マウス坐骨神経切断/縫合術による神経修復と機能回復の研究

Summary

本プロトコルは、マウスを用いた坐骨神経切断および縫合モデルを用いて、成体の背根神経節ニューロンを用いて末梢神経再生を研究することを目的としています。神経損傷後の軸索再生、筋肉の再神経支配、機能回復の 生体内 解析を可能にします。

Abstract

神経修復は軸索損傷後の機能回復に不可欠です。しかし、中枢神経系(CNS)の成熟したニューロンは、内在的な成長能力の低下と過酷な環境により、損傷後に軸索の再生能力が限られています。対照的に、末梢神経系(PNS)のニューロンは強力な再生能力を示します。その中でも、成人の背根神経節(DRG)ニューロンは末梢神経損傷後に効果的に再生する能力で特に知られており、神経修復の細胞および分子メカニズムを研究する理想的なモデルとなっています。ここでは、「ループ前切断」と呼ばれる改良型微細縫合技術を説明し、マウスの坐骨神経切断および縫合モデルを作成し、その後軸索再生の解析を行います。行動評価や筋肉再神経化も機能回復の評価に役立っています。坐骨神経切断および縫合後、動物は最初行動障害を示しますが、通常は損傷から30日以内に完全な回復が見られます。損傷部位に軸索融合を促進する薬剤を投与することで、機能回復が大幅に加速します。このモデルシステムは、哺乳類の神経修復を支配するメカニズムを生 体内で調べる強力なツールを提供します。

Introduction

軸索損傷は脳および脊髄損傷の一般的かつ重篤な結果であり、しばしば外傷、神経毒素、または神経結合を妨げ軸索再生を妨げる神経学的障害によって引き起こされます^1,2。すべてのニューロンが再生能力を本質的に持っているわけではなく、切断された軸索の修復には不可欠です。軸索再生速度は、ニューロンの内在成長ポテンシャル、タンパク質合成効率、細胞骨格の動態、ミエリン残骸の除去、^{成長因子の}利用可能性など複数の要因によって影響されます^3,4。

成体の哺乳類の中枢神経系(CNS)では、軸索損傷により再生能力が低下し、主に成長促進因子の欠如と抑制性の外因性手がかりの存在が原因となります^1,5。対照的に、末梢神経系(PNS)の軸索は、末梢神経の内在的な自己修復機構と再生促進的成長プログラムの急速な再活性化により、損傷後も強固な再生能力を持っています。損傷後、軸索の遠位節は神経体質から切り離され、軸索の崩壊と断片化を特徴とするウォーラー変性を経験します ^6,7。グリア細胞による軸索およびミエリンの破片の効率的な除去は、軸索成長を妨げる瘢痕の形成を防ぐため、再生成功に不可欠です^3,8。この過程は、損傷した軸索の細胞骨格再構築と相まって、近位切断部の再生を支援し、標的神経支配を促進します。これらのイベントは部分的に重なる段階で起こり、ATF3やc-Junなどの転写因子の損傷による活性化が再生促進遺伝子発^{現プログラムを促進します。}

再生軸索融合は、軸索損傷後の神経結合を回復させる効率的なメカニズム^です。この過程は1967年にザリガニ(Procambarus clarkii)で初めて記載^{され、その後}Caenorhabditis elegans¹⁷を含む複数の種^{13、14、15、16}で記録されています。哺乳類における軸索融合の直接的な証拠は限られていますが、融合誘導戦略は神経修復の促進に成功裏に用いられています¹¹。特に、フューソーゲンポリエチレングリコール(PEG)という化学物質は膜の再封閉を促進し、哺乳類モデル18,19,20,21,22,23,24において末梢神経および脊髄損傷後の機能回復を促進することが示されています。最近の研究では、グルタチオンペルオキシダーゼ(GPX)の枯渇がC. elegans²⁵における軸索融合を促進するのに十分であることが示されています。同様に、Gpx4条件付きノックアウトマウスやGPX阻害剤ML162で処理されたマウスは、坐骨神経切断後に機能回復が加速し、軸索融合の強化による^{可能性があります。}

