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方法論記事

肝細胞における薬物誘発性老化はM2マクロファージ分極を促進する:チロシンキナーゼ阻害剤関連肝毒性への影響

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DOI:

10.3791/68725

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2025年10月17日

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1Department of Life Sciences, Shiv Nadar Institution of Eminence, 2Independent Researcher, 3Servier Institute of Translational Medicine

この記事について

サマリー

ここでは、SASP 駆動のマクロファージ分極を通じてラパチニブとネラチニブによって引き起こされる肝毒性を研究し、従来の毒性試験を超えたより深いメカニズムの理解を提供します。このアプローチは、老化した肝細胞が免疫応答にどのように影響するかを示しています。これは、長期的な薬物効果を評価し、薬物誘発性肝毒性を管理するための新しい治療標的を発見するのに特に価値があります。

要約

ラパチニブとネラチニブは、HER2 陽性転移性乳がんの治療薬として承認されているチロシンキナーゼ阻害剤 (TKI) ですが、その臨床使用は肝毒性によって制限されています。肝細胞内では、シトクロム P450 酵素がこれらの薬物の反応性代謝産物を生成し、DNA 損傷、ミトコンドリア機能障害、酸化ストレスを引き起こし、肝細胞損傷を引き起こします。この細胞ストレスは、老化関連分泌表現型 (SASP) と呼ばれる炎症誘発性因子および組織リモデリング因子の分泌を伴う成長停止状態である肝細胞老化を引き起こします。SASP は肝臓の微小環境を大幅に変化させ、免疫細胞の挙動に影響を与え、組織の損傷を悪化させます。ラパチニブとネラチニブがHepG2肝細胞株の老化とSASPを誘導することを示しています。さらに、これらの老化細胞からのSASPは、RAW264.7マクロファージのM2様分極を促進します。M2 マクロファージは抗炎症反応と組織修復に関連していますが、その過剰または長期にわたる活動は組織損傷や線維症を引き起こす可能性があります。私たちの発見は、TKI 誘発性肝細胞老化と SASP が免疫応答を調節し、乳がん患者の肝毒性に寄与する可能性のあるメカニズムを強調しています。これは、肝毒性を軽減し、治療結果を改善するために老化細胞または SASP 因子を標的とすることの重要性を強調しており、効果的な老化療法の特定が重要な研究の焦点となっています。TKI 誘発性肝細胞分泌がマクロファージの分極に及ぼす影響を実証する文献報告はありません。

概要

ラパチニブとネラチニブはどちらも低分子チロシンキナーゼ阻害剤(TKI)であり、転移性乳がんの治療薬として2007年と2017年にFDAの承認を受けました1。これらの薬剤は、特定の乳がんで過剰発現する受容体チロシンキナーゼであるヒト上皮成長因子受容体 2、HER22 を阻害することが知られています3。臨床的成功にもかかわらず、ラパチニブとネラチニブは副作用、特に肝毒性も伴います 4,5。アミノトランスフェラーゼレベルの上昇によって現れる急性肝障害は、ラパチニブまたはネラチニブによる治療を受けている患者の約 14% で発生します6。肝毒性は主に、主に CYP3A4/5 7,8 であるシトクロム P450 (CYP) 酵素を含むこれらの薬物の肝臓代謝に起因します。これらの酵素は、求電子性で反応性の高いキノンイミン中間体の形成を触媒します9,10。O-脱アルキル化ラパチニブ、N-脱アルキル化ラパチニブ、N-ヒドロキシラパチニブ、O-脱アルキル化ネラチニブ、N-脱メチル化ネラチニブなどのこれらの反応性代謝産物は、細胞高分子と共有結合付加物を形成し、それによって正常な細胞機能を破壊し、最終的に肝障害を引き起こす可能性があります11。

ラパチニブとネラチニブの反応性代謝産物は、細胞老化の重要な引き金である酸化ストレスを誘発することもあります12。細胞老化は、成長が停止しているが代謝活性な状態であり、さまざまな炎症誘発性サイトカイン、成長因子、およびプロテアーゼの分泌を特徴とします。この分泌表現型は、老化関連分泌表現型(SASP)13,14,15として知られています。SASP は周囲の微小環境に深刻な影響を与え、多くの場合、炎症や組織のリモデリングを促進します。がん治療の文脈では、SASPはがん幹細胞集団を豊かにし、免疫応答を変化させて腫瘍の生存を促進することができます16。さらに、炎症性サイトカインは組織の損傷を悪化させる可能性があります。ラパチニブとネラチニブで治療された患者では、肝障害はTKI誘発性老化と炎症誘発性SASP産生によって部分的に寄与していると推測しました。

