方法論記事

組換えクモ糸繊維生産のための手描きと湿式紡績の最適化と評価

DOI：

10.3791/68714

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2025年7月29日

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1Department of Biochemistry & Molecular Biology, Dalhousie University, 2Department of Chemistry, Dalhousie University, 3School of Biomedical Engineering, Dalhousie University

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サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

提示されたプロトコルは、紡績用の組換え絹タンパク質の可溶化を最適化するための汎用性の高い一連の方法を提供します。手描きによる紡績性のテスト。自動湿式紡績で長く連続した繊維を生産します。繊維の形態、分子整列、機械的挙動、および繊維内または繊維内のタンパク質二次構造含有量を比較評価します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

クモの糸は機械的特性で知られており、特徴的な高強度、高伸張性、またはこれらの組み合わせにより高い靭性が得られます。典型的なメスの球体編みクモは 7 種類の絹を生産し、それぞれは通常、タイプ固有のタンパク質から紡がれ、明確な生存機能に合わせて機械的に調整されます。組換えクモの糸の製造は、これらの材料を得るための有望なルートを提供し、大量の天然絹を得る際の課題を回避し、例えば、部位特異的突然変異誘発や融合タンパク質の構築を通じてタンパク質のカスタマイズを可能にするという利点を提供します。

提示されたプロトコルでは、手描きと湿式紡績の両方のアプローチを通じて紡績に対するタンパク質の適合性を評価するための方法論を概説します。適切に精製された凍結乾燥タンパク質粉末から始めて、初期可溶化タンパク質状態を最適化して高濃度の「スピニングドープ」状態を提供する方法が詳細に説明されています。次に、紡績プロセスの一部としてポストスピンドローを使用して繊維の挙動を調節する方法についての議論を含め、手描きアプローチと湿式紡績アプローチを比較します。得られたシルク繊維を特徴付け、どの紡績条件が最も実りある可能性が高いかを決定するための典型的なワークフローが、繊維の直径とその均一性を評価するための光学顕微鏡を含む詳細に説明されます。繊維内で達成されている(超)分子整列の程度を推定するための偏光顕微鏡。強度、伸張性、ヤング率、靭性を評価するための引張試験。フーリエ変換赤外 (FTIR) 分光顕微鏡法により、繊維内のタンパク質の二次構造を評価します。

このプロトコルは、腺房状(ラッピング)シルクの反復的および非反復的ドメインに基づくいくつかの異なる組換えクモの糸タンパク質に適していることが証明されています。梨状シルク;腺房状、梨状、および/または主要なアンプルレート(ドラッグライン)シルクを含む融合タンパク質。個々のタンパク質の挙動に合わせて条件とパラメーターを変更し、機能的転帰の違いを達成することができるいくつかの強調されたステップを通じて、より広範な適用性が提供されます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

クモは、巣の構築、獲物の捕獲、卵の保護など、さまざまな特殊な作業のために絹を生産します1。クモの糸は、ほとんどの既知の天然および合成材料を凌駕する優れた機械的特性を示しており2、多様な産業および生物医学用途向けのエンジニアリングおよび強化されたクモの糸材料の製造に向けて多大な努力が促されています。クモの糸を形成するタンパク質であるスピドロインは、非反復的なN末端およびC末端ドメイン3によって囲まれた比較的大きな反復ドメインで構成されており、いくつかの絹タイプの独特の機械的特性は、反復ドメイン内の短いモチーフの繰り返しに関連しています4,5,6。商業的に栽培されている桑蚕(Bombyx mori)が収穫に適した一貫した繭の形で大量の絹を生産するのとは異なり、クモは本質的に共食い性で縄張り性のある生物であり、絹の生産量は限られているため、農業生産と収集に課題が生じています7.これらの制限を考慮して、組換えクモの糸の生産は、適用に十分な量のクモの糸を制御的に取得するための、より実現可能で持続可能な代替手段として開発されました。

組換えクモの糸の生産には、タンパク質発現に適した宿主の選択が必要です。クモの糸は、細菌 8,9、酵母10,11、昆虫細胞12、植物13,14、哺乳類細胞15,16 など、さまざまな宿主系で発現しており、大腸菌が最も一般的に使用される宿主系です。最大700 kDaに達する可能性のあるスピドロインの高分子量7は、完全長コンストラクトの発現に重大な課題をもたらします。天然のクモの糸と比較して同等または強化された特性を持つ組換えクモの糸を製造するために採用される主な戦略は、限られた数の繰り返し単位(非反復ドメインの有無にかかわらず)を持つコンストラクト、異なる絹の種類の組み合わせで構成されるキメラ、および非絹タンパク質と融合したハイブリッド絹などの切り捨てられた変異体の発現です。たとえば、組換えメジャーアンプルトスピドロイン(284.9 kDa)は、代謝的に操作された大腸菌で首尾よく発現し、得られたシルクは天然のメジャーアンプルレートシルクに匹敵する機械的特性を示しました9。さらに、梨状スピドロインの2つの繰り返し単位と腺房状スピドロインの2つの繰り返し単位で構成される人工絹繊維は、天然の鞭毛状絹に匹敵する、構成の梨状または腺房状絹のいずれかに対して優れた伸延性を示した17。

組換えタンパク質の製造により、機能性ペプチドまたはタンパク質セグメントをシルクタンパク質に直接組み込むことも可能になり、特定の用途に合わせた特性を備えた生体材料の製造が可能になります。たとえば、RGD細胞結合モチーフと主要なアンプルトスピドロインに由来する遺伝子操作されたシルクとの遺伝的および化学的融合により、線維芽細胞の接着と増殖を有意に増強するフィルムが形成されました18。別の研究では、腺房状スピドロインと主要なアンプルレートスピドロインのC末端ドメインを含むキメラタンパク質に融合した神経成長因子β(NGF)結合モチーフで構成されるハイブリッドシルクコンストラクトが、ニューロン様細胞の成長と分化をサポートすることが実証されました19。

組換えシルクタンパク質の発現および精製に成功すると、意図された用途に応じて、ヒドロゲル、フィルム、繊維、ナノ粒子、フォーム、およびスポンジなどのさまざまな形態に加工されてもよい20,21。人工絹繊維の生産を可能にするために、クモの非常に複雑で厳密に規制された天然繊維紡績プロセスの特定の側面を模倣した紡績方法が開発されました。天然の主要アンプルレートシルクでは、スピドロインは主要なアンプルランドの上皮細胞によって産生され、高濃度(最大50%(w / v))22で内腔内に可溶性状態で保存され、水性スピニングドープを形成します。紡糸ドープが紡糸ダクトを通過すると、ダクトの狭窄と繊維引抜成形プロセスの両方によるpH、イオン濃度、含水率、せん断力の変化を経験し、液体絹タンパク質の固体繊維への変換を誘発します23,24。したがって、組換えシルクタンパク質を高濃度で可溶化または懸濁させて紡糸ドープを形成できる適切な溶媒の同定は、人工繊維紡績プロセスにおける重要な第一歩です。

絹タンパク質紡糸ドープの配合には幅広い溶媒が使用されており、溶媒の選択は繊維形成および機械的特性に影響を与えることが示されている25,26。したがって、結果として得られる繊維特性を最適化するには、ドープ溶媒の選択を慎重に検討することが不可欠です。スピニングドープは、1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロイソプロパノール(HFIP)27、ヘキサフルオロアセトン(HFA)28、トリフルオロ酢酸(TFA)および2,2,2-トリフルオロエタノール(TFE)26の混合物、ギ酸29、およびリン酸ナトリウム/トリス緩衝液30などの有機溶媒または水性溶媒のいずれかを使用して配合することができる。タンパク質の溶解度は通常、pH、イオン強度、濃度などの要因に影響されるため、適切なドープ溶媒の同定には、一般に、さまざまな溶媒の体系的な評価、pHとタンパク質濃度の最適化、場合によっては溶媒と水の混合物を使用して最適なスピニングドープ条件を決定することが含まれます。さらに、高粘度ドープ溶液はスピニング中の流体の流れを妨げる可能性があるのに対し、粘度が不十分なドープは通常、繊維形成には適していないため、スピニングドープの粘度はスピニングプロセスの前に評価すべき重要なパラメータである31,32。過酷なスピンドープ条件を使用すると、長時間暴露するとタンパク質構造が変化する可能性があることに注意する必要があります。したがって、環境に優しいドープ溶剤の開発は、依然として活発な研究分野です。