坐骨神経は感覚神経、体性運動神経、自律神経運動軸索から成る混合神経^です。ラットではL4およびL5の脊髄節から、マウスではL3およびL4節から発生^します。そのアクセスの容易さと解剖学的な一貫性から、坐骨神経損傷は末梢神経再生の研究に広く使われるモデルの一つとなっています^29,30。これらのモデルは、軸索の成長や機能回復に影響を与える内在的な神経機構と外在的な環境要因の両方を調査することを可能にします ^3,4,9。神経科学における坐骨神経圧潰の実験的パラダイムとして用いられたのは19世紀後半にさかのぼ^ります。神経圧迫モデルに加え、神経切断は軸索再生や機能回復の研究にも広く用いられています。しかし、マウスにおける古典的な坐骨神経切断の後に縫合を行う方法は、神経の小ささと脆弱な組織のため、ラットに比べて再現性や信頼性が低いことが多い³¹。

「ループ・ビフォア・トランセクション」と呼ばれる修正された坐骨神経切断および縫合モデルを用いて、再現可能な坐骨神経切断および縫合モデルを成功裏に生成しました²⁵。この方法は、切断前に縫合糸を挿入し、切断後の神経操作を不要にし、機械的ストレスを軽減し、手術技術による変動を最小限に抑えます。中等度のGPX調節は、マウス坐骨神経の完全切断後の機能回復に寄与することが示^{されました。}坐骨神経切断(SNT)/縫合病変に対する低濃度ML162(0.25μM)³²、GPX阻害剤およびポリエチレングリコール(PEG、500 mM)18,19,20,21,22,23,24の共同治療により、針穴検査、足の欠陥非対称性、足の開きテスト^25,33で評価された行動スコアが成功裏に向上^{しました。34}. 哺乳類背根神経節(DRG)ニューロンの切断された遠位軸索断片は3日以内に退化し、神経筋接合部(NMJ^)6,35が破壊され、再生型DRGニューロンが筋肉を再神経支配して機能を回復させます。SNT/resuture-ML162/PEG共治療群は、術後3日の早期時点で神経支配NMJと行動スコアの改善を示し、神経筋機能の早期回復を示しました^。

ここでは、上記のマウス観察を可能にした「ループ・フォアトランセクチャー」の顕微縫合法と薬物投与について説明します。切断されたラットの神経を迅速に修復できる既存のPEG融合プロトコル^{が修正されました}。ポリエチレングリコール(PEG)は、in vitro 36でカットザリガニ内側巨大軸索(MGA)の外因性再接続を促進すると最初に報告されました。PEG融合プロトコルは、ラット坐骨神経の圧迫切断損傷を含む試験の25%〜30%で行動転帰を改善しましたが、初期時点³⁴では機能回復は認められませんでした。その後の改良では、内因性膜シーリングの概念が取り入れられ^ました。神経損傷後、急速な形漿類修復は神経保護効果があり、神経変性を防ぎます。^Ca2+による膜結合小胞の蓄積がこの^{密封プロセスを促進}します。完全な神経切断は、病変部位の腋窩および内側、会尿、外膜の被膜を破壊します。外皮球鞘の微小縫合により、近位神経断肢と遠位神経断端が整列します。縫合段階では、Ca2⁺フリー低張性生理食塩水の使用により膜に縛られた小胞の形成が減少し、内側および会周の鞘が開いたまま、外膜縫合によって近似されることが可能になります。その後、^Ca2+を含む生理食塩水の投与により、残存する形質体破壊を封じ込める小胞の蓄積が誘導されます^。