私たちの実験では、ラパチニブとネラチニブが肝細胞に活性酸素種(ROS)の産生を誘導し、DNA損傷やミトコンドリア機能障害を引き起こし、それが細胞老化を引き起こすことが実証されました。この老化は、マクロファージの分極に影響を与える可能性のある SASP 因子を放出することにより、ラパチニブ/ネラチニブ誘発性肝毒性に寄与する可能性があります。

マクロファージは免疫応答において重要な役割を果たしており、その機能的表現型はさまざまな刺激に応答して変化する可能性があります17,18。古典的なM1マクロファージ表現型は、通常、TNF-αやIL-1βなどのサイトカインの産生を含む炎症誘発性反応に関連しており、一般に急性炎症のマーカーと考えられています19,20。対照的に、M2マクロファージ表現型は、線維症、組織修復21、免疫抑制、および慢性炎症に対する反応に関連しています22,23。SASP の炎症性サイトカインはマクロファージの分極に影響を与え、M1 マクロファージの M2 様表現型23 への変換を促進する可能性があります。この分極の変化は免疫微小環境に重大な影響を与える可能性があり、免疫抑制、腫瘍の進行、組織構造のリモデリングにつながる可能性があります。

ラパチニブとネラチニブによって誘導されるマクロファージの分極性を調査するために、免疫学的研究で一般的に使用されるマウスマクロファージ様細胞株であるRAW264.7細胞株を使用しました24,25。RAW264.7細胞はBALB / cマウスに由来し、炎症、食作用、および免疫応答の研究に広く使用されています25。これらはリポ多糖類 (LPS) などのさまざまな刺激に反応し、マクロファージ機能、サイトカイン産生、がん生物学の研究に特に価値があります26。この研究では、ヒト肝癌細胞株であるHepG2をラパチニブとネラチニブで処理し、患者に観察された肝毒性作用を模倣しました。HepG2 細胞株は、ヒト由来と肝細胞癌系統27 により、薬物代謝および肝毒性研究モデルとしてよく使用されます。HepG2細胞をTKIで処理した後、コンディショニング培地を収集し、RAW264.7細胞に添加しました。その後のマクロファージ表現型の変化を監視し、治療が炎症誘発性 M1 表現型から免疫抑制性 M2 表現型への移行を誘発するかどうかに焦点を当てました。

薬物誘発性肝毒性は、一般に、細胞毒性アッセイ、炎症マーカーの評価、および動物モデルの使用を通じて研究されます。これらと比較して、老化関連分泌表現型 (SASP) 因子を介して TKI ラパチニブおよびネラチニブ誘発性肝毒性とマクロファージ分極への影響を調べる方法には、いくつかの利点があります。まず、私たちの方法は、薬物誘発性老化肝細胞によって産生されるSASP因子と自然免疫との関連性を確立し、これは組織のリモデリング、慢性炎症、および発がんにさらに関連する可能性があります28,29,30,31。従来の毒性スクリーニングでは、肝臓と免疫細胞の間の短期的な相互作用を捉えるのに役立ちませんし、特に慢性的な薬物曝露の文脈において、肝臓の炎症や線維症に対するTKIの長期的な影響を明らかにすることもできません。SASP 成分を特定するための適切なプロテオミクス アプローチと組み合わせると、この手法は、TKI 誘発性肝毒性の予測バイオマーカーを特定し、それを軽減するための治療介入の設計に情報を提供するのに役立ちます 29,30,31。

実装のために、研究者は、説明されているように、肝臓および免疫細胞株との共培養または条件付け培地システムを利用し、老化のバイオマーカーとM1およびM2マクロファージを評価する必要があります。この方法は、薬物誘発性の急性または慢性肝障害の評価、またはがん治療のオフターゲット効果を最小限に抑えるための戦略の探索に最も効果的です29,30,31。

