンティフィック15-901-111
グリセロールストック中のバチルス・サブティリス(3A1T)株()バチルス遺伝ストックセンター(https:// bgsc. org/
BioGrip ピンク ニトリルパウダーフリーのラテックスフリー手袋最高品質の製造P2810
ブロッキングバッファー(レシピ「Reagents and Solutions」参照 - PBSの10%通常のヤギ血清)本文で説明されています
ブロッキングバッファ(試薬と溶液のレシピを参照)本文で説明されています
ブライトフィールド顕微鏡(ニコンまたは同等の機器)エクリプスTs2ニコンTS2
カコ-2細胞ATCCHTB-37
細胞培養インキュベーター、37°C、5% CO2(Eppendorf CellXpert)エッペンドルフ6734010015
遠心分離機(エッペンドルフ、遠心分離機5804/5804 Rまたは同等品)エッペンドルフ22622501
遠心分離機管 50 ml SpectraTubeアルカリ・サイエンティフィックC2750
12ウェルプレート、PET、0.4およびマイクロの培養インサート;M、不妊ブランドテック・サイエンティフィック、BRAND Insert 2in1、BIO-CERT782730
DAPI VectaShieldマウントメディアベクター研究所H-1000
深いペトリ皿の底、100 x 25 mmの深層ポリスチレン積み式ペトリ皿、無菌 USAサイエンティフィック8609-0625
ドラモンド・ピペット・エイドXPDrummondとnbsp;4-000-101
エッペンドルフ5804 スイングバケットローター付き遠心分離機(50ml円錐管用)エッペンドルフ22622501
鉗子、ステンレススチール、滅菌高圧滅菌、2セットVWR82027-438
鉗子、ステンレス製、滅菌高壓滅菌器、2セット、標本鉗子VWR82027-438
ガラスフラスコ 500mlコーニング 4980-500
ヘマサイトメーター(カバースリップ付きノイバウアー)サーモフィッシャー・サイエンティフィック50-312-90
HT-29-MTX-E12細胞ミリポール・シグマ12040401
ImmunoPen(任意)フィッシャー・サイエンティフィック4021761EA
ケブラー製またはその他の耐切り手袋(オプション)ホームセンターかAmazon
ラボテープまたは出荷用テープフィッシャー・サイエンティフィック 159015R
層流フード 1300シリーズ A2 BSC クラスIIサーモフィッシャー・サイエンティフィック1375
UVライト付き層流フード SterilGARDベイカー・カンパニーSG403A-HE
マーカーの溶剤耐性VWR52877-310 または 95042-566
Caco-2細胞用培地(DMEM高グルコースベース、試薬および溶液のレシピを参照)説明は以下に記載されています。テキスト
HT-29細胞用培地(DMEM高グルコース、試薬および溶液のレシピ参照)本文で説明されています
THP-1細胞用培地(RPMI、試薬および溶液のレシピを参照)本文で説明されています
マイクロ遠心分離機チューブ、1.7 ml、無菌・nbsp;アルカリ・サイエンティフィックC3017-ST
マイクロ遠心分離機チューブサーモ・フィッシャー3451
ミラーLBメディア(試薬と溶液のレシピを参照)シグマ・オルドリッチ L3522
ニードルノーズプライヤー、2セットホームセンターかAmazon
ニトリルパウダーフリーラテックスフリー手袋 オーレリア アメイジング中等科学92885
ペトリ皿の蓋、無菌ファルコンペトリ皿 無菌100x15mmスタイルコーニング社351029
フォボルミリステート酢酸(PMA)(100 ng/μl、試薬と溶液のレシピを参照) インビボジェンTLRL-pma
ピペットチップ(10 & micro;l、200 & micro;l、1000 & micro;l) PurePointまたは同等のものアルカリ科学 ST1010-CS、ST1200-CS、ST1000-CS
ラップ乾物屋
純粋化作業コラーゲナーゼ溶液(100 & micro;g/mL)高度なバイオマトリックス5005-100ML
丸いカバースリップ #1 1オンス(コーニングフロートグラスまたはフィッシャーブランド)コーニングまたはフィッシャーブランド50143822または12-546-2 25CIR-2
メス刃、無菌、使い捨てなど;モペックかフェザー #10AJ136または2975#10
セピアプテリン(SEP、100および微量;M、試薬と溶液のレシピを参照してください)経歴 河南化工有限公司CAS#: 17094-01-8
振動インキュベーターは220rpm、37度、Cエッペンドルフ・ニューブランズウィック・サイエンティフィックM12990080
シリコーン接着剤 ロクタイトクリア シリコーンIDHまたは3Mマリングレードシリコーンシーラント ノーズチップ付きクリアロックタイトまたは3M1745658かPN08019