このプロトコルでは、成体のFVBマウス(8〜10週齢)とC57BL/6マウスを用い、株特異的な差は認められませんでした。マウスの坐骨神経は大腿筋の中央あたり、約1〜2mm下にあり、ラットよりも明らかに細く脆弱であるため、解剖や縫合時により高い手術精度が必要です。神経の過剰伸展や過度な操作は機能回復を妨げる可能性があるため、注意が必要です。この方法は神経を完全に切断し、近位切断と遠位切断の間に物理的な隙間を作る方法です。この隙間は軸索の直接的な再生を妨げるため、回復成功には通常、顕微外科的介入や神経移植が必要です。

マウスの坐骨神経はラットよりも細く繊細であるため、より高い手術の精度が求められます。マイクロ縫合は一般的に使われますが、過度な操作や繰り返しの^針の通過により、意図せずに追加の外傷を引き起こすことがあります。これらの制限はばらつきを生み、新しい治療戦略の評価を混乱させる可能性があります。したがって、縫合による神経損傷を最小限に抑えつつ、一貫した手術結果を達成することは、神経切断モデルにおける機能回復を確実に評価するために不可欠です。この「ループ・フォアトランセクチャー」法を用いて、再現可能な坐骨神経切断および縫合モデルが作成され、PEGおよびML162の二重治療が機能回復に与える効果が評価されました。全体として、マウスの坐骨神経切断モデルは広く使われているにもかかわらず、神経の小さと脆弱性のため技術的な課題を抱えています。ここで述べるこの修正された縫合法は、機械的損傷を最小限に抑える再現可能で標準化された顕微外科プロトコルの重要性に応えています。

Protocol

すべての動物処置は、テキサス大学サンアントニオ校健康科学センターの施設動物ケア・使用委員会(IACUC)のガイドラインに従って実施されました(プロトコル番号:20200082AR)。ここで述べたJoVE実験手順には成体のオスと雌のFVBマウス(生後8〜10週、体重20〜25g)が使用されました。C57BL/6マウス(生後8〜10週、体重20〜25g)は、取り扱いと縫合の精度を最適化するために、正式な実験前に行われた予備的な手術にのみ使用されました。これらの練習セッションでは、「ループ・フォアトランセクチャー」手法が両株で同等の結果が得られることが確認されました。したがって、本稿で提示されたすべての正式データはFVBマウスから取得されました。坐骨神経切断のために合計10匹のFVBマウス(オス5匹、メス5匹)を当初含め、その後ML162+PEG治療を行いました。1匹の動物は先天的な解剖学的変異を示し、坐骨神経が切断部位の前に2つの主要な枝に分岐し、手術が不完全で解析から除外されました。したがって、行動および組織学的分析は9頭の動物(n = 9)で行われました。男女ともに再生および行動回復が同等であり、性別特異的な差異は観察されませんでした。さらに、神経切断なしの二重縫合(偽対照)マウスが、縫合手術自体が行動結果に与える潜在的影響を評価するために実施されました。生殖反応に目立った差は性別間で観察されませんでした。動物は標準的な環境で12時間の明暗サイクル、75°F、相対湿度40%〜60%で飼育され、自由に食料と水を得られました。オスとメスのマウスの両方を使用し、オスとメスの動物間で目立った違いは観察されませんでした。手術はSomnoSuite低流量麻酔システムのイソフルラン麻酔下で実施されました。行動検査は術後2日目から開始され、対応する図の通り4日目、7日目、10日目、14日目、18日目、22日目、27日目に繰り返し実施されました。試薬および使用機器は 材料表に記載されています。

