方法論記事

ヒト差次発現遺伝子リストを使用して、ダウンストリーム経路濃縮解析とターゲットの優先順位付けを実行する

DOI：

10.3791/68732

⸱

2025年10月3日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Molecular Biology, Brigham Young University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

現在の研究では、バルクRNAシーケンシング実験からのケースサンプルと対照サンプルを比較することによって生成された細胞内シグナル伝達経路のプロファイルに基づいて治療標的を予測し、優先順位を付けるRスクリプトであるPathway2Targetsアルゴリズムを実行するためのプロトコルについて説明しています。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、関連ソフトウェアのインストール、セットアップ検証、edgeRを使用した差次発現分析など、RNAシーケンシングデータから潜在的な治療標的を特定するための多段階の計算パイプラインの概要を示しています。次に、シグナル伝達経路影響分析(SPIA)アルゴリズムを利用して、統計的に有意な経路を予測する方法を示します。結果の信頼性を確保するために、偽陽性結果を減らすための重要な経路 (p < 0.05) に焦点を当てます。従来の遺伝子セットとは異なり、これらの経路はタンパク質間相互作用ネットワークを反映しており、細胞周期、免疫応答、代謝などの細胞プロセスについてのメカニズム的な洞察を提供します。これらの経路は、アプリケーション プログラミング インターフェイス (API) を介して OpenTargets.org データベースとインターフェイスする Pathway2Targets アルゴリズムを使用して分析されます。このアルゴリズムには、リアルタイムで進行状況を提供しながら、特定された経路内の既知の薬物標的をスコアリングする新しい重み付けアプローチが組み込まれています。実行時間は、経路の複雑さとターゲット密度によって異なります。出力は 2 つのランク付けされたファイルで構成されます。最初のファイルには、予測された薬物標的とその加重スコアのリストが含まれており、2番目のファイルには、関連する治療法のさまざまな詳細が含まれています。このパイプラインを組み合わせることで、疾患特異的な遺伝子発現プロファイルの文脈における創薬可能な標的と治療法の優先順位付けが容易になります。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

バルクRNAシーケンシングにより、症例細胞集団と対照細胞集団の数千の遺伝子の発現レベルを比較できます。実験は通常、少なくとも3つのサンプル、理想的には生物学的複製を含むように設計されていますが、技術的な複製で十分です。この設計は生物学的変動を考慮し、外れ値サンプルの影響を軽減します。これらの発現パターンの分析により、正常な細胞プロセスに対する目的の疾患の影響に関する詳細な洞察が得られ、関連する治療法の予測が可能になる可能性があります。

バルクRNAシーケンシングデータの前処理には、通常、シーケンシングリードの品質管理(リピート、シーケンシングアダプター、GC%など)、リードトリミングとアダプターの除去、リードマッピング/定量1,2,3、および差次発現分析4,5,6が含まれます。幸いなことに、これらのステップ7、8、9に関連する手作業を減らすために、さまざまな分析プロセスが自動化されています。前処理が完了した後、一般的に実行される下流解析には、遺伝子オントロジーによる機能過剰表現解析、シグナル伝達経路の濃縮、およびスプライシングの変動が含まれます。これらの下流分析は、遺伝子リストのみよりも高い粒度で差次的発現結果を要約し、解釈を容易にします。

明確に定義されたタイプまたはサブタイプの疾患に対して既存の治療法を再利用することを目的として、さまざまなツールが開発されてきました。これは、意図した疾患のマルチオミクスデータ型でアルゴリズムをトレーニングすることによって実現されます。残念ながら、意図された疾患の特異性と感度を改善するためのこのような取り組みにより、より一般的な状況でのツールの使用が最適とは言えないことがよくあります10,11。別のツールセットは、遺伝子発現プロファイルが遺伝子発現の既存のシグネチャ12,13、または現在の治療法の定量化された効果のいずれかに一致する場合、より広く適用できます14,15。ただし、これらのより広く適用可能なツールは、多くの場合、幅広い疾患にわたって特異性と感度が低下したり、古いデータでトレーニングされたりします。