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プロトコル

1. 細胞培養

  1. HepG2細胞を10%ウシ胎児血清(FBS)を含む修飾イーグル培地(MEM)高グルコースで培養し、RAW264.7細胞をダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)高グルコースで37°Cで5%CO 2 で培養し、3日ごとにリフレッシュします。
    注:真菌または細菌の汚染がない限り、抗生物質の使用はお勧めできません。RAW264.7 細胞は非常に急速に成長するため、2 日後に継代する必要があります。

2. MTTアッセイ

  1. 細胞計数と細胞プレーティング
    1. HepG2細胞を60 mm培養皿で、細胞培養インキュベーターで完全増殖培地(MEM + 10%FBS)で増殖させます。
    2. 細胞が約80%コンフルエントになったら、増殖培地を取り除き、1 mLの1x PBSでクイック洗浄し、600 μLの0.5xトリプシンを加えます。5〜6分間インキュベートします。
      注:すべてのステップは、BSL 2細胞培養キャビネットで実行する必要があります。
    3. BSL内に1.2 mLの完全増殖培地を加えてトリプシンを中和します2。
      注:過剰トリプシン処理を防ぐために、添加されたトリプシンの2倍の量の完全培地を添加する必要があります。
    4. 細胞懸濁液を5 mLの微量遠心チューブ(MCT)に取り、室温(RT)で180 g (1000 rpm)で3〜4分間遠心分離してペレットダウンします。
    5. 上清を捨て、細胞ペレットを1mLの培地に再懸濁し、ピペットで単一細胞懸濁液として混合し、顕微鏡下で血球計算盤を使用してカウントします。
    6. 次に、HepG2細胞をウェルあたり5000〜7000細胞で96ウェルプレートに、完全増殖培地に、各薬物用量ごとに3回にプレートし、インキュベーターに12〜16時間保持します。
      注:薬物治療では細胞コンフルエンシーが50〜60%である必要があり、このステップはフード内で実行する必要があります。
  2. 薬物治療
    1. フード内のストック濃度(それぞれ30 mMおよび3.5 mM)から、ジメチルスルホキシド(DMSO)中のラパチニブおよびネラチニブの作業濃度を徐々に増加させる調製します。最終濃度は、増殖培地(MEM + 5%FBS)中のラパチニブで1、2.5、5、10、15、25、50 μM、ネラチニブで1、2、3、4、5、6、10 μMです。両方の薬剤について1つの無治療対照を保持します。
    2. 細胞を含む96ウェルプレートから以前の培地を廃棄し、100 μLの培地を薬物に加え、インキュベーター内で48時間インキュベートします。
  3. 染色と定量
    1. 48時間後、10 μLの3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム臭化物色素(MTT;5 mg / mL)を加え、各ウェルの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解し、紫色の結晶が現れるまでインキュベーター内で少なくとも2時間インキュベートします。
      注:色素を薬物含有培地に直接添加し、細胞を色素とともに4時間以上インキュベートしないでください。
    2. インキュベーション後、色素を取り除き、各ウェルの100 μLのDMSOに結晶を溶解し、15分間インキュベートした後、595 nmで光学密度(OD)を取ります。
      注意: このステップは、ボンネットの外で実行できます。

3. SA-βガラクトシダーゼアッセイ

  1. 薬物治療
    1. HepG2細胞をプレートあたり40 x 10の密度で35 mmの皿にプレート化します 4細胞 ラパチニブ用、ネラチニブ用、および未処理の対照の3セット。
      注:細胞計数とプレーティングのステップは、ステップ2.1で説明されているとおりです。
    2. 5 mMのワーキングストックから1 μLのラパチニブと3.5 mMのメインストックから1.43 μLのネラチニブを2 mLの培地に加え、ラパチニブとネラチニブの最終濃度を2.5 μM(亜致死量)にします。
      注:亜致死性薬物用量は、MTTアッセイの細胞生存グラフに従って選択されます。
    3. 前の培地を皿から取り出し、500 μLの1x PBSで1回洗浄し、薬物含有培地(フード内)を加え、インキュベーター内で48時間保持します。
  2. 固定と染色
    1. 48時間後、薬物を除去し、500 μLの1x PBSで1回クイック洗浄し、1.5 mLの2%ホルムアルデヒドと0.2%グルタルアルデヒドを1x PBSでRTで10分間固定します。
    2. 固定後、プレートを1 mLの1x PBSで2回洗浄し、固定液が正しく除去されていることを確認します。1.5 mLの染色液(40 mMクエン酸/Na-リン酸緩衝液、5 mM K4[Fe(CN)6]、5 mM K3[Fe(CN)6]、150 mM NaCl、2 mM MgCl 2、1 mg/mL X-gal)をオートクレーブ水に加え、CO2を含まずに37°Cで8時間インキュベートします。
      注:潜伏期間は細胞の種類によって異なる場合があります。HepG2の場合、潜伏期間は8時間を超えてはなりません。
    3. 染色後、プレートを1 mLの1x PBSで2回素早く洗浄し、落射蛍光顕微鏡で20倍および40倍の倍率で明視野画像をキャプチャします。各治療グループに対して最低4〜5つのフィールドをキャプチャします。
      注:固定液と染色液の量はプレートのサイズによって異なり、すべてのステップはフードの外で実行できます。
  3. 画像の定量化
    1. 1つのフィールドから写真を撮り、セルの総数と青い信号を示すセルを数えます。青色の信号を持つセルの割合を手動で計算します。少なくとも 4 つの画像を計算し、平均を取り、スプレッドシートのグラフにプロットし、t 検定を実行します。