手描きと湿式紡績は、組換え絹繊維紡績の 2 つの一般的な方法です。各方法を使用して製造された繊維の機械的特性は、紡績条件自体とスピン後の処理の両方に大きく依存します。ドロースピニングとも呼ばれるハンドドローイングは、通常、ピペットチップ、鉗子、またはピンセットを使用して、精製されたタンパク質の溶液から繊維を引っ張り、その後、自然乾燥と特性評価を行う単純な繊維製造方法です33,34,35,36,37。手描きは、さまざまな絹繊維形成条件を迅速にスクリーニングし、結果として生じる繊維の機械的挙動を一般に分類するための優れたアプローチを提供しますが、この手法は長い(つまり、数メートルの長さ)連続繊維に容易に拡張することはできません。別の方法として、スピニングドープを凝固浴(通常は水とエタノールまたはメタノールの混合物で構成される水性または有機溶媒)に一定の速度で連続的に押し出す湿式紡糸を採用しています 9,15,31,38,39,40 .回転ドープを凝固浴に浸すと、急速なタンパク質脱溶媒和が起こり、連続繊維が形成されます24。その後、繊維は凝固槽から一定の速度で引き出され、押出速度に一致して紡績時 (AS) 繊維を提供するか、スピン後引き抜きを受けて、通常機械的特性が改善された後紡績 (PS) 繊維を提供します。スピン後の延伸は通常、空気中、溶媒中、または溶媒浸漬後に繊維を元の長さの2〜8倍の比率に引き伸ばすことを含み、各パラメータは特定の機械的特性に寄与します15,17,31,38。

このプロトコルは手描きと湿式紡績の方法に焦点を当てていますが、これらの方法をコンテキストに配置することが重要です。エレクトロスピニング法は、水性条件と有機条件の両方からの組換えクモの糸に対して報告されており、繊維マット、整列繊維、および糸の製造を可能にし、繊維は通常、直径41のナノメートルスケールです。これにより、ナノスケールの繊維の潜在的な利点が得られ、ミクロンスケールの繊維が望まれる場合には、通常、力学と水適合性を改善するためにβシート構造への変換を誘導するためにスピン後処理を実行する必要があります。ミクロンスケールの幅と厚さのマルチメートルの組換えクモの糸リボンは、有機溶媒42から乾式紡糸することによって得られ、スピンドープ段階での金属イオンの取り込みが力学を改善するという最近の実証があります43。マイクロ流体ベースの紡糸44は、3Dプリンティング技術と天然紡糸口金45を模倣するように設計されたマイクロニードル紡糸口金との最近の組み合わせを含み、高度に制御可能な組換え絹繊維紡績に適しています。シルク(またはシルクのような)繊維の生産に適していると報告されている多種多様な方法にもかかわらず、本プロトコルは、これらの方法が私たちの手の中でいくつかの異なる組換えシルク変異体に変換可能であることが証明されており、生体材料の開発と比較評価のための扱いやすい出発点を提供するため、手描きと湿式紡績による組換えシルク繊維の生産を詳述しています。

繊維の紡糸と収集に続いて、光学的、機械的、および分光技術の組み合わせが日常的に使用され、紡績後の特性を特徴付けます。各方法は、繊維形成プロセスと材料性能との相関関係に関する重要な洞察を提供します。ここでは、絹繊維の特性と性能に関する重要な情報を提供する他の多くの方法論があることに注意して、これらの方法のサブセットに焦点を当てます。光学顕微鏡は繊維の形態を評価するために使用され、同一および異なる条件の両方で紡績された繊維の直径を比較することができます17、31、38、46。この手法は、その後の特性評価の前に、欠陥や異常のあるファイバーセグメントを特定して排除するためにも重要です。さらに、偏光顕微鏡は、より高いレベルのアライメントが通常、機械的特性の向上と関連しているため、ファイバー内の分子アライメントの程度を評価するために使用してもよい17,26,47。機械的特性評価は引張試験を通じて行われ、応力-ひずみ曲線が測定され、引張強度、伸張性、ヤング率、靭性などのパラメータを定量化するために利用され、構造または生物医学用途における繊維の適合性を評価するために不可欠な情報を提供します17,33,48.ここで取り上げる最後の技術であるフーリエ変換赤外(FTIR)分光顕微鏡法は、繊維の安定性と機械的強度に重要な役割を果たすため、タンパク質の二次構造、特にβシート形成の程度を調査するために適用されます17,46,49。これらの技術を組み合わせることで、組換えで製造された絹繊維の形態、構造、機械的挙動を包括的に理解できます。

プロトコル

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このプロトコルでは、出発点が凍結乾燥されたシルクプロテインパウダーであると仮定しています。これは、私たちの研究では最も典型的に組換えクモの糸タンパク質です。プロトコルの概要を 図1に示し、以下の5つのステップのそれぞれを以下に詳述します:(1)スピニングドープの調製と最適化。(2)絹繊維の手描きまたは湿紡績。(3)光学顕微鏡による繊維の直径と形態学的評価。(4)引張試験による機械的評価。(5)FTIR分光顕微鏡による二次構造評価。

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図1:組換えクモの糸タンパク質繊維の生産、収集、および特性評価のためのプロトコルの主要なステップの概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

1. スピニングドープの調製と最適化

注:繊維紡糸ドープ溶液を最適化するには、さまざまな濃度の組換えクモの糸タンパク質をさまざまな溶媒に可溶化して、ドープ溶液を調製してみてください(表1)。タンパク質を溶解し、沈殿物のない透明なドープ溶液を与える溶媒のみを繊維紡糸の試みに使用する必要があります。

  1. 溶媒の調製
    1. 8:1:1 TFA/TFE/H2O を作るには、800 μL の TFA、100 μL の TFE、および 100 μL のタイプ 1 超純水をヒュームフード内のガラス管に測定します。すべての成分を完全に混合します。ガラス管にキャップをかぶせ、パラフィルムで覆い、揮発性成分の蒸発を防ぎます。
      注:ファイバー紡績用の新しい溶液を常に準備してください。
      注意:TFAとTFEは腐食性が高く揮発性であり、TFEは可燃性と毒性があるため、取り扱いには注意してください。皮膚との接触や吸入の可能性を防ぐために、手袋、白衣、安全ゴーグルなどの適切な PPE を着用してください。
    2. 3:1:1 TFA/TFE/H2Oを作るには、ヒュームフード内で300 μLのTFA、100 μLのTFE、100 μLのタイプ1超純水をガラス管に移し、成分を混合します。ガラス管にキャップをかぶせ、パラフィルムで覆い、揮発性成分の蒸発を最小限に抑えます。
      注:ファイバー紡績用の新しい溶液を常に準備してください。
    3. 7:3 HFIP/H2O を作るには、700 μL の 1,1,1,3,3,3-ヘキサフルロロ-2-プロパノール (HFIP) を 300 μL のタイプ 1 超純水と混合して 1 mL の溶液を作ります。必要に応じて、溶液を新たに調製します。
      注意: HFIPはヒュームフード内で取り扱い、吸入や皮膚接触を避けてください。
    4. 50 mMのリン酸カリウム緩衝液(pH 7.5)を作るには、ビーカーに800 mLの脱イオン水を取り、1.199 gのリン酸二水素カリウム(KH2PO4-MW.136. 09 g/mol) と 7.173 g のリン酸二塩基性カリウム (K2HPO4- MW. 174.18 g/mol) が含まれています。すべての成分を完全に混合し、NaOHまたはHClを使用して溶液のpHを調整します。脱イオン水で容量を1 Lまで補充し、室温で保存します。
    5. 10 mM Tris-Cl緩衝液(pH 8.0)を作製するには、1.21 gのTris-塩酸塩(MW. 157.60 g/mol)を800 mLの脱イオン水に溶解します。NaOHを使用してpHを調整し、最終容量を脱イオン水で1 Lに補充します。溶液を室温で保管してください。
    6. 20 mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.0)を450 mLの脱イオン水に、0.55 gの酢酸ナトリウム(MW.82.03 g/mol)と0.02 M(6 mL)の酢酸を溶解します。脱イオン水で容量を500mLまで補充し、室温で保存します。
    7. 1 Mクエン酸リン酸緩衝液(pH 7.0)を作るには、11.69 gのリン酸水素二ナトリウム(Na2HPO4-MW. 141.96 g/mol)と1.85 gのクエン酸(MW. 192.12 g / mol)を400 mLの脱イオン水に溶解します。HClまたはNaOHを使用して溶液のpHを調整し、脱イオン水を使用して最終容量を500mLに調整します。
    8. 98%ギ酸-CaCl2 溶液を作るには、98mLのギ酸と2mLの脱イオン水を混合して、合計100mLの溶液にしてギ酸を98%に希釈します。次に、4 gのCaCl2 を100 mLの98%ギ酸溶液に加え、4%w / vギ酸-CaCl2 溶液を調製します。溶液を室温で保管してください。
      注: 表1を参照してください。タンパク質を溶解し、沈殿物のない透明なドープ溶液を与える溶媒のみを繊維紡糸の試みに使用する必要があります。
  2. 繊維紡糸ドープ溶液の調製
    1. 凍結乾燥したクモの糸タンパク質を所望の濃度(例えば、100 μLの溶媒中の10%(w/v)溶液で10 mg))に従って計量し、適切な量の溶媒(例えば、10%(w/v)濃度で100 μL)と混合します。
    2. プロテインパウダーが溶媒に完全に溶解するまで混合物を渦に巻き付けます。
    3. クモの糸タンパク質の溶解度は溶媒やタンパク質の種類によって異なるため、低タンパク質濃度(10%w/v)から始めて、必要に応じて徐々に濃度(25〜30%w/v)を上げていきます。
    4. タンパク質が完全に溶解した後、ドープ溶液の粘度を定性的に評価します。ドープ溶液の粘度が不十分であるように見える場合は、透明で粘性のある溶液が得られるまでタンパク質濃度を徐々に上げます。参照基準として水を使用してください。
溶媒タンパク質濃度(% - w / v)参考
8:1:1 TFA/TFE/H2O10 – 2519
3:1:1 TFA/TFE/H2O10 – 3026
7:3 HFIP/H2O15 – 3031
50 mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.5)10 – 2550
10 mM Tris-Clバッファー(pH 8.0)10 – 2034
20 mM 酢酸ナライナ酸緩衝液(pH 5.0)10 – 2549
1 M クエン酸リン酸緩衝液 (pH 7.0)10 – 2551
98% ギ酸 – CaCl220 – 2552

