方法論記事

ノックアウトマウス生成のための卵管核酸送達に基づくin vivoエレクトロポレーション技術によるゲノム編集の改善

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DOI：

10.3791/68704

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2025年8月26日

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1Center of Transgenesis and Genome Editing, St. Petersburg State University, 2Resource Center Molecular and Cell Technologies, St. Petersburg State University, 3Amyloid Biology Laboratory, St. Petersburg State University, 4DNA-Nanosensoric laboratory, ITMO University, 5Laboratory of Toxinology and Molecular Systematics, L.A. Orbeli Institute of Physiology, National Academy of Sciences of the Republic of Armenia

この記事について

サマリー

卵管核酸送達 による 改良ゲノム編集 (I-GONAD) 法の効率は、ドナーの女性から接合子を採取し、偽妊娠中の女性に移植する必要がある従来のマイクロインジェクションに匹敵します。このプロトコルは、CRISPR/Cas9 誘発変異を染色体 6 上の ROSA26 遺伝子座に導入することにより、その有効性を実証します。

要約

ノックアウトマウスを作成する方法には、通常、(1)ドナーメスから胚を採取する、(2)遺伝子構築物を ex vivoで接合子にマイクロインジェクションする、(3)偽妊娠したメスの卵管に外科的に移植するという3つの主要なステップが含まれます。このプロセスには、ドナーの女性だけでなく、精管切除された男性や疑似妊娠中の女性も関与するため、かなりの数の動物が必要です。さらに、マウス受精卵の細胞質または前核へのマイクロインジェクションには、針の詰まり、高弾性による膜透過性の問題、胚死の可能性などの課題が生じます。Nepa21 などの高度なエレクトロポレーターの開発は、卵管核酸送達 による 改良ゲノム編集 (I-GONAD) として知られる方法を通じて、標的遺伝子ノックアウトを持つマウスを 1 つのステップで生成するユニークな機会を提供します。この技術では、受胎後 0.7 日に CRISPR-Cas 成分 (Cas9 タンパク質とガイド RNA) を妊娠中の女性の卵管にマイクロインジェクションし、その後 in vivo エレクトロポレーションしてこれらの成分を接合子に直接送達します。I-GONAD手順に続いて、妊娠中のマウスは標的遺伝子ノックアウトを持つ子犬を運び、出産します。この記事では、マウスに I-GONAD 法を実装するための詳細な段階的なプロトコルを提供し、従来のノックアウト マウス生成技術に代わる、より効率的でアクセスしやすい代替手段を提供します。

概要

病気の遺伝的基盤を理解することは、その病因と病因の根底にある分子メカニズムを特定するために重要です。この研究の重要なステップは、ヒトの病気をシミュレートする標的遺伝子ノックアウトを備えた動物モデルの開発です。マウスは、ヒトと一般的なゲノムの類似性、小型、短寿命、および高い生殖能力により、これらの研究に特に価値があります。マウスモデルは、基礎研究と前臨床試験の両方にとって重要です1。

CRISPR-Cas9システムを使用してノックアウトマウスを作成するために、研究者は通常、ガイドRNAとCas9ヌクレアーゼの複合体を接合子に注入し、標的DNAに二本鎖切断を引き起こし、それによって細胞の修復システムを活性化して切断部位に突然変異を引き起こします1,2。接合子へのマイクロインジェクションは、この目的のためのゴールドスタンダードであり続けています。ただし、この方法には、ドナーの女性から胚を分離し、受精卵に遺伝子構築物をマイクロインジェクションし、偽妊娠した女性の卵管に外科的に移植するといういくつかの手順が必要です。そのため、ドナーメス、精管切除されたオス、疑似妊娠メスなど、多数の動物を維持する必要があります。さらに、接合子の分離には、ドナー女性の安楽死が必要です。したがって、3R(Replacement、Reduction、Refinement)3の原則に沿って、動物の使用を最小限に抑えるプロトコルが望ましいです。