対照的に、Pathway2Targets アルゴリズムは、B 細胞リンパ腫、歯周炎、エストロゲン陽性乳がん、トリプルネガティブ乳がん、およびチクングニアウイルス16、17、18、19、20、21 の潜在的な治療標的を予測するために以前に適用されてきました。これらの研究の結果は、このツールが堅牢で生物学的に関連する標的を予測できることを示しています。印象的なことに、Pathway2Targets はトリプルネガティブ乳がんの潜在的な薬物標的を 392 個予測し、そのうち 60 個が臨床試験でテストされました。TBNCの828の個別の薬剤も同様で、そのうち37が17でテストされました。リンパ腫の研究では、このアルゴリズムは 915 の薬剤を予測し、そのうち 461 は FDA 承認済みです19。

現在の研究の目的は、コマンドラインでプログラムを実行する際のより記述的な命令へのアクセスから恩恵を受ける可能性のある、より多くの研究者が最近開発されたPathway2Targetsアルゴリズムを効果的に使用できるようにする計算プロトコルを記述することです(図1)。Pathway2Targetsは、差次発現データ、遺伝子疾患関連性、臨床試験情報、公開標的データ22、経路情報などの指標を組み合わせて、特定の状態の標的を予測します。重要なことに、このアルゴリズムには、ユニークでカスタマイズ可能な重み付けスキームが組み込まれており、これにより、ユーザーは、疾患関連の数、シグナル伝達経路の数、固有の薬物の数、臨床試験の各段階における治療薬の数など、分析で強調したい~20の標的関連指標を決定できます23。このプロトコルの使用例として、既存の結腸直腸癌データセットを再分析します24。

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プロトコル

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この研究で分析されたバルクRNAシーケンシングデータは、公開されているデータベース(NCBI Gene Expression Omnibus and Sequence Read Archive)25,26から取得されました。そのため、元のデータ収集者は、情報に通じ、同意した被験者からこれらのサンプルを倫理的かつ適切に収集することを保証しました。

1. Rソフトウェアをダウンロードしてインストールする

  1. Comprehensive R Archive Network (CRAN) https://cran.r-project.org/mirrors.html から適切なリンクをクリックして R (バージョン 4.0 以降) をインストールし、オプション 0-Cloud を使用してから、コンピュータのオペレーティングシステムに適した指示に従います。このプロセスには通常5〜10分かかります。
  2. https://posit.co/download/rstudio-desktop/ から R Studio (バージョン 2024 以降) をインストールし、ダウンロード ページの指示に従います。RStudioのインストールには、通常~10分かかります。
    注: RStudio は、コード実行を簡素化し、構文の強調表示を提供し、パッケージ管理を容易にし、ユーザーが出力を視覚化するのに役立つ統合開発環境を提供するため、インストールはオプションです (ただし、強くお勧めします)。

2. 関連ツール用の R スクリプトをダウンロードしてインストールします

  1. 次の必要な R スクリプトを GitHub リポジトリ https://github.com/bpickett/Pathway2Targets からダウンロードします。このURLは参考用です。
  2. 以下のリンクを使用してスクリプトをダウンロードします。SPIA バージョン 1.0 ( Download Raw File をクリックしてダウンロード): https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/blob/main/SPIA_Code.Rmd (コミット ID: 60fcd46);Pathway2Targetsバージョン3.1( [Rawファイルのダウンロード]をクリックしてダウンロード):https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/blob/main/Pathway2Targets.R(コミットID:8e4c7c8)

3. 関連ツール用の R ライブラリをダウンロードする

  1. R の実行中 (RStudio またはターミナル ウィンドウ) に、次のコマンドを入力して、ソフトウェアの実行に必要な追加の R ライブラリをダウンロードしてインストールします。
    1. RStudioプログラムを起動します。デフォルトでは、コンソールパネルはRStudioの左下隅にあります。コンソールパネルウィンドウ内の任意の場所をクリックすると、下部の矢印「>」記号の後に入力カーソルが表示されます。
    2. 次のコマンドをコピーしてコンソール領域に貼り付け、 Enter キーを押します。
      install.packages(c("RCurl", "stringr", "jsonlite", "httr")). 
      正常にインストールされると、「ダウンロードしたバイナリパッケージは....」というステータスメッセージが表示されます。
    3. 以下のコマンドをコピーしてコンソール・パネル領域に貼り付け、 Enter キーを押します。
      BiocManager::install(c("SummarizedExperiment", "EnrichmentBrowser", "biomaRt", "org.Hs.eg.db")).
      正常にインストールされると、「ダウンロードしたバイナリパッケージは....」という同様のメッセージが表示されます。
      注:最初のライブラリセット(ステップ3.1.1)は典型的なRライブラリで構成され、2番目のライブラリ(2.1.2)はBioConductorライブラリで構成されています。そのため、コマンドは個別に入力する必要があります。これらのライブラリの適切なバージョンは、コンピューターにインストールされている R バージョンに基づいて自動的にダウンロードされます。これらの各コマンドは、完了するまでに ~5 分かかります。