表1: 繊維紡糸ドープを調製するための推奨溶媒とタンパク質濃度。

2. 繊維の紡糸と回収

注:手描きの概略図については 図2 を参照し、以下に詳述するさまざまな湿式紡糸デバイス構成については 図3 を参照してください。

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図2:クモの糸繊維の手描き。(A) C字型の紙枠を用意し、スライドガラスに左側が透明テープ、右側が両面テープで取り付け、左から右に繊維を引っ張ることができます。 (B) 透明テープに紡糸ドープの滴を置き、プラスチックピペットチップを使用してC字型フレームの開口部を横切って両面テープに1本の繊維を手作業で描画します。 (C) 繊維はスライドガラスの紙枠に左右のテープで固定します。 (D、E) スピンドープに効果的に可溶化した組換えクモの糸の代表的な (D) 手描きプロセス、 および(E) テープで固定される前に得られた繊維のデモンストレーション。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:クモの糸繊維の湿式紡糸。 いずれの場合も、回転ドープはガラスの気密シリンジに入れられ、シリンジポンプを使用して金属製の鈍い端の針(すなわち、紡糸口金)を通して凝固浴(例えば、95%エタノール)に一定の速度で押し出されます。(A) 紡績された繊維はローラー 1 に集められ、コンピューター制御下で押出速度に一致する速度で回転します。(B)空気中でのスピン後の伸縮は、繊維をローラー1を横切って誘導し、ローラー1の速度の倍数で回転するローラー2に集めることによって達成されます(たとえば、2倍のドロー比の場合は速度の2倍)。同様に、繊維は、繊維をローラー1からローラー3に誘導することにより(例えば、所与の絹に適した40%エタノール、水など)に続いて、繊維をローラー2に誘導することにより(C)(ローラー1および3の速度の倍数で回転する)。または(D)繊維をローラー1からローラー3(溶媒浴に浸漬し、ローラー1と同じ速度で回転)に導き、次にローラー4(同じく溶媒に浸漬し、ローラー1と3の速度の倍数で回転)に誘導してから、ローラー2(ローラー4の速度と一致する速度)に回収します。モジュラー構成は、繊維紡糸条件におけるさまざまな順列を容易にテストできることを意味しますが、ここに模式的に示されている4つに限定されません。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 手描き
    1. 1 cm x 0.5 cm(長さ x 幅)の窓を持つC字型の紙フレームを用意し、スライドガラスの上に置きます(図2)。紙枠の上部をスライドガラスに粘着テープで固定します。紙枠の片方のアームに透明テープを貼り付けて、ドープ溶液を蒸着するための疎水性表面を作成し、反対側のアームに両面テープを貼り付けて繊維を固定します。
    2. 10〜20 μLの回転ドープ溶液を室温(22±2°C)で透明テープに堆積させます。
    3. 200 μLのプラスチックピペットチップをドープ溶液の液滴に沈め、一定の速度(~6 mm/s)で溶液から垂直に引き出し、溶液から繊維を引き抜くことができます。
    4. 手で引っ張ったファイバーをフレームウィンドウに導き、両面テープに貼り付けます。繊維を室温で自然乾燥させ、繊維の両端を追加のテープで固定します。
    5. その後の特性評価のために、紙フレームにまたがる繊維の部分に焦点を当てます。
  2. 湿式紡績
    1. 湿式紡績装置を構築し、ここに詳述する装置は、以前の反復31,38と比較してモーター制御機能が強化されています。
      1. 垂直に保持され、ステッピング モーターのセットを取り付けるために適切な構成で機械加工された剛性の高い金属取り付けプレートを製造します ( 図 3 を参照)。各モーター取り付けには、取り付けプレートの背面にステッピングモーターをしっかりとボルトで固定できるように穴を開け(つまり、適切な間隔とサイズの4つの穴)、およびモーターシャフトを通過させるための5番目の穴が必要です。
      2. ステップ1.8°、保持トルク45N・cm、長さ24mm、直径5mmのシャフト、長さ15mmの「D」カット、39mmのボディ、1.50Aの定格電流、2.3位相抵抗のバイポーラステッピングモータを選択してください。
      3. https://github.com/raineylab/MotorController.git で詳述されているように、いくつかのステッピングモータコントローラに接続されたRaspberry Pi用にPythonでコーディングされたグラフィカルユーザインタフェース(GUI)を採用する、さまざまな絹繊維タイプ17、53、54に以前に使用されたような、各モータの速度と回転方向を制御するシステムを開発します。
      4. 紡績の場合は、所定の紡績構成で使用される各モーターを機械加工された金属シリンダー( 図3の位置1および2にあるものは直径6 cm、長さ8 cm、両端の直径9 cmの溝付きローラーは、ローラーの中央で直径6 cmに先細りになっています。 図3の位置3と4の長さは7cmです。たとえば、設定例については、 図 4 を参照してください)。
      5. 紡糸口金(図3)には、制御された速度でスピンドープを凝固浴に押し出すシリンジポンプに取り付けられた鈍い端(内径0.127 mm)の金属針が恒久的に取り付けられた0.25 mLガラスシリンジを使用します。
    2. ドープ溶液を室温で20,000〜21,000 × g で30分間遠心分離し、繊維紡糸用の上清を回収します。
      注意: 湿式紡績中の押出針の目詰まりを防ぐために、残留微粒子を取り除きます。
    3. 紡糸口金として機能するシリンジに50〜80 μLの回転ドープ溶液をロードします。
    4. シリンジをシリンジポンプに固定し、押し出しを600 μL/hの速度に設定します。
      注:押出速度を調整および最適化して、特定のタンパク質紡糸ドープ条件で繊維形成を可能にします。
    5. 凝固浴(95%エタノール/5%脱イオン水、v / v)を準備します。
    6. ドープ溶液を含むシリンジの針が凝固槽に浸されるようにシリンジポンプを配置します。
    7. 回転装置にローラーを取り付け、モーター制御ソフトウェアを使用してローラー速度を調整し、特定の回転構成に必要なモーターをオンにします。
      注:ローラー1の回転速度を押し出し速度に合わせます。400 μL/hまたは600 μL/hの押出速度は、ローラー1の6 rpmまたは9 rpmに相当します。スピン後のドローが与えられている場合は、ローラー 2 から 4 の 1 つ以上がそれに応じて速く回転するように設定する必要があります。
    8. シリンジポンプを始動し、ピンセットを使用して、凝固浴内で形成される繊維を次のいずれかの方法で導きます。
      1. AS繊維を回収するには、凝固槽で形成された繊維を最初のローラー(押出速度に等しい速度)に導き、回収します。
      2. 空気中でスピン後ストレッチを行うには、ローラー2の回転速度をローラー1の回転速度の倍数に設定します。ローラー1の周りをループせずにローラー1の上で凝固から繊維を導き、ローラー2に集めます。
        注:スピン後の引き抜き比が2倍の場合、ローラー2の回転速度はローラー1の回転速度の2倍である必要があります。3倍、トリプル。などなど。
      3. 溶媒に浸漬した後にスピン後延伸を行うには、溶媒浴に所望の溶媒(例えば、脱イオン水、2:3 v/vエタノール/H2Oなど)を充填し、凝固浴から繊維をローラー1の周り(押出速度に一致する回転速度)、ローラー3の周り(ローラー1に等しい回転速度)を溶媒浴に導き、 そして、空気中のローラー2の繊維を収集します(ローラー1および3よりも速い速度で回転します)。
        注:ローラー1および3に対するローラー2の回転速度は、ステップ2.2.8.2のように、スピン後の引き抜き比を決定します。
      4. 溶媒中でスピン後延伸を行うには、溶媒浴に所望の溶媒(脱イオン水、2:3 v/vエタノール/H2Oなど)を充填し、凝固浴から溶媒浴内のローラー1(回転速度は押出速度に一致)、ローラー3(回転速度はローラー1に等しい)、ローラー4の周り(回転速度はローラー1と3の回転速度の倍数)を誘導して回収します空気中のローラー2上の繊維(ローラー2に一致する回転速度)。
        注:ローラー1および3の回転速度に対するローラー2および4の回転速度は、ステップ2.2.8.2のように、スピン後の引き抜き比を決定します。
        繊維の挙動に対する湿度と温度の影響を避けるために、制御された環境条件で繊維を収集します。相対湿度 ~ 28.2 ± 2.4%、温度 ~ 28.0 ± 2.2 °C を目標としています。