Nepa21システムの使用などのエレクトロポレーション技術の進歩は、卵管核酸送達(I-GONAD)4を介した改良ゲノム編集として知られる技術を使用して、標的遺伝子ノックアウトマウスを1つのステップで生成するユニークな機会を提供します。スーパーエレクトロポレーター NEPA21 タイプ II は、4 段階のマルチパルス エレクトロポレーション システムを採用しており、高い胚生存率を維持しながら高いエレクトロポレーション効率を保証します。I-GONADでは、受胎後0.7日にCRISPR-Cas成分(Cas9タンパク質(500-600 ng/μl)およびガイドRNA(80-100 ng/μl))を妊娠マウスの卵管にマイクロインジェクションし、続いてin vivoエレクトロポレーションを行い、これらの成分を接合子に直接送達します5。I-GONAD手順の後、妊娠中のマウスは、標的遺伝子ノックアウト6,7,8を持つ子犬を出産します。この方法の有効性は、目的のターゲットによって異なりますが、標準的なマイクロインジェクションベースの技術(約50%)と同等です9,10。さらに、I-GONADは、他の種のゲノム編集に適応できる可能性があります。

この記事では、ノックアウトマウスを生成するためのI-GONAD法を実装するための段階的なプロトコルを紹介します。一例として、マウスの6番染色体上の ROSA26 ゲノム遺伝子座を標的とすることで、その有効性が実証されました。この遺伝子座は、その後の翻訳なしで構成的転写を受けるため、選択されました。したがって、この遺伝子座に突然変異を導入しても、結果として得られる子犬の健康に悪影響を与える可能性は低いです。

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プロトコル

すべての動物実験は、サンクトペテルブルク州立大学の動物研究倫理委員会によって承認されました (承認番号 131-03-5、2022 年 10 月 11 日)。すべての手順は、実験動物の世話と使用に関するガイドに概説されているガイドラインに厳密に準拠しています。一般的な実験室の近交系CD1マウスは、ロシア科学アカデミー生理活性化合物研究所(IPAC RAS)の集団使用センターから入手されました。生後2〜3ヶ月(平均体重27〜30 g)の雌CD1マウスを、生後2.5〜4ヶ月(平均体重35〜37 g)の雄CD1マウスとの交配に用いた。この研究で使用された試薬と機器は、 材料表に記載されています。