4. ROS検出

  1. 細胞プレーティングと薬物処理
    1. HepG2細胞を35 mmのガラス底皿にプレート化し、プレートあたり40 x 104 細胞の密度で3セットに分けます:1つはラパチニブ用、もう1つはネラチニブ用、もう1つは未処理の対照。
      注:細胞計数とプレーティングのステップは、ステップ2.1で説明されているとおりです。
    2. ステップ3.1で説明したのと同じ治療戦略に従ってください。
  2. 染色とイメージング
    1. 48時間の処理後、2 μM細胞ROXディープレッド試薬(5 mMストック)、1 μM Mito Tracker Green(1 mMストック)を30分間加え、500 nM核染色色素Hoechst(500 μMストック)で対比染色します。
      注意: フード内に染料を追加し、直接光にさらさないようにする必要があります。対比染色は、他の染料の投与中に核染色染料Hoechstを添加することによって行われます。
    2. 30分後、色素を除去し、1x PBSで洗浄して余分な色素を除去し、共焦点顕微鏡で100倍倍率(それぞれオイルエマージョン、488nm、および405nmの励起波長)で画像化します。
  3. 画像の定量化
    1. Fiji ImageJソフトウェアを使用して細胞ROX赤のシグナルを定量化し、未処理のコントロールのシグナルと比較します。MitoTracker 緑色を使用して、シグナルがミトコンドリアに由来することを示します。平均値で棒グラフをプロットした後、t 検定を実行します。

5. コンディショニングメディア(CM)の収集

  1. HepG2細胞を2.5μMのラパチニブまたはネラチニブで48時間処理します(この実験を除いて、ステップ3.1と同様の処理戦略、60 mm皿に70 x104 細胞をプレートします)。
  2. 48時間後、薬剤を除去し、500 μLの1x PBSで1回洗浄します。
  3. 老化の最大日(薬物治療の48時間後)に、4 mLの無血清MEM培地(FBSまたはその他のサプリメントなし)を薬物処理細胞および未処理の対照に48時間添加します。
    注:無血清培地の量は、プレートサイズによって異なります。
  4. 次に、コンディショニング培地と呼ばれるすべてのセクレトームを含む無血清培地を収集し、将来の使用のために-80°Cで保存します。
    注:CMを採取した後、2800 g (4000 rpm)で5分間遠心分離して、死んだ細胞やその他の細胞破片を除去する必要があります。RAW264.7細胞は通常DMEMで培養されますが、CMはHepG2培養条件に従ってMEMに収集されます。適合性を維持するために、RAW264.7インキュベーションの前に、コンディショニング培地を無血清DMEMと1:1の比率で混合する必要があります。