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図4:クモの糸繊維の湿式紡糸における主要なステップ。 (A)凝固浴へのドープ押出をスピンし、続いて繊維を収集します(左側の赤い長方形はドープ押出に使用される針を強調し、右側の赤い長方形は湿式紡績シルク繊維の経路です。(B) 空気中でスピン後伸びを受ける繊維の図 (目を導くための赤い長方形)。(C)水に浸した後の繊維のスピン後の伸びの図(目を導くための赤い長方形)。(D)ローラーに集められた連続組換え絹繊維(例えば、赤い矢印のスプール繊維)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. ファイバーの光学顕微鏡評価

  1. ファイバー実装
    1. 3 x 2 cmの長方形の紙から1 x 1 cmの正方形を切り取って、C字型のペーパーホルダーを作成します(図5)。
    2. C字型ホルダーをテープを使用してガラス顕微鏡スライドに取り付けます。
    3. C字型の紙ホルダーの1cmの隙間の両側に両面テープを2枚貼ります。
    4. 集めたローラーから繊維を取り除き、長さ約2cmのセグメントを切断します。
      注: 材料の変形やその他の特性の変化を防ぐために、繊維を取り扱うときは過度の力を加えないでください。
    5. ファイバーセグメントを両面テープの上部に置き、ファイバーの長軸がホルダーの下端に平行に揃わるようにします(図5)。
    6. 両面の両面テープの上にマスキングテープでファイバーを固定します。
    7. マスキングテープを追加で貼り付けて、ペーパーホルダーの底面をスライドガラスにしっかりと固定し、使用するまでファイバーが動かないようにします。
    8. 取り付けられたファイバーは、イメージングおよび引張試験に使用するまでスライド収納ボックスに保管してください。
  2. 直径の決定と欠陥の評価
    1. 光学顕微鏡を使用して取り付けられたファイバーを調べます。まず、繊維の全長をふるい分けて、ネッキング、ツイスト、膨らみ、二重繊維などの目に見える欠陥がないか確認します。欠陥が観察された場合は、それらのファイバーを機械的テストから除外します。
    2. 欠陥がないように見える繊維の場合は、繊維の長軸に沿って10倍の倍率で、繊維の中央に1枚、両端近くに1枚ずつ、顕微鏡写真を3枚撮影します。
    3. ImageJ55 ソフトウェアを使用してファイバー径を測定します。
      1. ImageJで、 分析メニュー に移動し、 スケールの設定 (補足ファイル1 - 補足図S1)を選択します。顕微鏡の校正設定に従って目盛りを調整し、測定単位をマイクロメートル(μm)に設定します(補足ファイル1-補足図S2)。
      2. ラインツールを使用して、ファイバーの一方の端からもう一方の端まで、ファイバーの長軸に垂直な直線を描画します。
      3. 各顕微鏡写真について、ファイバーに沿った6つの異なる領域でファイバーの直径を測定します。
      4. 各線を描画した後、[解析]メニューの[測定]をクリックして、繊維の直径を表示します(補足ファイル1 - 補足図S3)。
  3. 偏光顕微鏡による分子アライメントの定性的評価
    1. 偏光顕微鏡を使用して、光学顕微鏡による直径および欠陥評価後の繊維内の分子アライメントを評価します。
      1. 回転可能なステージ、固定アナライザースライダー、および90°回転可能な偏光子を備えた倒立光学顕微鏡を使用してファイバーを調べます。
      2. ファイバーを入射面偏光に対して約 45° に配置すると、複屈折による明るさが最大化され、分子構造の視認性が向上します。
      3. これらの条件下でファイバーの画像を撮影して、その複屈折を評価します。
        注:複屈折が高い場合は分子構造が整列していることを示唆し、複屈折が低いかない場合は、よりアモルファスまたはランダムに配向された構造を示唆しています。

figure-protocol-5
図5:クモの糸繊維をスライドガラスに取り付け、C字型のペーパーホルダーと一連のテープ層を使用して下流の分析を可能にします。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. 引張試験

注:絹繊維の正確な評価に適した引張試験装置は、比較的低コストで容易に製造できます25,56。簡単に言えば、テスト対象のC字型フレーム内の各ファイバーの両端をしっかりと把持できるように、一対のステンレス鋼クランプを製造します(例:図6)。これらのクランプの1つを分析天びんに置かれた重りに取り付け、もう1つをシリンジポンプに取り付けます。シリンジポンプは、設定されたひずみ速度で一定の引っ張りができるように構成する必要があります。分析天びんは、時間の関数として記録された重量/質量データを収集するために、コンピューターとインターフェースする必要があります。

figure-protocol-6
図6:引張試験の準備手順を示す概略図。 (A)ファイバー付きのペーパーホルダー(構成については 図5 を参照)をスライドガラスから取り外し、重りに取り付けられたクリップを使用して垂直に取り付けます。(B)この加重クランプを分析天びんに置き、ペーパーホルダーの上部をシリンジポンプにしっかりと固定されたロッドに取り付けられたクランプに固定します。引張試験を開始する前に、ペーパーホルダーを中央で水平に切断します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

  1. 応力-ひずみ曲線データ取得
    1. 繊維の直径を測定した後、自家製の装置で同じ繊維の引張試験を行います(図6)。
      1. スライドガラスからファイバーを保持しているC字型の紙フレームを取り外し、重りに取り付けられたクランプに固定します(図6A)。
      2. 分析天びんをデータロギング/制御ソフトウェアに接続し、 ワークベンチ に移動します(補足ファイル 1 - 補足図 S4)。
      3. 「 開始 」ボタンをクリックして、バランス制御ソフトウェアで実験を設定します。プロンプトが表示されたら、実験名を入力します(補足ファイル1-補足図S5)。
      4. 分析天びんが空であることを確認し、ファイバーの入った加重クランプをその上に置きます。
      5. ペーパーフレームの上部をシリンジポンプに接続されたクランプに取り付け、ペーパーホルダーの片側を切断して、ファイバーが自由に動くようにします(図6B)。
        注意: 両方のクランプが互いに平行であり、ファイバーが 10 mm のゲージ長でクランプ内の中央にあることを確認してください。
      6. 天びんの風袋引きをして、重りとクランプの質量をゼロにし、シリンジポンプの 実行 ボタンを押して、天びん制御ソフトウェアで OK をクリックします(補足ファイル1-補足図S6)。
      7. 繊維が切れたら、シリンジポンプの 停止 とバランス制御ソフトウェアの はい ボタン(補足ファイル1-補足図S7)を押して、測定された重量を時間の関数として記録します。
      8. スプレッドシートまたはその他の適切なデータ処理ソフトウェアパッケージにデータを転送して処理します。重量対時間データログをクリップボードにコピーし、提供された機械試験スプレッドシート(補足ファイル2)に貼り付けるか、データをテキストファイルとしてエクスポートし、適切な解析でインポートします。
  2. 応力-ひずみ曲線データ処理
    注:次のプロトコルは、Microsoft Excel(補足ファイル2)で使用するためにフォーマットされた機械試験スプレッドシートに基づいています。
    1. 実験パラメータが正しいことを確認します(C列)。
    2. 質量記録を時間の関数としてスプレッドシートに追加します( 列Fの「正味質量」)。ストレッチを開始する前に質量値が記録されている場合は、データを上向きにシフトして対応するセルを削除して、これらの値を削除します。ファイバーが破損した後に質量値が記録されている場合は、これらのデータ セルを削除します。
    3. インデックスの総数が列Fの測定質量値の総数と一致するように、1の増分を追加して列Eのインデックス値を自動入力します。
    4. 正味質量を再スケーリングして、これらが0 gから始まり、各正味質量値から初期正味質量を差し引き、この差に-1を掛けることにより、ストレッチ実験中に増加します(G列)。
    5. 測定指標にシリンジポンプの引っ張り速度と記録された質量測定値間のタイムラグを掛けて、各測定時の繊維長の変化を計算します(H列)。
    6. 繊維長の変化を元の長さで割って工学ひずみを計算します(列I)。
      注:この計算では、エンジニアリングひずみがmm/mmで表示されます。エンジニアリングひずみ値を % に変換するには、 列 I の値に 100% を掛けます。
    7. 伸張性を最大工学ひずみ値として記録します(セル T3)。
    8. 質量をgからkgに変換し、標準重力(9.81 m / s2; 列 J)。
    9. 特定の伸び度で決定された力を繊維断面積で割り、10〜6 を掛けてMPaに変換して、工学応力(Pa)を計算します(K列)。
    10. 観測された最大応力を極限応力(セル U3)として記録し、破断応力をファイバー破断前に記録された最終応力値として記録します(セル V3)。
    11. 台形法則を使用して靭性を得るために、応力-ひずみ曲線下の面積を計算し、各測定後に曲線下面積を計算します(列L)。これらの領域を合計して靭性を求めます(セルW3)。
    12. LINEST関数を使用して、応力-ひずみ曲線の初期線形領域の傾きを決定することにより、ヤング率(MPa)を計算します。103 (セル X3) を掛けて GPa に変換します。