1. シングルガイドRNA(sgRNA)の設計とトランスフェクションのための調製

  1. CHOPCHOP、SYNTHEGO Knockout Guide Design、CRISPORなどの計算解析ツールを使用して、選択した目的の遺伝子を標的とする潜在的なsgRNA配列を特定します。
    注:ソフトウェアは、遺伝子全体にわたる潜在的なsgRNA配列を識別し、出力で複数のバリアントを示唆します。これらのツールは、最適なsgRNAオプションを提案し、必要に応じてユーザーが同定されたすべてのバリアントから選択できるようにします。選択するときは、次の基準を考慮してください。
    1. エクソン近接性:目的の突然変異点にできるだけ近いエクソン内にある配列を選択します。より良い結果を得るには、代替スプライスアイソフォームを検討し、最も多くのアイソフォームに存在するターゲット配列を選択します。正確なエクソン選択のために、ゲノムブラウザ(アンサンブルなど)を検討してください。
    2. オフターゲットの考慮事項: ツールのスコアリングシステムを使用して潜在的なオフターゲット効果を分析し、予測されるオフターゲット活性が最も低いシーケンスを選択します。
      注:CHOPCHOPやSynthegoなどの計算ツールは、エクソン近接性やオフターゲット効果の評価に非常に効果的であり、正確なゲノム編集に最適なsgRNA配列を特定するのに役立ちます。ガイドRNAを設計する際には、使用するマウス系統における目的遺伝子の特定の配列を考慮することが重要です。一部のマウス系統(C57Bl、CBA、C3Hなど)では、完全なゲノム配列が利用可能です。そのようなデータが利用できない場合は、計画された編集領域で標的遺伝子の予備配列決定を実行することが賢明かもしれません。多型によって引き起こされるガイドRNAの単一の不一致は、編集効率を損なう可能性があります。 ROSA 26 マウスゲノム遺伝子座は、sgRNA配列5'-ACTCCAGTCTTTCTAGAGA-3'で標的化されました。
  2. 表1に示すように、sgRNAテンプレートPCR増幅用のプライマーのセットを注文します。
    注:gRNAは、sgRNAまたはcrRNA:tracrRNA二本鎖として、他の場所で注文できます。
  3. 線形dsDNAテンプレートを作成します。
    1. 表1に示すようにマスターミックスを調製します。最後にポリメラーゼを加え、安定性を維持するためにマスターミックスを氷上に置いておく。
    2. 以下の条件下でPCRを実行します。初期変性:95°Cで30秒。30サイクル:95°Cで20秒(変性)、55°Cで20秒(アニーリング)、72°Cで15秒(伸長)。最終伸び:72°Cで2分。4°Cで保持します。
  4. PCR反応混合物をさらにIn Vitro 転写(IVT)反応に使用します。
    1. 表2に示すようにIVTマスターミックスを調製し、37°Cで1.5時間インキュベートします。 一貫した温度制御のためにサーモサイクラーを使用してください。
    2. 2 μLのDNase Iを加え、37°Cでさらに30分間インキュベートしてDNAテンプレートを除去します。
    3. 反応混合物を75°Cで5分間インキュベートすることにより、DNase Iを不活性化します。
    4. メーカーのプロトコルに従って、TRIZOL試薬を使用してRNAを精製します。
      注:TRIZOL試薬とDNAse1、その溶液、または副産物の廃棄は、指定された化学廃棄物容器に入れる必要があります。
    5. 分光光度計を使用してRNA濃度を測定します(1回の反応の典型的な収率は3〜5μgです)。A260/A280 と A260/A230 の比率を確認してください。A260/A280 は少なくとも 2.0 である必要があり、A260/A230 の比率も少なくとも 2.0 である必要があります (タンパク質や有機溶媒による汚染がないことを意味します)。使用するまでsgRNAを-80°Cで保存します。
  5. トランスフェクション用のRNPミックスを準備する
    1. トランスフェクションミックスは、Cas9タンパク質とsgRNAの混合物であるRNP複合体で構成されています。RNPミックスを調製するには、次の手順に従ってください。
    2. ヌクレアーゼフリーの水を使用して1 M Tris-HCl(pH 7.5)バッファーを100 mMに希釈し、孔径0.022 μMのシリンジフィルターを使用してろ過し、10 μLの部分にアリコートし、使用するまで4°Cで保存します。
    3. ヌクレアーゼフリーチューブで、最終濃度の次の成分のトランスフェクションミックスを調製します:500 ng / μL spCas9ヌクレアーゼ、80 ng / μL sgRNA、DEPC処理水で希釈した10 mM Tris-HCl。
      注:プロトコルの適切な効率を確保するには、高濃度のRNPミックス成分が必要です。
    4. トランスフェクションミックスを37°Cで10分間インキュベートして、RNP複合体の形成を可能にします。
    5. ミックスを、1回のI-GONADセッションに適した少量(2 μL)に分注します。
    6. I-GONADセッション中は、アリコートを4°Cに保ちます。混合物は、安定性を維持するために、I-GONADエレクトロポレーションセッションごとに新鮮に調製されます。
      注:RNPミックスは、最適な活性と効率を確保するために、I-GONADセッションごとに新鮮に調製する必要があります。

2. 卵管核酸送達 による ゲノム編集のための雌マウスの調製

  1. 雌マウスの交配と選択:CD1雌マウスをシングルハウスCD1雄マウスと一晩交配します。朝、雌マウスに交尾プラグが存在するかどうかを確認します。交尾プラグのあるメスを選択し、さらなる手順のために新しいケージに移します。
    注:遺伝的モザイク現象を最小限に抑えるために、遺伝的構築物を送達するための最適な時間は、単一細胞(接合子)ステージ10での交配後0.7日です。これは、交尾プラグが検出された日の午後16:00にほぼ相当します。この段階で、卵管の解剖により、接合子は膨大板に残っていますが、卵丘細胞は少ないことが明らかになります。特に、卵丘細胞はエレクトロポレーション中に外因性核酸またはタンパク質を取り込むこともあります。手順がより早く行われた場合、たとえば交尾後10時間、卵丘細胞はまだ接合子をしっかりと取り囲み、接合子への核酸の効率的な電気泳動送達を妨げる可能性があります。ホルモン刺激を受けたマウスは、卵母細胞の数が過剰になり、流産につながる可能性があるため、使用しないでください。
  2. 手術器具の準備:すべてのステンレス鋼の手術器具をオートクレーブして、無菌性を確保します。
  3. マウスの麻酔と準備:選択された雌マウスの体重を量り、ケタミン(100 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)の混合物を使用して腹腔内注射 によって 麻酔します(施設で承認されたプロトコルに従います)。
    1. マウスのつま先つまみ反射の喪失を監視して、適切な麻酔を確認します。麻酔をかけたマウスを加熱パッドの上に置き、処置中の体温を維持します。動物用軟膏を塗布して、麻酔中のマウスの目を乾燥から保護します。

