方法論記事

無料の計算ツールを使用した質量分析ベースのプロテオミクスデータのナビゲート

DOI：

10.3791/68707

⸱

2025年8月19日

 , 
1School of Life Sciences, Westlake University, 2Molemuse Biotech Studio

この記事について

サマリー

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質量分析ベースのプロテオミクスデータは、オープンデータベースで利用でき、無料のツールを使用してアクセスできます。データベースの検索と説明が複雑であることを考えると、多くの生物学者はこれらのデータセットを利用するための知識を欠いています。ここでは、基本的なプロテオミクスデータ検索に無料のツールを使用するためのガイドを提供します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

データ依存取得 (DDA) やデータ非依存取得 (DIA) などの質量分析 (MS) ベースのプロテオミクス データは、生物学研究で広く使用されています。しかし、プロテオミクスデータを効果的に検索および分析する方法についての明確なデモンストレーションが不足しているため、検証研究におけるこれらのデータセットの適用はまだ限られています。このギャップを埋めるために、プロテオミクスデータ解析ワークフローとタンパク質検索結果の下流の後処理をよりよく説明するために、PRoteomics IDEntifications Database(PRIDE)データリポジトリに預けられた1つのDDAデータセットと1つのDIAデータセットを選択しました。デモンストレーションの目的で、DDAデータセット用のFragPipe(v22.0)とDIAデータセット用のDIA-NN(2.1.0)の2つの無料の計算ツールを使用しました。火山プロットや調節不全タンパク質のリストの生成などの後処理ステップは、Rコードを使用して実証されました。この研究は、プロテオミクス データを検索および分析するための基本的なプロトコルを提供し、プロテオミクス データセットを効果的に処理するための重要な初心者向けガイドとして機能します。この研究を通じて、研究者が生物学的研究でプロテオミクスデータを活用するために必要な知識を身につけることを目指しています。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

プロテオミクスの分野は、オープンアクセスのデータリポジトリとフリーソフトウェアツール1の普及によって革命を起こし、研究能力の向上とデータ共有の文化の促進に貢献してきました。PRIDE2 などの一元化されたリソースの確立と、Human Proteome Organization (HUPO) Proteomics Standards Initiative (PSI)3 による標準化されたデータ形式の開発により、データの再利用と統合に前例のない機会が生まれました。しかし、プロテオミクスデータの分析と解釈は、特に自分の実験結果の直交検証を実行したい生物学者や医師科学者にとって、依然として重大な技術的障壁を提示しています4。この原稿は、ベンダーに依存しない計算ワークフローを提示することで、研究者が公開プロテオミクスデータを独自にクエリ、分析、および独自の発見と統合するためのアクセス可能なフレームワークを提供することで、この課題に直接対処し、それによって追加のウェットラボ実験を必要とせずに堅牢な直交検証を促進します。この研究は、独自の実験で同定された特定のタンパク質の異なる発現を直交的に検証し、幅広い発表された研究にわたって目的のタンパク質の発現パターンを調査することにより、新しい仮説を立てようとしている研究者に特に適しています。ステップバイステップのガイドを提供することで、より幅広い科学者が公開プロテオミクス データの可能性を最大限に活用できるようにし、最終的には研究の堅牢性と影響力を高めることを目指しています。

質量分析(MS)ベースのプロテオミクスでは、MS1およびMS2スキャンがデータ収集の基礎となります。MS1スキャン、またはサーベイスキャンは、サンプル中のすべてのイオンの質量電荷比(m / z)を検出および測定し、イオン集団の包括的な概要を提供します5。MS2スキャンは、フラグメンテーションスキャンとも呼ばれ、MS1スキャンから選択された特定の前駆体イオンを単離してフラグメント化し、ペプチド同定のためのフラグメントイオンスペクトルを生成します6。