5. フーリエ変換赤外(FTIR)分光顕微鏡

  1. 光学顕微鏡用に準備されたスライドの底に2枚目のスライドガラスをテープで貼り付けて、FTIR用のサンプルを準備します。
  2. 光学画像とFTIRスペクトル収集
    1. 検出器デュワーに液体窒素を充填して、検出器を冷却します。
    2. FTIR機器制御ソフトウェアを開きます。
    3. View and Collectウィンドウ(補足ファイル1 - 補足図S8)で、Collectionタブを開き、Collection ModeをATRに、DetectorをCooledに設定します(補足ファイル1 - 補足図S9)。
    4. スライドをスライドホルダーに置き、ホルダーをステージに置きます。
    5. 上部の照明を100に、絞りと下部の照明を0に設定します。
    6. ソフトウェアの物理ジョイスティックまたはデジタルジョイスティックを使用して、サンプルの光学顕微鏡画像の視野の中心をファイバーに焦点を合わせ、視野の中心と焦点面の位置を制御します。
    7. 収集モードをマップに設定します(補足ファイル1-補足図S8)。
    8. マップビュー - エリアツールを使用して、画像化および測定する領域を選択します。カーソルをクリックしてドラッグし、顕微鏡写真のプレビューでスペクトルを取得する領域を指定します(補足ファイル1 - 補足図S8)。画像上の各円は、その位置で取得した1つのスペクトルを表します。必要に応じて、特定のボックスのエッジの上にカーソルを置き、クリックして目的の位置にドラッグして、このボックスのエッジを変更します。四角形内をクリックしてドラッグして、ボックス全体を移動します。ボックスの面積と、ステージ、絞り、ディスプレイのデータポイントの数を変更します(補足ファイル1 - 補足図S10)。
    9. 顕微鏡写真のプレビューを右クリックし、モ ザイクのキャプチャ を選択して画像を保存します(補足ファイル1 - 補足図S8)。
    10. 現在の 圧力プロファイル ドロップダウンメニューをクリックして、ATR圧力を設定します。タンパク質繊維の場合、繊維への損傷を最小限に抑えるために、2%の圧力(つまり、可能な限り低いATR圧力)を使用します(補足ファイル1-補足図S8)。
    11. ATR FTIRチップを挿入します。
    12. [ 収集] ボタン(補足ファイル1 - 補足図S8)をクリックして、バックグラウンドスペクトルを取得し、次に選択した各ポイントのスペクトルを取得します。収集が完了すると、データは新しいウィンドウに表示されます。
  3. 下流分析のためのデータ準備
    1. ヒートマップまたは顕微鏡写真のいずれかを左クリックして、対応する位置で取得されたスペクトルを表示します(補足ファイル1-補足図S11)。
    2. 解析するスペクトルを右クリックし、コピー(補足ファイル1 - 補足図S11)を選択します。
    3. 画面上部のWindowsバーを右クリックし、[New Window](補足ファイル1 - 補足図S11)を選択します。
    4. 新しいウィンドウが開いたら、画面上部の [貼り付け] ボタンをクリックします(補足ファイル1-補足図S11)。
    5. 同じアプローチを使用して、分析に必要な他のスペクトルを コピー してこのウィンドウに 貼り付け ます。
    6. スペクトルまたはスペクトルを強調表示するには、Ctrlキーを押しながら各目的のスペクトル をクリック するか、ドロップダウンメニューで目的のスペクトルを強調表示します。
    7. [名前を付けて保存...]をクリックし、ファイルを.spaファイルとして保存して分光計制御ソフトウェアでデータを解析するか、.csvとして保存して別のソフトウェアパッケージでデータを解析します(補足ファイル1 - 補足図S12)。
  4. 機器固有のソフトウェアを使用した二次微分分析
    1. 分析するスペクトルを、機器固有のスペクトル処理および分析ソフトウェアパッケージで開きます。
    2. 透過率(%)モードと吸光度(Absorbance)モードを変換するには、 Ctrl+A (透過率から吸光度(Absorbance)へ)または Ctrl+T (吸光度から透過率(%)を使用します。
    3. [ 表示] |制限の表示 (または、 Ctrl+D) (補足ファイル 1 - 補足図 S13A)。アミドI(1,700-1,600 cm-1)およびアミドII(1,600-1,500 cm-1)バンドを表示するには、具体的には、 開始 X 軸と終了X軸の制限 を適切な波数に設定します。複数のスペクトルを解析する場合は、[ すべてのスペクトルに適用]を選択します。[ OK ]をクリックします(補足ファイル1 - 補足図S13B)。
    4. 2 次導関数をプロットするには、[プロセス] |派生語。。。 をクリックし、ドロップダウン メニューから [Second ] を選択します (補足ファイル 1 - 補足図 S14A)。セグメント長が5で、セグメント間のギャップが5のノリス導関数を選択します(補足ファイル1-補足図S14B)。二次微分スペクトルの最小値は、元の吸光度スペクトル内の成分ピークと一致します。
      1. スペクトルのノイズが大きすぎて最小値を評価できない場合は、[ プロセス]>[自動平滑 ]をクリックしてスペクトルを平滑化します(補足ファイル1 - 補足図S15)。次に、二次導関数を計算して最小値を見つけます。
    5. 参照表( 表2など)を使用して、二次導関数の最小値の波数を二次構造の特徴的なバンド位置に関連付け、タンパク質の二次構造についての洞察を得る。
  5. 機器固有の解析ソフトウェアを使用したピークデコンボリューション
    1. 手順5.4.3のように、表示領域をデコンボリューションする領域に設定します。この領域のみがデコンボリュートされます。
    2. ベースラインは、次のいずれかの方法を使用して、選択したスペクトル領域を補正します。
      1. [ プロセス] |自動ベースライン修正 (補足ファイル 1 - 補足図 S16);又は
      2. [ プロセス] |ベースラインの修正 (補足ファイル1 - 補足図S17A)を選択し、ドロップダウンメニューから 線形 を選択し、デコンボリューションの目的で補正する領域の下限と上限を指定する2つの点をクリックしてドラッグして、位置スペクトルでベースライン補正するスペクトル領域を指定します。次に、2番目のドロップダウンメニューで[ ウィンドウに追加] を選択し、[ 追加 ]ボタン(補足ファイル1-補足図S17B)をクリックします。
    3. ベースライン補正スペクトルを選択した状態で、[ 解析] |ピーク解像度... をクリックして[ピーク分解能]ウィンドウを開きます(補足ファイル1 - 補足図S18)。
    4. 画面左側の選択バーを使用して、解析するスペクトルと曲線を選択します。
    5. [ピークの検索]タブで[感度]を[低]に、FWHHを2に設定して[ガウス/ローレンツ]を選択し、[ピークの検索]ボタンをクリックします(補足ファイル1 - 補足図S19)。
    6. ピーク ボタンをクリックして 、ピークを説明するテーブルを開きます。
      1. 物理的に妥当な数よりも多くのピークが選択されている場合は、解析用の正しい数のピークが得られるまで、ピークの削除をクリックします(補足ファイル 1 - 補足図 S20)。たとえば、アミドI領域の場合、通常、5〜11のピークが文献で報告されています(表2)。
      2. フィッティング後にすべてのピークが正になるようにするには、[ ピークを編集] をクリックし、高さの最小値を0に設定します。次に、[ 次へ ]をクリックし、各ピークに対して繰り返し、続いて [OK ]を繰り返して編集ウィンドウを閉じます(補足ファイル1 - 補足図S21)。
      3. 最終的なデコンボリューションに存在する必要がある特定の波数がある場合は、[ピークの編集] をクリックし、[固定] を選択して [値] ボックスで指定された波数にピーク中心を固定するか、[下限] ボックスと [上限] ボックスを使用して範囲を指定します。[OK]をクリックして、これらの設定を指定されたピークに適用します。
        注:このステップでは、二次導関数分析中に見つかったピーク位置、またはFTIR二次構造の参照表からのピークを使用し、理想的には類似のシルクサンプルタイプに注釈を付けるのが最適です( 例:表2)。
    7. Fit Peaksボタンをクリックします(補足ファイル1 - 補足図S22)。
      1. ピークフィッティングアルゴリズムが正常に収束しない場合は、 ピークのフィット をもう一度クリックして、ピークのフィットを繰り返し続けます。
    8. ピーク...ボタンをクリックすると、位置、高さ、FWHH、および適合したすべてのピークの面積に関する情報が表示されます。
      1. これらのピークは、 クリップボード をクリックしてクリップボードにコピーし、別のウィンドウまたはファイルに貼り付けることができます(補足ファイル1-補足図S23)。
      2. [ 追加 ]ボタンの横にあるウィンドウ選択ドロップダウンメニューで保存先を選択して、ピークとスペクトルを別のウィンドウにコピーします(補足ファイル1 - 補足図S24)。
      3. [すべて選択] ボタンをクリックし、[ファイル] |名前を付けて保存:ピークとスペクトルを.spaファイルや.csvファイルとして保存します(補足ファイル1 - 補足図S25)。
    9. 参照テーブルを使用して、各成分ピークを二次構造に関連付けます。割り当てられたすべてのピークの総面積に対する特定の二次構造に対応するピークの相対面積は、その二次構造を持つタンパク質の割合を提供します。
  6. サードパーティ製ソフトウェアを使用した下流分析のためのデータ準備
    1. ワークブックを開き、 データ |ファイルに接続する |テキスト/CSV メニュー項目(補足ファイル1-補足図S26)。 ファイルエクスプローラー で目的のファイルを選択し、[ 開く]をクリックします。
    2. プロットする列を強調表示し、プロット |基本 2D |行メニュー 項目(補足ファイル1-補足図S27)。
    3. x軸をダブルクリックし、[スケール]タブを使用して、アミドIピークに収まるように範囲を調整します(補足ファイル1 - 補足図S28)。
    4. データのノイズが非常に多い場合は、 Analysis |信号処理>スムーズ>ダイアログを開く... メニュー項目(補足ファイル1-補足図S29A)。
      1. [ 再計算 ]オプションを[自動]に、[ 方法 ]を[Savitzky-Golay]に、[ ウィンドウの点 ]を[5]に、[ 境界条件] を[なし]、[ 多項式次数] を[2]に設定します(補足ファイル1 - 補足図S29B)。
      2. [ OK ] をクリックして処理します。
  7. サードパーティ製ソフトウェアを使用した二次微分分析
    1. [解析] |数学 |差別化 |ダイアログを開く... メニュー項目 (補足ファイル 1 - 補足図 S30)。
    2. [ 再計算 ]オプションを[自動]に設定し、[ 微分順序 ]を2に設定し、[ 微分曲線のプロット ]オプションを選択して、[ OK ]をクリックします(補足ファイル1 - 補足図S31)。
    3. 結果の二次微分曲線が非常にノイズが多い場合は、手順5.7.1に従います。5.7.2 では、[微分]ダイアログの[スムーズ]タブで[Savitzky-Golay Smooth]を選択します。
    4. 5.4.5と同様に、二次導関数の最小値の波数を二次構造に関連付けます。
  8. サードパーティ製ソフトウェアを使用したピークデコンボリューション
    1. アミドI吸光度スペクトルのプロットをクリックした後、 Analysis |ピークとベースライン |ピークアナライザー |ダイアログを開く... メニュー項目(補足ファイル1-補足図S32)。
    2. [ 目標 - ピークのあてはめ (Pro)] ダイアログ ボックスで、[ 再計算 ] オプションを [自動] に設定し、[ ピークのあてはめ] を選択して、[ 次へ] をクリックします。(補足ファイル1-補足図S33A)。
    3. [ ベースライン モード] ダイアログ ボックスで、[ ベースライン モード] パラメーターを [直線] に設定し、[ 次へ ] をクリックします (補足ファイル 1 - 補足図 S33B)。
    4. [ ベースライン処理 ]ダイアログボックスで、[ ベースラインの自動減算]を選択し、[ 今すぐ減算 ]ボタンをクリックして、[ 次へ ]をクリックします(補足ファイル1 - 補足図S33C)。
    5. ピーク の検索 ダイアログボックスで、 自動検索の有効化を 無効にし、 追加をクリックします。
      1. 適合するピークを含むスペクトルのプロットを含むウィンドウをダブルクリックします。
      2. 2次導関数(ステップ5.7.4)または参照表( 表2など)で観察された最小値に基づいてピークを選択します。
      3. [完了] をクリックし、[次へ] をクリックします (補足ファイル 1 - 補足図 S33D)。
    6. 「 ピークのフィット(Pro) 」ダイアログボックスで、「 現在のフィッティング結果からレポートを生成 」を選択し、「 フィット」をクリックします。その後に 終了 (補足ファイル1-補足図S33E)が続きます。
    7. ワークブックの PeakProperties1 タブを評価して、各ピークの中心、積分面積、およびFWHMを確認します(補足ファイル1 - 補足図S34)。ステップ5.5.9と同様に、各成分ピークを二次構造タイプに関連付け、その二次構造を持つタンパク質構造の割合を評価します。
波数範囲(cm-1)割り当て
1605年−1615年ティル側鎖/凝集β鎖
1616年−1621年凝集β鎖/分子内βシート [弱]
1622年−1627年分子間βシート [強力]
1628年−1637年分子内βシート [強力]
1638年−1646年ランダムコイル/延長チェーン
1647年−1655年ランダムコイル
1656年−1662年αヘリス
1663年−1696年ターン
1697-1703分子間βシート [弱]