3.外科的処置

  1. 70%エタノールを使用してマウスの背側(背中)領域を消毒します。
  2. 腰部に0.7cmの縦方向の皮膚切開を行います。
  3. 70%エタノールを染み込ませたコットンパッドで切開部位を拭き、切開部の周りの毛を取り除きます。
  4. 少し開いたハサミの先端で横に押して切開部を1.3cmまで伸ばします。
  5. 腹腔にアクセスするために、腹膜に小さな切開(0.7 cm)を慎重に行います。
  6. 少し開いたハサミの先端で横に押して切開を1.1cmまで伸ばします。
  7. 卵巣に取り付けられた脂肪パッドを見つけ、卵巣、卵管、子宮がはっきりと見えるまで鉗子を使用してそっと引き抜きます。
  8. 容器クランプを使用してファットパッドを所定の位置に固定します。
  9. 正確な操作のために、実体顕微鏡下で卵管を視覚化します(図1)。
  10. ストリッパーピペッターを使用して、注入混合物2 μLをプラスチックキャピラリーにロードします。
    注:プラスチック製の毛細血管を備えたストリッパーピペッターは、もともと体外受精クリニックでの胚の操作用に設計されており、I-GONAD手順における胚移植やCRISPR/Cas9コンストラクト送達など、複数のアプリケーションをサポートできます。ピペッターは精密液体ディスペンサーとして機能します。使い捨ての柔軟な毛細管と組み合わせることで、無菌性を可能にし、相互汚染を防ぎます。プラスチック製の毛細血管は、繊細な組織への外傷が少ないため、卵管へのトランスフェクション用のRNPミックスを注入する場合、ガラスよりも好ましいです。ガラス毛細管とは異なり、使い捨てプラスチック製の毛細管は、挿入前に鋭利なエッジを滑らかにするための火炎研磨を必要としないため、準備時間と損傷のリスクが軽減されます。
  11. マイクロハサミを使用して、膨大器の数ミリメートル上流の卵管壁に小さな切開(0.2 cm)を行います。
  12. プラスチック製のキャピラリーを備えたストリッパーピペッターを切開部に慎重に挿入し、注射混合物を卵管に排出します。
    注意: エレクトロポレーションの効率に影響を与える可能性があるため、卵管に空気が入らないようにしてください。
    これを防ぐには、注入プラスチックキャピラリーに必要以上の注入混合物を充填し、完全な注入を避けてください。プラスチック製の毛細血管は、漏斗移植と漏斗と膨大の間の直接卵管壁郭清の両方に適しています。直接卵管壁郭清法は、漏斗と漏斗を覆う薄い滑液包膜を通る最初の切開を必要とするため、漏斗移植よりも外傷が少ない可能性があります。CD1マウスでは、この膜は高度に血管新生されており、これを切断すると軽度の出血を引き起こす可能性があり、視界が妨げられ、RNPミックスのマイクロインジェクションが複雑になる可能性があります。
  13. 卵管からプラスチック製の毛細血管をそっと取り除きます。