1. 坐骨神経切断/縫合および薬物治療

1. 動物を加熱したパッドに置き、坐骨神経を立体解剖顕微鏡で観察できるようにします(図1A)。
2. SomnoSuiteの低流量麻酔システムを用いてマウスを麻酔します。
   注意:手術開始前に、足の指の挟みに対する反射反応などの反射反応がないことで麻酔の深さを確認してください。角膜乾燥を防ぐために、獣医の眼科軟膏を目に塗布してください。
3. 太ももや周りの毛を剃りましょう。
   注意:剃った毛や落ちた毛はできるだけきれいに取り除いてください。そうしないと、毛が10-0ナイロン縫合糸にくっついて坐骨神経を汚染してしまいます。残留毛は、剃毛後に実験用テープやスコッチテープで優しく除去することで、手術部位を清潔に保つことができます。手術部位は70%エタノール、ベタジンで順次拭き、最後に70%エタノールでオートクレーブした綿球で拭き取り、手術部位を消毒します。
4. 大腿骨を見つけ、細い外科用ハサミを使って大腿骨の後方約1~1mmの位置、太ももの中間に約1.0cm(範囲0.8〜1.2cm)の小さな皮膚切開を行います。
   1. 大臀筋を優しく引き戻し、下の大腿二頭筋を露出させます。次に、ハサミの先端を使って大腿二頭筋の前後頭を切らずに優しく切り離し、坐骨神経切痕の下にある坐骨神経を露出させます。これらの工程は顕微鏡ではなく、直接の目視観察のもとで行われます。
5. 微小解離鉗子を使って坐骨神経を体外に引き抜き、坐骨神経の手術を容易にします(図1A)。
   注意:坐骨神経への損傷を最小限に抑えるため、鉗子は一定のレベル以上に広がらないようにテープで固定してください。鉗子の先端を坐骨神経の下に置き、マウスの太ももを支点として坐骨神経を上方に持ち上げます。縫合を容易にするために必要なだけ神経を持ち上げ、過度の伸びは軸索や周囲の構造物を傷つける可能性があるため、緊張や外側に引っ張りすぎないように注意してください。
6. 露出した坐骨神経に顕微鏡を合わせてください。このステップから顕微鏡を使ってステップ15を進みます(図1A)。
7. 10-0ナイロン縫合糸で坐骨神経を2倍貫通します(図1B,C)。未割りコントロールはステップ1から8まで進みましょう。神経切断のステップ1から11へ進みましょう。
   注:2つの貫通は約1神経幅(~0.7 mm)の間隔で行われ、切断部位の両側に対称に配置されました。この間隔により、近位および遠位切断部の適切な位置合わせが確保されつつ、病変部の機械的応力を最小限に抑えました。縫合糸で坐骨神経の中心を貫通し、2つの貫通点が正確に平行になるようにします。10-0の縫合糸は小さく、非常に細いピンセットでコントロールする必要があります。非吸収性の10-0ナイロンが使用されたのは、優れた引張安定性と30日間の観察期間中の組織反応性が最小限に抑えられるためです。この材料はマウスやラットの顕微神経修復モデルで広く使用されています^18,31。吸収性縫合糸は、機能回復が完了する前に切断された神経切断部の整列を妨げる可能性があるため、使用されませんでした。手術者による変動を最小限に抑えるため、すべての手術は、立体顕微鏡下での広範な顕微鏡下での訓練を受けた単一の外科医によって行われました。「ループ・フォアトランセクション」法自体が、切断後の神経操作を不要にし、動物間の一貫したアライメントと張力を確保することで、さらに変動を減らします。これにはかなりの練習と高度なコントロール技術が必要です。動物手術を行う前に、初心者はデンタルフロスなどの細かい合成糸を使って縫合動作を練習し、立体顕微鏡の下で器用さとコントロールを身につけることが役立つかもしれません。
8. ナイロン縫い糸で慎重に結び目を作ってください。
9. 露出した坐骨神経を筋肉層の下に置き、4-0ナイロン縫合糸で皮膚を閉じます。
10. 10-0ナイロン縫合による坐骨神経の二重貫通がマウスの行動に影響を与えないことを確認しましょう。
    注:これを確認するために、切断なしで二重縫合貫通を受けたマウスには、実験群で使用されたのと同じ行動テスト、例えば針穴、足の欠陥の非対称性、足の指の広がりなどが行われました。これらのマウスは一貫して未手術の野生型対照群に匹敵する満点を獲得しており、縫合術だけで坐骨神経機能が損なわれなかったことを示しました。