6. RAW264.7のM1/M2偏光

  1. 細胞プレーティング
    1. トリプシン化ステップを除き、ステップ2.1で説明したように、細胞計数と細胞プレーティングに従います。RAW264.7細胞のトリプシン化中に、600〜700 μLの0.5xトリプシンを加え、インキュベーターで15〜20分間インキュベートし、トリプシンを中和するために、2 mLの増殖培地(DMEM + 10%FBS)を加え、70 x104 細胞を60 mmのディッシュに3セットにプレートします:ラパチニブ、ネラチニブ、および1つの未処理コントロール。
  2. RAW264.7誘導
    1. 通常の増殖培地を取り出し、1 mLの1x PBSで1回洗浄し、対応するCMを48時間加えます。
      注:RAW264.7細胞はDMEMで増殖するため、CMを追加する前に、無血清DMEMで1:1の比率でコンディショニングし、細胞をMEMに保持するとストレスが発生し、結果が妨げられる可能性があります。RAW264.7をCM(無血清培地)で48時間培養すると、ストレスを引き起こす可能性があります。その場合、データを収集する前に24〜30時間のインキュベーションを行うことができます。
    2. インキュベーション後、CMを廃棄し、1 mLの1x PBSで洗浄し、各プレートに600 μLのトリプシンを加え、10分間インキュベートし、RTで180 g (1000 rpm)で3分間ペレットダウンします。ペレットをタンパク質精製に使用するか、将来の使用のために-80°Cで保存します。
      注:トリプシン処理時間は細胞の種類によって異なり、遠心分離は180 g以上は推奨されません。
  3. タンパク質の単離とウェスタンブロッティング
    1. 放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)溶解バッファーとプロテアーゼ阻害剤カクテルを100:1の比率で混合して、溶解バッファーを調製します。溶解バッファーを細胞ペレットに加え、再懸濁し、氷上で30分間インキュベートします。
      注:溶解バッファーの量はセルパレットのサイズによって異なり、溶解はフードの外で行うことができます。ペレットが-80°Cで保存されている場合は、まず氷上でペレットを解凍し、短時間回転させ、残留培地を取り除きます。
    2. インキュベーション後、細胞ライセートを20,000 g で4°Cで30分間スピンします。 上清を回収してウェスタンブロットに進めるか、将来の使用のために-20°Cで保存します。
    3. 35〜40μgのタンパク質を取り、1xローディング色素を加え、95°Cで5〜6分間加熱し、SDS-PAGE(10%および12%アクリルアミドゲル)を90Vで実行し、ニトロセルロースメンブレンに移します。
    4. 注:ウェスタンブロットに関する詳細については、Joubert et al.32を参照してください。
    5. 抗NOS2抗体と抗ARG1抗体を使用して、西洋わさびペルオキシダーゼ(HRP)現像液、iNOS(M1)およびアルギナーゼ1(M2)をそれぞれ使用してブロットを現像することにより、M1およびM2分極マーカーの発現をチェックします。
      注:抗NOS2および抗ARG1の一次抗体の濃度は1:1000で、二次抗ウサギ抗体は1:10,000です。
  4. LPSとIFN-γを用いたマクロファージ分極
    1. 70 x 104 RAW264.7セルを2つの60 mmディッシュにプレートします。
      注:メッキ手順は手順6.1と同様です。
    2. 12〜16時間後、4 μLの1 μg/mLリポ多糖類(LPS、ストック濃度は1 mg / mL)と1.33 μLの33 ng / mLインターフェロン-γ(IFN-γ、ストック濃度は100 μg/mL)を4 mLの成長培地(DMEM + 10%FBS)に混合し、1つの非誘導コントロールを保持して、事前にプレーティングされたRAW264.7に添加します。
    3. 48時間後、トリプシン処理によって細胞ペレットを回収し、タンパク質を単離し、ウェスタンブロットを実行し、抗iNOS抗体と抗ARG1抗体を使用して、それぞれiNOS(M1)とARG1(M2)の発現をチェックします。
      注:すべての細胞培養廃棄物と生化学廃棄物は、バイオハザードビンに廃棄し、適切にオートクレーブ滅菌してから廃棄する必要があります。

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結果

肝細胞癌 (HepG2) 細胞に対する TKI ラパチニブとネラチニブの影響と、マクロファージに対する下流のパラクリン効果を評価するために、一連のアッセイが実施されました。HepG2細胞をさまざまな濃度のラパチニブまたはネラチニブで処理し、MTTアッセイを使用して48時間で細胞生存率を測定しました(図1A、B)。生存曲線に基づいて、さらなる実験のために2.5μMの亜致死量が選択されました。

この濃度は、ミトコンドリア特異的色素MitoTracker Greenとの共染色によって確認されたCellROX Deep Red染色によって示されているように、ミトコンドリアROSの大幅な増加を誘導することができました(図2)。同時に、SA-β-ガラクトシダーゼ活性を測定...