4. エレクトロポレーションと縫合

  1. フロントパネルのスイッチを押してエレクトロポレーターの電源を入れます。
  2. エレクトロポレーションパラメータの設定:ポアリングパルス:電圧:50 V、パルス長:5 m、パルス間隔:50 ms、パルス数:3、減衰率 - 10%、極性:+/-;転送パルス:電圧:10 V、パルス長:50 ms、パルス間隔:50 ms、パルス数:3、減衰率 - 40%、極性:+/-;現在の制限: in vivo。
  3. ピンセット式電極を使用して卵管を注意深くつかみ、エレクトロポレーターのkΩボタンを押して抵抗値を確認します。抵抗が 350-400 Ωの最適範囲内に収まるように、電極が十分に圧縮されていることを確認してください。
    注:これは、無傷の卵管が2つの電極の間に挟まれているときに、2つの電極間の距離を調整することで実現できます。
    1. 抵抗を測定した直後に、スタートボタンを押してエレクトロポレーションを開始します。このステップは、CRISPR-Cas成分を接合子4に効率的に送達するために重要です。Ωボタンに「終了」信号が表示されるまで待ちます。測定フレームに示されている値を書き留めます。
      注: インピーダンス値は、実行可能性と伝達効率の最適なバランスを確保するために、電圧値の約 250-400 Ω/150-250 mA である必要があります。このバランスを維持するには、このステップにより最適範囲を超えて抵抗が大幅に減少する可能性があるため、一部のプロトコルで推奨されているダルベッコの変性リン酸緩衝生理食塩水(DPBS)に浸した湿った紙で卵管領域を覆うことは避けてください。抵抗が減少すると、電圧が 250 mA 以上に上昇し、細胞死につながる可能性があります。
  4. 片方の卵管でエレクトロポレーションを完了した後、生殖管を慎重に腹腔内に戻します。4-0ポリグリコール酸外科用縫合糸を使用して切開部を縫合します。
  5. 2番目の卵管で手術とエレクトロポレーションを繰り返します。完了したら、生殖管を腹腔に戻し、上記のように切開部を縫合します。
  6. 処置後のモニタリング:マウスを温かい(37°C)清潔なケージに入れて回復し、麻酔から完全に回復するまで監視します。
    注:手術後、ケージごとに2匹のマウスを含むケージにマウスを収容します。1匹のマウスだけが手術を受けた場合は、コンパニオンメスのマウスを提供します。この実践は、手術用マウスの不必要なストレスを軽減し、より自然な社会環境を促進するのに役立ちます。

5. ジェノタイピング

  1. プライマーデザイン
    1. ジェノタイピングでは、長さが300〜600 bpのPCR産物を増幅するプライマーを設計します。プライマーは、長さ18〜21ヌクレオチドで、融解温度(Tm)は約60°Cである必要があります。
    2. 二次構造またはプライマー二量体を形成する配列は避けてください。プライマーの品質を確保するには、PerlPrimer 1.1.2111、In-Silico PCR V39x1などのソフトウェアツールを使用してください。
    3. マウスゲノムデータベースに対してBLAST検索を実行して、プライマー特異性を確認し、非特異的増幅を回避します11。
      注:以下のプライマーは、標的配列のジェノタイピング用に設計されました:フォワードプライマー:5'-CTCTCCCAAAGTCGCTCTGA-3';リバースプライマー: - 5'-TCTGTGGGAAGTCTTGTCCC-3'、予想されるPCR産物長:320 bp、およびTm 62°C。 サンガーシーケンシングの場合は、Cas9カット部位から150〜200 bp離れた場所でアニーリングするシーケンシングプライマーを設計します。
  2. DNA抽出を行います。迅速なDNA抽出のためには、Hotshot単離プロトコル12 が最も単純なものです。
    1. イヤーパンチを使用して、マウスの耳から小さな組織片(約2 mm)を収集します。
    2. 100 μLの溶解バッファー(25 mM NaOH、0.2 mM EDTA、pH = 12)を加えます。
    3. 95°Cで60分間インキュベートし、20分ごとに混合物をボルテックスします。
    4. 100 μLの中和バッファー(40 mM Tris-HCl、pH = 5)を加え、完全にボルテックスします。
    5. PCR用の最終調製物1〜5 μLを使用します。
  3. PCR増幅とシーケンシング。 表3に概説するようにPCRマスターミックスを調製します。校正DNAポリメラーゼを使用して、高い忠実度を確保します。マスターミックスを必要な数のチューブに分注し、ゲノムDNAを加えます。
    注:シーケンス分析のコントロールとして、常に野生型DNAサンプルを含めてください。
  4. ROSA26ジェノタイピングのためにPCRを実行します。次の条件が使用されました。初期変性:95°Cで30秒;28サイクル:95°Cで20秒(変性)、62°Cで20秒(アニーリング)、72°Cで20秒(伸長)。最終伸び:72°Cで2分。4°Cで保持します。
    注:提供されたプロトコルは、ステップ1.1.2のプライマーを使用した ROSA26 遺伝子座フラグメント(推定サイズ320 bp)増幅に対して正確です。より具体的で正確な増幅を行うには、増幅サイクルの数を28〜30に制限します。
  5. シーケンスと分析
    1. 得られたPCRフラグメントのサンガーシーケンシングを実行します(ステップ5.4)。
    2. シーケンス結果の分析
      注:トランスフェクションが成功すると、シーケンシングクロマトグラムのヌクレアーゼカット部位付近に追加のDNA配列が出現することで識別可能なモザイク動物が得られます。EditCo ICE AnalysisやTIDE13 などの計算ツールを使用して、ゲノム内の正確なインデルを同定し、定量します。
      1. ICE解析を使用するには、取得したサンガーシーケンシングファイル(編集なしのwtマウスPCR産物配列の場合はコントロール.ab1ファイル、実験マウスPCR産物配列の場合は実験.ab1ファイル)をアップロードし、ガイドRNA配列を入力し、CRISPR実験で使用するヌクレアーゼを選択するだけです。
        注:ICE解析ツールは、全体的な編集効率を計算し、サンプルに存在するすべての異なるタイプの編集のプロファイルと相対存在量を決定します。
      2. TIDEを使用するには、ガイドRNA配列を入力し、取得したサンガーシーケンシングファイル(編集なしのwtマウスPCR産物配列の場合はコントロール.ab1ファイル、実験マウスPCR産物配列の場合は実験.ab1ファイル)をアップロードし、パラメータにチェックを入れます(場合によっては、詳細設定により、10 bpを超えるインデルを見つけるのに役立ちます)。