表 2: Huらによるいくつかの研究の比較評価に基づく Bombyx mori 絹のアミドI領域振動帯の割り当て57。

結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

理想的なスピン可能なドープ溶液は、透明で沈殿物のない粘性のある溶液であり、タンパク質が完全に溶解していることを示します(図7A)。逆に、不完全な溶解は、乳白色の懸濁液または目に見える沈殿物のいずれかをもたらします(図7B、C)。タンパク質の完全溶解に必要な時間は溶媒の関数によって異なり、TFA/TFE/H2O混合物などの一部の溶媒は、通常30分の時間間隔でタンパク質を完全に溶解しますが、HFIPなどの他の溶媒は、時折ボルテックスするとともに一晩の撹拌を必要とする場合があります。

figure-results-1
図7:スピニングドープ溶液の最適化。 (A)タンパク質を完全に溶解できる溶媒は、透明で粘性のあるスピン可能なドープ溶液を提供します。最適でない溶媒の選択によるタンパク質の部分的な溶解または懸濁は、(B)通常は目に見える沈殿物を伴う過度に粘性のある状態、または(C)乳白色の懸濁液をもたらす可能性があります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2E は代表的な手描き繊維を示し、 図4D はスプールされた湿式紡績繊維を示しています。下流の分析に先立って、光学顕微鏡はファイバーの品質を評価するために不可欠です。下流の分析に適し、2つの異なる条件を使用して紡績された湿式紡績組換えシルク繊維の代表的な光学顕微鏡写真(サンプルの湿式紡績構成については 図3 を参照)を 図8に示します。光学顕微鏡(図8A)により、これらの繊維は均一な直径を示し、スピン後ドローを適用すると直径の減少が明らかであることは明らかです(すなわち、40%エタノール(4x-EtOH)中で4倍の比率で引き伸ばされた紡績時(AS)対後紡績)。偏光顕微鏡でより大きなコントラストをもたらす複屈折の程度が高いこと(図8B)は、スピン後のドロープロセスの結果としてファイバー内の分子整列が改善されたことと一致しています。最後に、評価されたファイバーの一部で欠陥が観察される可能性が高く、ファイバーの特定のセグメントが下流の分析に適さないことに注意する必要があります。そのような例を 2 つ図 9 に示します。

figure-results-2
図8:湿式紡績組換えクモの糸繊維の代表的な光学顕微鏡写真。 AS状態の繊維とエタノール(EtOH)の4倍のスピン後ストレッチに続く繊維は、光学顕微鏡(左の列)および偏光顕微鏡(右の列)によって観察されたキメラ梨状腺房状シルク構築物(Py2W2)について示されています。画像はGhimire et al.17の許可を得て転載しています。スケールバー = 30 μm。略語:AS =紡績時;EtOH = エタノール。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図9:光学顕微鏡を使用して観察可能な潜在的なファイバー欠陥の例。 (A)「膨らんだ」欠陥の例。(B)「ネッキング」欠陥の例。スケールバー = 20 μm この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