11. 2本の10-0ナイロン縫合糸の中間で坐骨神経をメスで切断します(図1D)。
    注:ばらつきを最小限に抑えるため、すべての手術は同じ訓練を受けた実験者によって標準化された手順で実施されました。さらに、「ループ・フォア・トランセクション」設計は、切断後の神経処理を避け、すべての動物で一貫した縫合位置と張力を確保することで、変動を最小限に抑えます。縫合線の位置は解剖顕微鏡で確認され、動物間で均一性を確保しました。
12. 鉗子をしまって。
13. 切断神経を、塩化カルシウム不使用で調製した^Ca2+フリーリン酸緩衝生食塩水(PBS;137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄、pH 7.4)で洗浄します。
    注意:切断された神経切断部はカルシウムフリーPBSで約10〜20秒間すすいで血液をきれいにし、早期の閉鎖を防ぎます。縫合は、アライメントと組織の生存性を維持するために、1〜2分以内に迅速に完了させるべきです。
14. Ca²⁺フリーPBSは組織で吸収して除去します。
15. ナイロン縫合糸で慎重に結び目を結びます(図1E)。薬物治療が予定されていない、または必要でない場合はステップ20に進みます。
    注:マイクロ縫合には標準的な四角結びが使われており、2つの反対側のスローを細かい鉗子で優しく締めて立体顕微鏡で照らしました。縫合糸でつながれた2つの切断された軸索は元の形状に近い形に戻ります。切断された血管の再接続は、近位神経切断部と遠位神経切断部が正しく整列していることを示す視覚的な指標となります。処置中は組織が青白さや圧迫感がなく、新鮮で湿った状態に見えるべきです。縫合糸をきつく結びすぎないようにしてください。血管が虚脱したり神経が変形したりする恐れがあります。最終結び目を結ぶ前に、神経末端が緊張なく近似されていることを確認してください。必要に応じて、神経を引っ張るのではなく、自然な位置を整えるために四肢を優しく位置を変えてください。過度の緊張は神経腫や線維化のリスクを高める可能性があります。
16. PBSで希釈したDMSO中のML162 0.25 μMを注射器を使って縫合した坐骨神経に置きます。縫合された坐骨神経を薬に1分間浸します。
17. ML162は滅菌綿棒で吸収して取り除きます。
18. PEG500 mMを蒸留水に、37°Cまで予温したものを注射器で縫合した坐骨神経に浸します。縫合された坐骨神経を薬に1分間浸します。
    注意:500 mMのPEGは高密度溶液であり、操作室温で固体化する可能性があります。PEGが液体のままであることを確認するため、操作中は加熱パッドの上に注射器を置きます。PEGは、隣接する脂質二重層間の水分子を除去することで膜融合を促進すると考えられており、これにより膜の密接接触や自然な融合が可能になります。正確な分子メカニズムはまだ研究中ですが、このアプローチは末梢神経損傷モデルにおける軸索の連続性を促進し、機能回復を促進することが示されています。
19. PEGは組織で吸収して除去します。
20. Ca2⁺を含むPBS(PBSに1 mM CaCl₂、137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mMリン酸バッファー、pH7.4を補足)で縫合した神経を洗浄します。
21. ^Ca-2+を含むPBSを組織で吸収して除去します。
22. 露出した坐骨神経を筋肉層の下に置き、4-0ナイロン縫合糸で皮膚を閉じます。
23. 動物が麻酔から回復したら、ケージに戻します。
    注:皮膚閉合後、手術部位には鎮痛剤を含む局所抗生物質軟膏が施されました。各動物は、胸骨横たわりを維持できるほど意識を取り戻すまで、温熱パッドで監視されました。その後、動物は個別に飼育され、運動機能が完全に回復した後にのみグループに戻されました。手術環境はラミナーフローフードの下で維持されませんでしたが、すべての手術器具は滅菌され、手袋をはめた手と滅菌器具を用いた無菌技術で処置が行われました。