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結果

エレクトロポレーションが成功した場合、実験マウスは、(1)一握りの子犬を産み、(2)一部の動物はゲノムに異なるインデルを持ちます。ジェノタイピングプライマーが適切に設計されており、PCRプログラムが最適である場合、PCR産物は所望のサイズの1つのクリアバンドとしてアガロースゲル上に存在します。ヌクレアーゼが標的DNAを切断することに成功した場合、得られた動物はモザイクであり、ゲノム内にさまざまなインデルを持つ可能性があります。EditCo ICE AnalysisやTIDEなどの計算ツールを使用して、ゲノム内の正確なインデルを見つけました。入力として、sgRNAスペーサー配列、野生型対照マウスPCR産物配列のクロマトグラムファイル、および得られた実験マウスPCR産物配列のクロマトグラムファイルを使用します。その結果、プログラムは、インデルバリアントの分布、対照プローブと実験プローブ間の不一致レベル、および(EditCo ICE分析を使用している場合)切断部位の近傍での配列アライメントを示す図を表示する必要があります(図2

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ディスカッション

I-GONAD 法を使用したノックアウト マウスの生成効率は、従来のマイクロインジェクション技術に匹敵します。ただし、従来の方法では、ドナーの女性から接合子を分離し、マイクロ注射を行い、偽妊娠した女性の卵管に胚を移植します。対照的に、I-GONAD 法は、ゲノム編集成分を妊娠中の女性の卵管に直接送達することでこのプロセスを簡素化し、接合子の分離や移植の必要性を排除します。提示されたプロトコルは、CRISPR/Cas9 技術を使用してマウス染色体 6 上の ROSA26 遺伝子座での変異の導入に成功したことを実証することにより、I-GONAD 法の有効性を強調しています。この技術を改良することにより、I-GONAD 手順を成功させるための最も重要なステップは次のとおりです: エレクトロポレーション中に正しい抵抗と電圧の設定を達成し、遺伝子構築物の注入中に卵管に空気が入らないようにします。

細胞生存率と転移効率の最適なバランスを確保するために、抵抗値は約 350-400 Ω、対応する電圧は 100-2...