特定のファイバーセグメントに欠陥が存在しないことを確認し、直径の決定(プロトコルセクション3.2)に続いて、引張試験を実行できます( 例:図6)。さまざまな条件を使用して紡績されたキメラ組換えクモの糸について得られた代表的な応力-ひずみ曲線を 図10に示します。紡糸条件に応じて、得られる繊維は、脆い繊維(AS状態)から、AS状態と同様の強度を持つ高伸張性(2x空気状態)、はるかに強く伸縮性の低い繊維(4x-EtOH状態)までさまざまです。機械的挙動を明確かつ厳密に評価するには、複数の繊維セグメントと紡績繊維のバッチを評価する必要があることに注意してください。

figure-results-4
図10:さまざまな条件から紡績された繊維の代表的な応力-ひずみ曲線。繊維は、紡績状態 (AS) で、または自動スピン後延伸 (延伸比と延伸条件 (空気対溶剤) が示されている) を使用した製造を通じて分析されました。図はGhimire et al.(2024)17の許可を得て適応したものです。略語:AS =as-spun。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

最後に、繊維状態の二次構造は、ATR-FTIR分光顕微鏡を使用して評価できます。この方法論によって取得された典型的な絹繊維スペクトル(図11A、B)は、広いアミドAピーク(~3,300 cm-1を中心)、アミドIピーク(~1,600-1,700 cm-1)、およびアミドIIピーク(~1,500-1,600 cm-1)を含む特徴的なタンパク質バンドを持ちます。ここでは、アミドI領域の評価に焦点を当てます(例:図11C、D)。二次微分分析は、アミドIピークの主要成分を同定する手段として有用であり(図11E、F)、定量的ピークデコンボリューション(図11G-J)に信憑性を提供し、特定の条件下で紡績された絹繊維で観察された二次構造タイプの比率の評価と比較を可能にします。

figure-results-5
図11:FTIRスペクトルと二次構造分析。(A、B)(A)紡績時(AS)状態での湿式紡糸によって生成されたPy2W2繊維のFTIRスペクトル、および(B)エタノール中での4スピン後延伸を組み込んだもの。(C、D)FTIRスペクトルのアミドI領域は、それぞれAとBに示されています。(E-F)CとDにそれぞれ示されているアミドI領域の二次導関数で、示されたソフトウェアパッケージを使用して計算されます。(G-J)(G および I) OMNIC または (H および J) OriginPro ソフトウェアパッケージを使用してアミド I ピークデコンボリューションを実行し、パネル G と I は C と H および J から D に対応するデコンボリューションです。略語:FTIR =フーリエ変換赤外線;AS = スパン時。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

個々の技術を超えて、二次構造化、機械的性能、および(超)分子配向データの相関関係は、通常、得られた材料に対するさまざまな紡糸パラメータの影響の理解と、回転プロセスの合理的な最適化の両方に不可欠です。図 11に示すFTIRデコンボリューションでは、例えば、キメラシルクのASと4×-EtOH条件を比較すると、アミドIバンドへの実質的なβシート寄与は両方の条件で明らかですが、デコンボリューション方法に関係なく、AS状態と比較してスパン後延伸状態の二次構造全体の大きな割合を占めます(例えば、 図11G、H 対 図11I、J)。これは、4×-EtOH条件でAS状態よりも大幅に高い強度が観察されたこと(図10)と、AS状態に対する4×-EtOH条件での分子アライメントの改善(図9)の両方と一致しています。 図10に示す条件の範囲をカバーする詳細な特性評価と分析は、以前に報告されています17。したがって、ここでは分析全体を要約せず、代わりに、これら3つのクラスのデータが互いに補完的であり、単独で1つの技術よりもはるかに包括的なファイバー挙動の理解を発展させる方法のデモンストレーションとして、このペアワイズ比較を使用します。

補足ファイル1:繊維径測定、機械的データ処理、FTIRデータの取得と処理を描いた補足図S1-S34を含むファイル。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足ファイル 2: 質量と時間のデータから主要な機械的特性 (応力、ひずみ、ヤング率、靭性率) を決定できるスプレッドシート。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

組換えタンパク質の生産は、さまざまなフォーマットの材料を製造する刺激的な可能性を可能にし、最近の進歩は、これらのタンパク質ベースの材料がより広範な工業利用に近づいていることを意味します58。ここでは、組換え絹は天然の繊維状クモの糸に直接関係する組換え絹の形式であるため、組換え絹からの繊維生産に焦点を当てました。絹繊維は、天然のクモの糸の有名な機械的特性と、高性能繊維を持続的に生産する可能性があるため、多くの潜在的な用途があると宣伝されています32。提案されている用途は、高性能繊維からエネルギー吸収材料、パーソナルケア製品、ヘルスケア用途まで多岐にわたります58,59。ウェアラブル形式または導電性が強化されているその他の状況におけるクモの糸ベースのデバイスおよび材料も、生物医学およびより広範なアプリケーションの両方について活発に研究されています60。したがって、クモの糸ベースの材料の開発、最適化、カスタマイズに幅広い関心が寄せられています。このプロトコルでは、新しい組換えシルクタンパク質の調製に続く、または紡績可能であることがすでに確立されている組換えシルクの材料特性を調節するために、迅速な繊維生産を目的とした一連の手順の概要を概説します。

採用されているスピニング方法に関係なく、本明細書に詳述するように、溶媒/緩衝液条件およびタンパク質濃度のスクリーニングを通じて、スピンドープ生成を可能にする条件を決定することが重要です。最終的な目標は、タンパク質を十分に高い濃度で可溶化し、「生産的な」紡糸を妨げる凝集体やその他の不溶性種への経路外自己組織化なしに繊維への迅速な変換を可能にすることです。これは典型的には、透明で比較的粘性のある溶液であり、ミセル/ナノ粒子26,61および/または液液相分離62などの自己組織化種を含む可能性が高い。このプロトコルでは、さまざまなスピンドープおよびスピニング構成の反復評価を通じてファイバースピニングを成功させることができるため、スピンドープ状態を包括的に評価する方法については詳しく説明していません。スピンドープ状態に関する詳細な分子的および超分子的洞察は、粘度測定、光散乱、遠紫外円二色性分光法、核磁気共鳴分光法、および/または電子顕微鏡26などの技術によって達成され得る。また、組換えタンパク質自体は、スピニングのためのその挙動を強化するために修飾され得ることにも注意すべきであり、球状の非反復N末端およびC末端ドメインを含めることは、スピドロイン溶解度を高める方法の一例である32。つまり、適切なスピンドープの同定がなければ、紡績条件の比較試験に進むことは現実的ではありません。

1つまたは複数のスピンドープ条件が特定されると、手描きはシルクファイバーの特性を評価するための迅速なルートを提供します。生産的な手描きに必要なドープの量は大幅に少ないため、必要な純粋なタンパク質の質量ははるかに少なく、これは自動湿式紡糸アプローチの優れた前駆体となります。これはまた、異なるスピドロイン33の繊維特性を直接比較するための非常に扱いやすく簡単な方法を提供し、これもまた、繊維生産が少量のタンパク質で比較的簡単であるという利点がある。これは、湿式紡糸に必要なより高い収率を得るためのタンパク質発現と精製プロトコルの最適化を、最も有望なスピドロインに集中できることを意味します。もちろん、欠点は、手描きは長い連続繊維や合理化された方法で大量の繊維を生産できないことです。