データ依存取得(DDA)は、MS2フラグメンテーションのためにMS1スキャンから最も豊富なイオンを選択し、分析を合理化するよりシンプルなスペクトルを生成します。ただし、DDAは、複雑なサンプルで確率的サンプリングと欠損値を引き起こし、再現性を制限する可能性があります7。対照的に、データに依存しない取得 (DIA) は、事前定義された m/z ウィンドウ内のすべてのイオンを体系的にフラグメント化し、包括的なカバレッジを確保し、欠損値を最小限に抑えます。これにより、定量的精度と再現性が向上しますが8、DIAは非常に複雑なMS2スペクトルをデコンボリューションするために高度な計算ツールを必要とします9。

PRIDE(https://www.ebi.ac.uk/pride)2は、プロテオミクスデータを共有するためのグローバルプラットフォームであるProteomeXchangeコンソーシアム(https://www.proteomexchange.org)10内の主要なリポジトリです。ユーザーは、キーワード検索を使用してこの膨大なリソースを効率的にナビゲートし、関心のあるデータセットを見つけることができます。

DIA-NN11は、ディープニューラルネットワークを活用したソフトウェアスイートで、データに依存しない取得(DIA)プロテオミクスデータを解析するためのゴールドスタンダードツールです。識別と定量化の精度に優れており、複雑な DIA データセットの処理に特に効果的です12。データ依存取り込み(DDA)ワークフローでは、FragPipeパイプラインに統合されたMSFragger13が超高速ペプチド同定を提供します。その革新的なフラグメントイオンインデックスアプローチにより、迅速なスペクトルマッチングが可能になり、従来のツールよりも100倍以上の速度でパフォーマンスを発揮します。

これらの包括的なデータベースと高度なツールを備えているため、研究者はプロテオミクス データを相互研究の検証や新しい生物学的発見に容易に再利用できます。このアクセシビリティにより、多様な疾患にわたる多数のタンパク質バイオマーカーの同定が促進され14,15、予後予測が改善され16、プロテオミクスプロファイルに基づく分子サブタイプ分類が可能になりました17。

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プロトコル

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注:ワークフローの概要については 図1を参照し、使用するソフトウェアの詳細については 、材料表 を参照してください。

figure-protocol-1
図1:研究デザインの概要。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. ファイルとソフトウェアのセットアップ例

注:すべてのアプリケーションは、個々の研究用に無料で使用でき、パーソナルコンピュータで実行できます(WindowsおよびLinuxがサポートされています)。

  1. プロジェクトの新しいディレクトリを作成します。
  2. JMU_LM2_8526_55.raw、JMU_LM2_8568_51.raw、JMU_LM2_8696_37.raw、JMU_LM2_2112_87.raw、JMU_LM2_2195_91.raw、JMU_LM2_2377_73.raw、20150127_liver_XH03_T_01.raw、20150127_liver_XH03_T_02.raw、20150127_liver_XH03_T_03.raw、20150127_liver_XH03_P_01.raw、20150127_liver_XH03_P_02.rawをダウンロード、 PRIDEの20150127_liver_XH03_P_03.raw。
    注:2つのファイルグループは、https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD039273 からダウンロードし、https://www.ebi.ac.uk/pride/archive/projects/PXD006512 別々にダウンロードできます(図2)。
  3. 必要なソフトウェアツールをダウンロードしてインストールします。
    1. DIA-NNの最新バージョンを.msiファイルとしてダウンロードします。DIA-NNは、Windows用の.msiファイルまたはLinux用の.zipファイルとして https://github.com/vdemichev/DiaNN/releases/tag/2.0 から自由に入手できます
    2. 最新バージョンの MSFileReader を.exeファイルとしてダウンロードします。MSFileReaderは、生のフォーマットされたThermo Fisher DIAデータの処理に必要な https://github.com/thermofisherlsms/MSFileReader/blob/main/MSFileReader_x64.exe の.exeファイルとして無料で入手できます。
    3. 最新バージョンの .NET SDK を .exe ファイルとしてダウンロードします。.NET SDK は、https://dotnet.microsoft.com/en-us/download から .exe ファイルとして無料で入手でき、Windows で MSFileReader を実行するために必要なファイルです。
    4. FragPipeの最新バージョンを.zipファイルとしてダウンロードします。FragPipeは、https://github.com/Nesvilab/FragPipe/releases から.zipファイルとして自由に入手できます。jreを含むzipファイルには、FragPipeの実行に必要なWindows用のJavaランタイムが含まれているため、推奨されます。MSFragger は FragPipe に埋め込まれています。
  4. 最新バージョンの R と Rstudio と R スクリプト ファイルを補 足ファイル 1 と補足ファイル 2 からダウンロードします。RとRStudioは、https://cran.rstudio.com/bin/windows/base/R-4.5.0-win.exe と https://posit.co/download/rstudio-desktop/ から自由にダウンロードできます。
  5. 圧縮ファイルを解凍し、 をクリックします。exeまたは.msi Files を使用してアプリケーションをインストールします。