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開示事項

著者は利益相反を宣言しません。

謝辞

著者は、サンクトペテルブルク大学リサーチパーク、分子細胞技術センターに感謝しています。シーケンシングは、サンクトペテルブルク州立大学サイエンティフィックパークの分子細胞技術リソースセンターで、ABI 3500 xL遺伝子分析装置(Thermo Fisher Scientific、米国)を使用して実行されました。著者らは、文書の編集と提出に協力してくれたマリア・ルーベルに感謝しています。この研究は、サンクトペテルブルク州立大学(研究プロジェクトID:129658320)から資金提供を受け、ルイボフ・シュコデンコはロシア科学財団(プロジェクト25-26-00247)の支援を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.5–5 uLピペット サーモ・サイエンティフィック4642020
1.5 mLチューブアプタカ1003/G
100〜1000 uLピペット サーモ・サイエンティフィック4642090
200 uL 真空管アクシゲンPCR-02-C
20-200 uLピペット サーモ・サイエンティフィック4642080
2-20 uLピペット サーモ・サイエンティフィック4642060
4倍ゲルローディングダイバイオラボミックスD-3002
アガロースAppliChemA8963,0500
DNase I、RNaseフリー(1 U/μL)サーモ・フィッシャーEN0521
dNTPセット、100 mM解サーモ・サイエンティフィックR0181
DreamTaq グリーンDNAポリメラーゼ(5 U/μL)サーモ・サイエンティフィックEP0713
ダルベッコS修正リン酸塩緩衝生理食塩水シグマ・オルドリッチD8537
EditCo ICE分析https://ice.editco.bio/#/2025年6月4日アクセス
EDTA 0.5M溶液、pH=8AppliChemA4892,0500
アンサンブル https://www.ensembl.org/index.html2025年6月9日アクセス
臭化エチジウムバイオラボミックスEtBr-10
アイジェル点眼薬「Oftagel」ウルサファーム204604
ゲルドキュメンティングシステム ChemiDoc XRS+バイオ・ラッド1708265
In-Silico PCR V39x1 https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr 2025年6月9日アクセス
インテグレーテッドDNAテクノロジー https://eu.idtdna.com2025年6月9日アクセス
顕微外科用ハサミメディン・ウラルM124
NEPA21エレクトロポレーターネパ遺伝子NEPA21CUY652P2.5X4電極付き
NTPセット、100 mM解サーモ・サイエンティフィックR0481
オリゴヌクレオチドエヴロゲン直接注文、標準的な脱塩精製
Opti-MEM I 還元血清培地サーモ・フィッシャー31985070
PerlPrimer(パールプライマー)https://perlprimer.sourceforge.netバージョン1.1.21。
フュージョン高忠実度DNAポリメラーゼ(2 U/μL)サーモ・サイエンティフィックF530L
ピペット 10 uL チップウルプラストHT-10-960
ピペット1000 uLのチップウルプラストHT-1000-576
ピペット200 uLのチップウルプラストHT-200-960
電源供給」エルフ4」DNA技術PS-400 NEW
RNAse/DNAseフリーウォーターインビトロジェン10977049
生理食塩水溶液パネコP011n
SE-1 雄鳥電気泳動系ヘリコンSE-1
水酸化ナトリウムシグマ・オルドリッチS5881-500G
Step100 DNAラダーバイオラボミックスS-8100
立体顕微鏡SMZ1000ニコン5-363376
ストリッパーマイクロピペッタークーパー・サージカルMXL3-STR
ストリッパーチップオリジオMXL3-125
外科用針など;KMIZ4A1- 0,6×20
鉗子の縫合メディン・ウラルM302.2
鉗子の縫合メディン・ウラルM303
縫合糸 POLYCON Nfigure-materials-1SYNTHEGOノックアウトガイドデザイン https://design.synthego.com/#/2025年6月9日アクセス
T100アンプバイオラッド10014822
T7 RNAポリメラーゼ サーモ・サイエンティフィックエピソード0111
TBEの10倍バッファバイオラボミックスTBE-500
潮とnbsp;https://tide.nki.nl/2025年6月4日アクセス 
塩酸三塩蘇州ヤクー科学SYS-S0005-0.5
トリズマ塩酸塩溶液シグマ・オルドリッチT2663
トリゾル試薬インビトロジェン15596026
TrueCut Cas9プロテインインビトロジェンA36499
ユニバーサルハサミメディン・ウラルM147
キシラジンInterchemie Werken de AdelaarIX2
ゾレティルバーバック研究所2000443714739.00

参考文献

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