十分なタンパク質が与えられた場合、湿式紡糸は、長くて連続した繊維の合理化された生産に利点をもたらします32。これだけでなく、繊維の特性は紡績プロセスを通じて容易に調整できます。たとえば、スピニングドープ条件を選択することで、繊維の力学を改善するための明確なルートが 1 つ提供されます。たとえば、~60 kDaの組換え腺房状絹タンパク質の場合、他のすべてのスピニングパラメータが一定に保たれて、あるスピンドープから別のスピンドープに変化すると、繊維の伸長性に劇的な変化が生じました26。これは、紡糸前に腺房状スピドロインがスピンドープで組み立てられる方法に関連しており、スピンドープ中の自己組織化ナノ粒子の均質性の改善は、繊維力学の改善と相関していました。スピン後のドローの組み込みは、ドロー比が特定の繊維タイプに対して最適化されなければならないことに注意し、また、典型的には、改善された分子整列と、例えば、繊維を強化するβシート微結晶への変換の強化の何らかの組み合わせを通じて、絹繊維の力学を改善する32。最後に、スピン後の引き抜き段階でさまざまな条件を使用することで、繊維の特性を調節する手段が提供されます。引抜の直前または引画中の溶媒曝露は、繊維の機械的および構造的特性17,38を大幅に変化させる可能性があり、異なるスピドロインは異なる溶媒の好みと許容範囲を持つことに注意します(例えば、組換え腺房状繊維は水適合性が高い26,31対組換え梨状繊維は水中で収縮します38キメラのピリフォーム-腺房状スピドロインの繊維は、質量でタンパク質の半分未満であるにもかかわらず、腺房状スピドロインの水適合性を示します17)。

記載されているプロトコルは、組換えクモの糸の紡糸性と繊維特性を評価および最適化するための高度にカスタマイズ可能で汎用性の高いアプローチを提供します。いずれの場合も、結果として得られる繊維特性を一貫して堅牢に分析し、比較する必要があります。ここでは、偏光顕微鏡、引張試験、FTIR分光顕微鏡などの光学顕微鏡を、この目的のための技術の「標準ツールキット」として使用することを提案します。得られた繊維の理解を広げるために、追加の生物物理学的および材料特性評価技術を適用できますが、この一連の技術は、形態、線維内アライメント/異方性、機械的性能、およびタンパク質の二次構造化の主要な特性の優れたカバレッジを提供します。特に、FTIR分光顕微鏡は、絹繊維の二次構造化を評価するための比較的簡単な手段を提供し、偏光顕微鏡は、達成された強化された分子アライメントの程度についての推論を可能にしますが、固体NMR分光法63,64、X線回折64、偏光ラマン分光顕微鏡65、および/または非線形光学顕微鏡54などの他の方法論シルク繊維内の結晶化度、整列、構造をより包括的に評価し、構造力学の関係を完全に解明するために検討する必要があります。他のタイプのタンパク質66に対する湿式紡糸の適合性を考えると、このプロトコルは組換えシルクを超えて一般的に適用できると予想されます。

開示事項

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Jan K. Rainey は、株式または株式および資金助成金を含む 3DBioFibR Inc. との関係を報告しています。他の著者には、宣言すべき利益相反はありません。

謝辞

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この研究への資金は、カナダ自然科学工学研究評議会 (NSERC) のディスカバリー助成金 (X-QL への RGPIN-2020-06083 および JKR への RGPIN-2023-05912)、国防総省/NSERC 補足 (JKR への DGDND-2023-05912)、3DBioFibR Inc との提携による NSERC アライアンス助成金 (JKR への ALLRP-578541-22)、および NSERC Research Tools and Instruments Grants によって提供されました。AG は、博士レベルのノバスコシア大学院奨学金 (NSGS-D) と、モリー アピール ドナーからの支援によって資金提供されたダルハウジー医学部 2024 年大学院学生シップの受給者です。HB は、NSERC が資金提供する Vanier Canada 大学院奨学金、Killam Predoctoral Scholarship (レベル 2)、および NSGS-D の受給者です。また、SE は NSERC 博士課程大学院奨学金 (PGS-D)、NSERC/国防省補足資金賞、およびウォルター C. サムナー記念フェローシップの受給者です。著者は、Sophie Haverstock と Emily Smith からの技術サポートに感謝しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1,1,1,3,3,3-ヘキサフルロプロパノール (HFIP)サーモフィッシャーサイエンティフィ445820500
アーチップセメント針付きドープ調製 1725LTSN シリンジに使用されます ハミルトン81100湿式紡糸に使用
2,2,2-トリフルオロエタノール (TFE)シグマ アルドリッチT63002-500Gドープ調製に使用
無水エタノールフィッシャー サイエンティフィBP28184凝固浴に使用 
酢酸フィッシャー サイエンティフィA38-212ドープ調製に使用
天びんメトラー トレド XS105デュアルレンジ引張試験装置
塩化カルシウム(CaCl2)Sigma-AldrichC-3881プ調製に使用
エン酸 ミリポア シグマ77-92-9ドープ調製に使用
コンピュータラズベリー パイラズベリー パイ 4 モデル B 湿式紡糸装置 - グラフィカルユーザーインターフェースを使用してステッピングモーターを制御する機能を提供します
リン酸水素二ナトリウム (Na2HPO4)Millipore Sigma7558-79-4ドープ調製ギ
酸に使用 フィッシャーサイエンティフィA118-500プ調製に使用
スライドガラス ミリポア シグマS8902-1PAK繊維実装に使用
塩酸 (HCl)EM サイエンスHX0603-53ドープ調製に使用
MCT-A 冷却検出器 Thermo Fisher Scientific840-199300繊維二次構造のFTIR評価
取り付けプレート社内で湿式紡糸装置
NEMA 17 バイオポーラステッピングモーターSTEPPERONLINE17HS15-1504S-X1湿式紡糸装置 - 注: スピン後の延伸を実行するには複数のモーターが必要
Nicolet iN10 FTIR 分光顕微鏡Thermo Fisher Scientific912A0604繊維二次構造の FTIR 評価
Nicolet iN10 マッピング ステージThermo Fisher Scientific840-198800繊維二次構造の FTIR 評価
Nicolet iN10 電動ステージ ジョイスティック サーモフィッシャーサイエンティフィ840-199800繊維二次構造の FTIR 評価
コレット スライドオン Ge マイクロチップ ATR 350サーモフィッシャーサイエンティフィ840-194800 繊維二次構造のFTIR評価
OMNIC Picta ver. 1.7.224Thermo Fisher ScientificINQSOF018FTIR装置制御ソフトウェア
OMNIC ver. 9.11.745Thermo Fisher ScientificINQSOF018FTIR装置固有のデータ処理および分析ソフトウェア
光学/偏光 顕微鏡Zeiss CanadaAxio Observer A1倒立光学顕微鏡
OriginPro 2025 10.2 SR1OriginLab CorporationOriginPro 10.200196サードパーティ製FTIRデータ処理および分析ソフトウェア
リン酸二水素カリウム(KH2PO4)Fisher ScientificP285-10ドープ調製に使用
リン酸二塩基性カリウム (K2HPO4)Fisher ScientificBP363-500ドープ調製に使用
電源ALITOVEALT-1205湿式紡績装置 - 12V 5A 電源アダプター コンバーター AC 100-240V 入力、5.5x2.5mm DC 出力ジャック付き - 注: 最適なパフォーマンスを得るには、モーターごとに個別の電源が必要な場合があります
酢酸ナトリウム シグマ・アルドリッチS2889-1KGドープ調製に使用
水酸化ナトリウム (NaOH)ミリポア シグマ1310-73-2ドープ調製に使用
ピニングローラー 社内で湿式紡績
ッピングモーターケーブルXMSJSIYB0BD5FV3R2湿式紡績装置 - ステッピングモーターコントローラーからステッピングモーターへの接続を提供
ステッピングモーターコントローラー(Pi HAT)AdafruitDC &ラズベリーパイ用ステッピングモーターHAT式紡績装置 モーターコントローラー順列 1 - 注 ~46 rpmの制限モーター回転速度
ッピングモーターコントローラー(USB)PoluluTic T249湿式紡績装置 モーターコントローラー順列 2 - 46 rpm を超える回転が必要な場合に使用
シリンジポンプKD ScientificModel 100引張試験装置および湿式紡糸装置
トリフルオロ酢酸 (TFA)ミリポア シグマTX1276-7ドープ調製に使用
トリス塩酸塩 EMD Millipore9310-500GMドープ調製に使用
USB ハブAcasisB07Q3TYF15 湿式スピニングデバイス - 48W電源付きUSBハブ - ACASIS 10ポート USB 3.0データハブ - 個別のオン/オフスイッチと12V/4A電源アダプタ付き USBスプリッタ - Raspberry PiとTic T249ステッピングモータコントローラ間のインターフェース
ック ルック ック 分析ドークックドー製造されたック ニック ス製造 ステに使用 湿 ステ

参考文献

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Formal Correction: Erratum: Optimizing and Evaluating Hand-drawing and Wet-spinning for Recombinant Spider Silk Fiber Production
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