2. DIA-NNを用いたDIAデータ解析

  1. UniProtからリファレンスプロテオームファスタファイルをダウンロードします。 ホモサピエンス 参照プロテオーム(アイソフォーム情報は含まれていません)をダウンロードするには、https://www.uniprot.org/proteomes/UP000005640 に移動します(図3A)。
  2. Add FASTA ボタンをクリックして、リファレンスプロテオームファイルをDIA-NNにロードします。
  3. 前駆体イオン生成部分で、 ライブラリフリー検索/ライブラリ生成用のFASTAダイジェ ストとディー プラーニングベースのスペクトル、RTおよびlMs予測 の2つのオプションを選択します。[ 実行] ボタンをクリックして、予測スペクトルライブラリを生成します(図3B)。
    1. 予測スペクトルライブラリファイルが生成されたら、[ スペクトル] ボタンをクリックして予測ライブラリを追加することで、同じ実験取得設定内の他の実験に再利用します。
  4. 前駆体イオン生成部の2つのオプションの選択を解除し、入力部の下のファイル形式に関連するタイプボタンをクリックして、DIAデータをロードします。
  5. アルゴリズムの質量精度とMS1精度を0.0ppmに設定します。
  6. 実験設定に基づいて、前駆体イオン生成部分の前駆体とフラグメントの質量範囲の設定を調整します。
  7. その他のデフォルト設定はそのままにします。
    1. DIA-NNの前駆体生成では、トリプシン/P(プロリンが続かない限り、K/Rの後に切断される)を使用し、1つの切断を逃して部分消化をモデル化します。非標準ペプチド(免疫ペプチドミクスなど)の N項M切除 を無効にするか、より長いペプチドの欠落切断を2に増やします。
    2. 翻訳後修飾(PTM)研究(例えば、酸化用のOx(M)、ユビキチン化用のK-GG)の可変修飾(デフォルトでは無効)を明示的に有効にし、ペプチドフィルター(長さ:7-30 aa、電荷:1-4+、前駆体 m/z: 300-1800)を実験設定(長さ:5-50 aa、電荷=1-6)を拡大します。
    3. アルゴリズム設定では、自動校正(質量精度=0.0 ppm)を利用して正確な質量アライメントを行い、低分解能装置の場合は手動許容誤差(10 ppmなど)で上書きし、実行間の一致(MBR)は実行間でIDを転送します(不均一サンプルの場合は無効)。
    4. ニューラルネットワークスコアリングは同定の信頼性を高め(データ品質が低くない限り保持)、Quant Unlabeled Mass Spectrometry(UMS)は高精度のラベルフリー定量を可能にします。同重体タグ(TMTなど)のMS2定量に切り替えます。高分解能DIAデータでのみライブラリフリー検索を使用して、スペクトルライブラリの要件を回避します。
  8. [ 実行] ボタンをクリックします。実行が終了したことを示す操作インターフェイスに Finished が表示されるまで、結果を待ちます (図 3C)。