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ディスカッション

現在の研究では、TKI 処理された HepG2 肝細胞から収集された条件付け培地を通じて、マクロファージの分極に対するラパチニブまたはネラチニブ治療の間接的な効果を調査しています。RAW264.7マクロファージを利用して、ARG1のアップレギュレーションによって示されるように、コンディショニングされた培地への曝露時にM2表現型を観察します。形態学的には、処理されたマクロファージは特徴的な拡大および細長い形状を示し、M2様状態の誘導をさらにサポートしました。以下では、プロトコルの重要な手順、潜在的な変更、トラブルシューティング、制限、および既存の方法との比較について説明します。

ばらつきは老化と SASP 産生の程度に影響を与える可能性があるため、TKI の投与と曝露時間を一元的に維持することが重要です。ROSおよびSA-β-ガラクトシダーゼ活性の正確な測定は、老化誘導を確認するために重要です28,29

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開示事項

著者らは、利益相反がないことを宣言します。

謝辞

著者らは、インフラ支援を提供してくれたシブ・ナダール著名人研究所に感謝している。この研究は、科学技術省の助成金 CRG/2022/003242 によって資金提供されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
HepG2細胞株NCCS付着細胞株
RAW264.7細胞株NCCS付着細胞株
DMEM(ダルバッコ改良イーグルミディアム)ヒメディアAT066高血糖、パウダー
MEM(改良型イーグル・ミディアム)ギブコ611100-053粉
PBS(リン酸塩バッファー生理食塩水)ヒメディアTS1101粉
トリプシン-EDTA溶液ヒメディアTCL007解決
FBS(胎児用牛血清)ヒメディアRM1112液体
MTTダイヒメディアTC191粉
ラパチニブセレックケムS2111粉
ネラチニブケイマン・ケミカル・カンパニー18404粉
DMSO(ジメチルスルホキシド)およびnbsp;ヒメディアTC185解決
ホルムアルデヒド ランケムF0080解決
グルタルアルデヒドシグマ・オルドリッチ340855解決
クエン酸一水和物、ピュアヒメディアGRM229粉
リン酸二塩基性ナトリウム無水産ナトリウム ヒメディアMB024粉
フェロシアン化カリウム、K4[Fe(CN)6]フィッシャー・サイエンティフィック P-236-500
フェリシアン化カリウム、K3[Fe(CN)6]フィッシャー・サイエンティフィック P-232-500
NaClSRL41721粉
MgCl2六水和物ヒメディアGRM-1068粉
X-ギャルSRL45904粉
リポポリサカライドシグマ・オルドリッチL6529
ヒト組換えインターフェロン&ガンマ線;ヒメディアCF040-20MCG
セルROX深赤試薬サーモフィッシャー・サイエンティフィックC10422
ヘヒストインビトロジェン、サーモフィッシャー・サイエンティフィックH3570粉
ミトトラッカー・グリーンインビトロジェン、サーモフィッシャー・サイエンティフィック1842298粉
抗ARG1抗体親近感DF6657溶液、計算MW-35kDa、観測MW-65kDa
抗NOS2抗体クラウドクローン社PAA837Hu01溶液、計算MW - 130kDa、観測MW - 65kDa
抗iNOS抗体親近感溶液、計算MW-130kDa、観測MW-120kDa
抗GAPDH抗体バイオバラティ生命科学 Pvt.LtdBB-AB0060解決
抗ウサギ抗体ケイマン・ケミカル・カンパニー10004301解決
ニトロセルロース膜およびメルク・ミリポール株式会社およびnbsp;HATF00010(製品番号)
フェムトルーセントTMプラスHRPG バイオサイエンス 786-003
60mmアンテナナック150462
96ウェルプレート、およびナック165306
細胞培養インキュベーター サーモフィッシャー・サイエンティフィック371
顕微鏡 1. LEICA逆立顕微鏡  2. ニコンコンフォーカル顕微鏡 1. DMIL LED    2. Ti2E、A1R どちらもモデル番号です
iBrightイメージングシステムインビトロジェン、サーモフィッシャー・サイエンティフィックCL1500(モデル番号)
プレートリーダーバイオRADiMarkマイクロプレートリーダー
遠心分離機およびnbsp;サーモフィッシャー・サイエンティフィックソルバルST 8R(型番)

参考文献

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