2. 行動テスト - ピンプリック

注:損傷後の高い閾値の機械的感受性反応を評価するため³³.

1. ネズミをワイヤーメッシュのグリッドに入れて、30分間自由に動き回らせて新しい環境に慣れさせてください。
2. 後足の足底面の最も外側の部分は5つの領域(AからE)に分けられていました。同側の足の足底面に優しくAusterlitz(サイズ000)を塗布します。ピンプスは最も外側のつま先(A部)からかかと(E部)まで2回刺されました。
   注意:皮膚を貫通しないでください。
   注:動物が2つの針点刺激から素早く前足を離したとき、反応は陽性とみなされました。このエリアではマウスが1評価され、次のエリア(最大5)でテストされました。いずれも肯定的な反応がなければ、総合成績は0となりました。同じ同側の大合在領域を陽性対照として使用してください。必ず前向きな反応を引き出します。

3. 行動テスト - フットフォルト(FF)の非対称性

注:坐骨神経軸索がより近位筋にどれだけ神経支配するかを測定するために³⁴。

1. ケージの上に設置されたワイヤーメッシュのグリッド上で動物たちを自由に歩き回らせ、環境に慣れさせてください。1つの試験は後肢あたり合計50歩で構成されます。
2. 動物がミスをしたときに得点を挙げます。得点基準は以下の通りです。
   スコア1: 部分的な過失です。脚が完全に太ももまで外れる前に引き戻した。
   スコア2: 全ての過失です。股間まで完全に落ちてしまいました。
3. 各術後時刻におけるすべての動物の負傷および未負傷の後肢の複合足の欠陥スコアを計算します。
   複合足の故障スコア = (# 部分故障 x 1) + (# 完全な故障 × 2)
4. 複合足の骨折スコアを50(総歩数/四肢)で割ると、各後肢の骨折率が得られます。
   % フットフォルト = 複合フットフォルトスコア/50(総ステップ数)×100%
5. 損傷した後肢の足の欠陥を、完全な後肢の足の欠陥の割合から差し引き、術後時刻における各動物の非対称スコアを算出します。
   足の過失(FF)非対称スコア = %FF(無傷の四肢)- %FF(負傷した四肢)

4. 行動テスト - 足の指を広げる

注意:神経損傷後の運動回復を評価するためです。以前の研究によると、足の指拡大運動テストは、坐骨神経損傷後の運動機能回復を検出するために歩行分析よりも感度^{が高いとされています}。

1. 布で優しく動物を覆い、尾を持ち上げて後ろ足をはっきり観察します。
   注意:代替案:ネズミの首筋を優しく掴み、尾を固定し、ひっくり返してネズミをもぞもぞさせてつま先の動きを観察します。
2. つま先広げのスコアは以下の通りに与えられます:
   スコア2: 全開。すべての指が少なくとも2秒間、完全に広がり、広がり、持続的に広がることと定義します。
   スコア1: 中間の拡散。満得点に達しない動き。少し震えたり、部分的に動いたりする。
   スコア0:スプレッドなし。全く動きません。
   注:すべての行動評価(針穴、足の骨折、足の指の広がり)は、治療群を盲検した実験者によって再確認されました。動物は、前回の研究(Koら²⁵)で用いられたデザインに従い、手術時に無作為に治療群に割り当てられました。この研究には4つの実験的条件(縫合のみ、PEG、ML162、ML162+PEG)が含まれていました。本記事では、ML162 + PEGグループのデータを、元の実験的厳密さを維持しつつ独立解析したものを紹介しています。