3. FragPipeを用いたDDAデータ解析

  1. インストール後、~\FragPipe\fragpipe\binフォルダにある Fragpipe アイコンをクリックします。すべての依存設定は、[構成]タブで確認できます。3つのモジュール(MSFragger、IonQuant、diaTracer、DIA-NN、Python)がコンピューターに存在するかどうかを確認します。そうでない場合は、[ Download/Update ] または [ Download ] をクリックしてダウンロードします(図 4A)。
  2. 次のタブ [ ワークフロー] に切り替えます。ワークフローの [デフォルト] を選択し、[ ワークフローの読み込み] をクリックします。[ ファイルの追加 ] をクリックして、ファイル パスを追加します。[ファイルの割り当て]で実験名とバイオレプリケート番号を割り当てるか、そのままにしておきます(図4B)。
  3. 次に、[データベース]をクリックして、そのタブに移動します。サンプルの種類に応じて、ファスタファイルをロードするか、ファスタファイルをダウンロードします。ダウンロード中に、簡単な実行のために、レビューされたシーケンスのみ、デコイの追加、および一般的な汚染物質の追加オプションを選択します(図4C)。
  4. 次に、 MSFragger をクリックしてタブを変更します。 Closed Search のデフォルト設定 を選択し、[ Load] をクリックします。
    注: クローズド検索は基本的に、設定した変更の検索ですが、オープン検索はデータから考えられるすべての変更を探索するため、時間とメモリを消費します。
  5. ピークマッチングでは、時間を節約するため、キャリブレーションと 最適化でなし を選択することを除いて、デフォルト設定のままにします。
  6. タンパク質消化の場合は、実験条件に応じてパラメータを調整します。次のデフォルト設定を維持します(図5A)。
    注:前駆体およびフラグメント質量許容誤差(±20 ppm)は、実験スペクトルを理論上のペプチドに一致させるための最大許容質量誤差を定義し、高分解能装置にはより厳しい値が推奨されます。酵素ルール(厳密なトリプシン)は、切断特異性(P が続く場合を除き、K/R の後)を指定し、切断の欠落 (2) により、部分的に消化されたペプチドが可能になります。ペプチド長(5〜50残基)および質量(500〜5000 Da)のフィルターは、ありそうもない候補を除外します。可変修飾(例えば、酸化のためのメチオニンの+15.9949 Da、リン酸化のためのS/T/Yの+79.96633 Da)は化学的変化の検出を可能にしますが、最大の組み合わせ(5)は、検索空間を管理するためにペプチドごとの同時修飾を制限します。サイトごとの最大可変 MOD 数 (たとえば、M では 3 つ) は、変更頻度を制御します。データベースを分割すると、大きなプロテオームの効率が向上し、同位体誤差(0/1/2)は、誤って割り当てられた同位体ピークの原因となります。これらの設定は、ペプチド同定における感度、特異性、および計算負荷のバランスを総合的にとります。
  7. [検証] タブに変更します。DIAデータ用の [RTの予測] と [スペクトルの予測]の選択を解除します(図5B)。
  8. Quant (MS1) タブをクリックします。[MS1 quant を実行] を選択し、[Load Quant defaults] をクリックします。IonQuantを選択し、デフォルト設定のままにします(図6A)。不安定な保持時間に対して MBR を無効にするか、グローバル スケーリング バイアスが発生した場合は強度正規化を無効にします。[ディスクにインデックスを保持] を有効にして、大規模なデータセットで RAM を節約します。
    注:Quant(MS1)は、MaxLPQ(MaxLFQベースのタンパク質定量、MaxLFQ法をタンパク質グループに拡張するアルゴリズム)を使用してラベルフリー定量を最適化するようにデフォルトで、タンパク質あたり≥1個の固有のイオンが必要です(カバレッジを犠牲にして、より高い厳密性を得るには≥2に増やします)。Match Between Run(MBR)は、保持時間(RT)許容差(デフォルトは 0.4 分、安定したクロマトグラフィーの場合は 0.2 分に締める、グラジエント変動の場合は緩め)とイオンモビリティー(IM)許容差(デフォルトは 0.05 1/k0 [逆移動度低下]、IM 精度に基づいて調整)を使用して、≤1% FDR(誤検出率、デフォルト MBR イオン FDR=0.01、厳密性の場合は 0.005 に低く)を使用して、ラン間で同定を転送します。タンパク質推論では、uniquer+rascor(タンパク質グループ化のためのかみそりペプチド割り当て)を使用します。特徴検出では、10 ppm の質量許容誤差が採用されます (低分解能 MS の場合は 20 ppm に増加、高分解能の場合は 5 ppm に減少)。
  9. 次に、[ 実行] タブをクリックします。 [出力ディレクトリ] を選択します。 [実行] をクリックして、データの分析を開始します (図 6B)。
    注:修飾に焦点を当てていない、またはラベルベースの定量化を使用しないラベルフリープロテオミクスデータの場合、PTM、グリコ、および定量(同重体)タブは使用されません。