シングルチャネルピペット Eppendorf Research Plus、200 & micro;lエッペンドルフ
シングルチャネルピペット(10およびマイクロ;l、200 & micro;l、1000 & micro;l)エッペンドルフ2231001122
分光光度計 NanoDropOneCサーモフィッシャー・サイエンティフィック13-400-519
滅菌脱イオン水  
カルシウムやマグネシウムを含まない無菌リン酸塩緩衝セリン(PBS)フィッシャー・サイエンティフィック BSS-PBS-1X6
注射器 3mlまたは5ml、Luer-Lokチップ付きBD309585か309603
THP-1細胞ATCCTIB-202
トランスファーピペット、滅菌フィッシャーブランド13-711-20
トライトン X-100ミリポール・シグマX100
トリパンブルー溶液VWR97063-702
トリプシン-EDTA 0.25%サーモフィッシャー・サイエンティフィック25200-056
Kimwipes ProfessionalをLintGuard Anti-Stat Polyshieldで拭くキンバリー・クラーク34120
<強力>一次抗体: 
反人間CD163アブカム156769
反人間CD68ノバス・バイオロジカルズNB100-683-0.1 mg
反ヒトCD80、E3Q9V細胞シグナル伝達技術15416
反ヒューマンCK20 ライフ・テクノロジーズPA5-82875
反ヒトMUC2(996/1)サーモフィッシャーMA5-12345
<強い>二次抗体:
Alexa Fluor 488 ヤギ抗ウサギIgG(CD80およびCK20用)サーモフィッシャーA11008
Alexa Fluor 594 ヤギ抗マウスIgG(MUC2およびCD68またはCD163用)サーモフィッシャーA11005
<強力>試薬および溶液:  
<ストロング>カコ-2 ミディアム:
高グルコース(4.5g/L)および1%(v:v)GlutaMax を含むDMEM;サーモフィッシャー・サイエンティフィック35050061
FBS 10%(v:v)熱不活性化シグマF2242-500ML
非必須アミノ酸はCaco-2培地に1%サーモフィッシャー・サイエンティフィック11140076
ペン溶連菌 1%(v:v)シグマF2242-500ML
<ストロング>HT-29-MTX中
高グルコース(4.5g/L)および1%(v:v)GlutaMax を含むDMEM;サーモフィッシャー・サイエンティフィック35050061
FBS 10%(v:v)熱不活性化シグマF2242-500ML
HEPES(最終濃度10 mM)サーモフィッシャー・サイエンティフィック15630080
ペン溶連菌 1%(v:v)シグマF2242-500ML
<ストロング>THP-1 ミディアム:
FBS(10% v:v)熱不活化胎児用牛血清シグマ F2242-500ML
グルコース(最終濃度4.5 g/L)サーモフィッシャー・サイエンティフィックA249001
グルタマックス 1% (v:v) 最終濃度2 mMサーモフィッシャー・サイエンティフィック35050061
HEPES(最終濃度10 mM)サーモフィッシャー・サイエンティフィック15630080
ペン溶連菌 1%(v:v)シグマF2242-500ML
ロズウェル・パーク記念研究所(RPMI)-1640中型サーモフィッシャー・サイエンティフィック11875119
ピルビン酸ナトリウム(最終濃度1 mM)サーモフィッシャー・サイエンティフィック11360070
<ストロング>純酸の作動コラーゲナーゼ溶液(希釈して1:30 100 & micro;g/ml):
ピュアコール3mg/ml、1:30から100mg、マイクロ量;g/ml 高度なバイオマトリックス5005-100ML
無菌脱イオン水
<強力>L-セピアプテリンストック溶液(50 mM):
L-セピアプテリン(SEP)経歴 河南化工有限公司CAS#: 17094-01-8
<ストロング>フォボルミリステート酢酸ストック溶液(PMA、5 mg/mL)<ストロング>インビボジェンTLRL-pma
BSA 1% 牛血清アルブミン シグマ・オルドリッチ5470
DMSO シグマ D2650
ミラーLBシグマ・オルドリッチ L3522
二次抗体と同じ種の正常な血清シグマ NS02L-1ML
パラホルムアルデヒドシグマ・オルドリッチ441244

参考文献

  1. Goldsmith, J. R., Sartor, R. B. The role of diet on intestinal microbiota metabolism: downstream impacts on host immune function and health, and therapeutic implications. J Gastroenterol. 49 (5), 785-798 (2014).
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