5. 組織学のための組織灌流および処理

1. 動物を深く麻酔し、左心室 から リン酸塩緩衝生理食塩水(PBS)を用いた心腔灌流を行います。
2. 右心房を切開して完全な血液排出を可能にします。
3. 採取した組織を4%パラホルマルデヒド(PFA)に4°Cで一晩浸し、固定します。
4. 固定組織をPBSで3回洗い、その後4°CでPBSで一晩培養します。
5. 組織を30%ショ糖に4°Cで一晩浸してクライオプロテクトします。
6. 組織をOCT化合物に埋め込み、凍結し、クライオスタットで厚さ12μmで切片します。
7. 組織ブロックは-80°Cで保存し、クライオセクションは-20°Cで使用まで保存してください。
8. 坐骨神経収集のみの場合、血液中濃度がこれらの末梢組織の免疫染色質に有意な影響を与えないため、灌流は省略します。

Results

以前のPEG固定プロトコル¹⁸は、一貫した手術結果を維持し、²⁵の縫合による神経損傷を最小限に抑えるよう修正されました。切断前に神経を貫通させるために縫合糸を置くことで、切断後にピンセットでつまんだり針で刺したりすることで引き起こす損傷を最小限に抑えられました。神経を貫通する縫合糸の結び目がその機能に与える影響を検証するため、縫合糸を無傷の神経に2回通し結び目をつけました(図2A、SNTなしの縫合糸)。神経を貫通した縫合糸は、術後30日で神経に瘢痕を残さなかったことが観察されました(図2A、SNTなしの縫合)。SNTなしの縫合のみを受けたマウスは、すべての行動検査で完璧なスコアを得ており、縫合による神経貫通が神経機能に影響を与えないことを示しました(図3B、...

Discussion

神経切断モデルを用いた神経再生研究はマウスの坐骨神経に対して広く行われています^31,39。しかし、マウスの坐骨神経は小さいサイズで柔らかい質感のため、手術器具で優しく扱うのが難しく、縫合時に組織が裂けやすいです。過度な操作を伴う微細縫合の過程は、神経変形や外傷を引き起こすことがあります。不要な器具刺激を最小限に抑えても、縫合された神経の過度な動きは依然としてずれを引き起こし、初期の機能回復を妨げる可能性があります。これらの変数は切断モデルにおける実験結果の一貫性と信頼性を損なっており、再現性を確保し神経損傷を最小限に抑える外科的アプローチの必要性を強調しています。

この手術は、外科医の介入を最小限に抑えつつ変数を制御するよう設計されました。この手術を設計する際には、以下の点が考慮されました:(1) 神経への負担を最小限に抑えるために手術器具の使用を最小限に。ピンセットで神経をつまないようにしましょう...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
#55 鉗子	デュモスター・生物学	11295-51	両手に一つずつ。10-0ナイロン縫合糸を掴むには2人必要です。
10-0ナイロン縫合糸	デメテック	NL761000,4F0P
4-0ナイロン縫合糸	マトリックス・ウィザード	0197
抗ベータチューブリン	R&Dシステムズ	MAB1195
反NF-200	ミリポール・シグマ	N4142
アウステルリッツサイズ000			ピンプリックテストの場合
CF488 共役α-バンガロトキシン	バイオティウム	00005
解剖はさみ	ケント・サイエンティフィック
細縫合はさみ	ケント・サイエンティフィック
虹彩鉗子	ケント・サイエンティフィック
K&H 小動物用加熱パッド	K&Hペット製品
ML162	ミリポール・シグマ	SML2561
マウス手術キット	ケント・サイエンティフィック
ニードルホルダー	ケント・サイエンティフィック
ポリエチレングリコール(PEG)	ミリポール・シグマ	P5413
SCG10	ノバス・バイオロジカルズ	NBP1-49461
ソムノスイート	ケント・サイエンティフィック		イソフルラン麻酔のために
スプリッター鉗子			坐骨神経を露出させるために使われました。