4. DIA-NN / FragPipe下流解析

注: この研究で使用された詳細なコードは、補足ファイル 1 および補足ファイル 2 として含まれています。この調査で使用されたパッケージ バージョンは、補足ファイル 3 に記載されています。

  1. RStudioを開き、DIA-NNまたはFragPipeによって生成されたタンパク質発現データを読み取ります。通常、DIA-NNの.pg_matrix.tsvで終わるタンパク質グループマトリックスデータと、FragPipeの.tsvで終わる結合タンパク質データが分析に使用されます。
  2. NAを埋めずに欠損値を削除し、2つ未満の固有のペプチドで同定および定量されたタンパク質グループをフィルタリングします。
    注:この研究のDIA数値はろ過されたタンパク質グループによって生成されましたが、DDAの数値はろ過されていないタンパク質グループからのものです。
  3. サンプル全体の中央値スケーリングまたは分位点正規化を使用して、タンパク質強度を正規化します。この研究の DIA データは中央値正規化によって正規化され、DDA データは分位数正規化によって正規化され、2 つの方法をよりよく実証しました。
    注:正規化の中央値は外れ値に対して堅牢であり、タンパク質の大部分がサンプル間で変化しないシナリオに適しているため、タンパク質の存在量の中央値が安定した基準点になります。ただし、高度に差次的に発現するタンパク質を含むシナリオでは失敗する可能性があります18。分位点正規化により、サンプル間でタンパク質の存在量が均一に分布するため、異なる分布を持つサンプルを比較する場合に役立ちます。統計的検出力を低下させ、データを過剰に正規化し、真の生物学的差異を覆い隠す可能性があることが示されています18。プロテオミクスでは、中央値の正規化は、MS装置の性能に関連する体系的なバイアスを除去するために、ラベルフリー研究で広く使用されています。分位点正規化は、大規模なデータセット、差分式分析、およびクラスター分析に好まれます19,20。
  4. log2 倍の変化 (例: PDAC 血清と正常) と t 検定の p 値を計算します。Benjamini-Hochberg法を使用して補正されたp値を計算します。有意性しきい値を定義します(例:|log2FC| > 1, p_adj (FDR) < 0.05)。
    注:この研究の図で使用されているカットオフp値は、調整されたp値(p_adj)を使用すると、これらの限られたデータセットの統計的検出力内で検出可能なすべてのタンパク質が排除されるため、生の値を表しています。
  5. 欠損値/NA値の存在を確認し、除外します。火山プロットを生成して、重要なヒットを視覚化します。
  6. 著しく調節不全のタンパク質を選択します。タンパク質発現値にZスコア正規化を適用します。サンプル グループ注釈を使用してクラスター化されたヒートマップをプロットします。
  7. 組織を使用してタンパク質を Entrez ID にマッピングします。Hs.eg.db. GO 濃縮 (生物学的プロセス) および KEGG 経路分析を実行します。
    注:生物学的プロセス(BP)カテゴリは、複数の分子活性によって達成されるより大きなプロセスまたは生物学的プログラムを記述するため、遺伝子オントロジー(GO)分析で一般的に選択されます20。これらの用語は、細胞周期調節や代謝プロセスなどの重要なプロセスを含む、がんなどの病気でうまくいかない細胞機能に焦点を当てています。BPに加えて、GO分析には分子機能(MF)および細胞成分(CC)のカテゴリも含まれます。MF 用語は、イオン輸送や DNA 結合能力など、遺伝子産物の生化学的活性を概説します。CC用語は、核、ミトコンドリア膜、細胞骨格など、遺伝子産物が機能を実行する細胞の場所を定義します。
  8. 相互作用の STRINGdb をクエリします (信頼度スコア≥ 400)。visNetwork を使用して対話型ネットワークを生成します。

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結果

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プロテオミクスデータセットの検索をよりよく説明するために、この分析のために2種類のデータセットを選択しました。タンパク質の調節不全を臨床文脈で実証することを目的として、PRIMIDEでclinicなどのキーワードで検索しました。具体的には、臨床プロテオミクス腫瘍分析コンソーシアム(CPTAC)21からDIA分析に適したデータセットを選択し、中国ヒトプロテオームプロジェクト(CNHPP)22からDDA分析に適したデータセットを選択しました。これらの選択により、健康なプロテオミクスデータと疾患関連のプロテオミクスデータの両方を分析するソフトウェア機能の包括的な評価とデモンストレーションが容易になりました。

提示された火山プロットは、正常な個人と膵管腺癌(PDAC)に罹患している人、および肝細胞癌(HCC)腫瘍サンプルとそれらの対になった組織の間の血清タンパク質の...

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ディスカッション

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提示されたプロトコルは、DIA-NNやFragPipeなどの無料ツールを統合することによるプロテオミクスデータ分析を示しています。成功は、DIA-NNでのスペクトルライブラリ生成のための正確な前駆体イオンの選択や質量精度の設定(ステップ2.3)27などの重要なステップにかかっており、これらは機器に依存し、完全なペプチド同定に不可欠です。同様に、おとりの生成や汚染物質のフィルタリングなど、FragPipeでの綿密なデータベース設定(ステップ3.4)は、FDRの制御に不可欠です。

変更とトラブルシューティングには、多くの場合、ソフトウェアの依存関係 (MSFileReader の場合は .NET、FragPipe の場合は Java) の検証と計算リソースの管理が含まれ、特に MSFragger のメモリの増加や DIA-NN のハイ パフォーマンス コンピューティング (HPC) の使用が必要な大規模なデータセットの場合です。コミュニティ フォーラム (GitHub ...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

F.Z.はMolemuse Biotech Studioの創設者です。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロジェクトは、Molemuse Biotech Studio によってサポートされています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
.NET SDK v. 9.0.203マイクロソフトhttps://dotnet.microsoft.com/en-us/download
DIA-NN v. 2.1.0https://github.com/vdemichev/DiaNN/releases/tag/2.0 
FragPipe v. 22.0https://github.com/Nesvilab/FragPipe/releases
MSFileReader v. 3.1 サーモフィッシャーhttps://github.com/thermofisherlsms/MSFileReader/blob/main/MSFileReader_x64.exe
R 4.5.0https://cran.rstudio.com/bin/windows/base/R-4.5.0-win.exe
Rstudio v. 2024.12.1+563https://posit.co/download/rstudio-desktop/

参考文献

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