4. ファイル処理

  1. ARMORソフトウェア(または同様のソフトウェア)によって生成された、以前に計算されたedgeRで生成された微分式出力ファイル(RDS形式)をローカルコンピューターにダウンロードします。このファイルの名前は通常edgeR_dge.rdsです。
  2. edgeR(または同様の差次的発現)の結果を手動で確認して、結果の生物学的に関連する解釈を開始します。これを行うには、少なくとも 0.05 <補正された p 値と、場合によっては 1.5 > log2 倍数変化値の絶対値でフィルタリングします。ソフトウェアをテストする場合は、サンプルのedgeR_dge.rdsファイルをZenodoでご覧いただけます:https://doi.org/10.5281/zenodo.15186609
    注:これらのフィルタリングされた結果に残っている遺伝子を確認することで、症例サンプルに関連する表現型の根底にある分子メカニズムを説明し始めることができます(対照サンプルと比較して)。すぐに思い出せる遺伝子記号の数が比較的少ないため、偏りのない方法で遺伝子のリストを解釈する能力は非常に困難であることを認識することが重要です。そのため、シグナル伝達経路解析は、フィルタリングされた遺伝子が細胞内でどのように相互作用および/または相互に通信するかに基づいて要約する有用な方法です。
  3. バルクRNA-seqデータの前処理には、分析するデータセットのサイズに応じて、数時間から数日の計算時間がかかる場合があります。この .rds ファイルをコンピュータの Downloads フォルダに保存します。この .rds ファイル タイプは人間が読めるものではないことに注意してください。

5. SPIA経路濃縮アルゴリズムを実行する

  1. R を使用して実行する場合は、GitHub または 補足コーディング ファイル 1 の R スクリプトを使用します。edgeR_dge.rds ファイルが Downloads フォルダーにあると仮定して、次のコマンドを入力します
    Rscript --vanilla SPIA_Code.Rmd ~/Downloads/edgeR_dge.rds
    1. edgeR_dge.rds ファイルが別のフォルダー (またはディレクトリ) にある場合は、このコマンドを次のように置き換えます
      Rscript --vanilla SPIA_Code.Rmd
  2. RStudio を使用して実行する場合は、GitHub の R スクリプトまたは 補足コーディング ファイル 2 を使用します。
    注: 言語 R では、コード行の前にハッシュタグ # 記号を追加すると、一時的に無効になります。スクリプトはもともと、RStudio ではなくコマンド ライン環境で実行されるように設計されています。特定のコード行を有効または無効にすることは、入力ファイルの設定を再構成する最も簡単な方法です。
    1. R Studio で SPIA_Code.Rmd スクリプトを開くには、[ファイル] メニューの [ ファイルを開く ] オプションをクリックし、スクリプト名を選択します。R Studio コード ウィンドウでは、デフォルトでは左上のパネルにあります。
    2. ファイル内のすべてのコード行を選択し、コードウィンドウの上と右側にある [実行 ] ボタン (または [選択した行を実行)] ボタンをクリックします。実行が成功すると、次のようなファイルが生成されます。
      edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_2025-04-23_
      10-56-45.12767_SPIA_Results.csv
      ダウンロードディレクトリにあります。このファイルには、統計的に有意なシグナル伝達経路が含まれます
    3. 統計的に有意な結果を含むファイルをスプレッドシートとして開いて手動で確認します。このファイルの内容は、差次的に発現する遺伝子によって有意に表される根底にある細胞内シグナル伝達カスケードを要約するのに役立つはずです。
      注:有意な経路の計算の完了には、分析対象のデータセット内のシグナルの強さに応じて、~30分から数時間かかる場合があります。プログラムが実行されているときは、コンソールウィンドウでリアルタイムの進行状況メッセージが継続的に更新されます。頻繁に更新されるメッセージは、プログラムが正常に動作していることを示しています。このステップで何が起こるかの詳細については、GitHub リポジトリ https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/tree/main を参照してください。
    4. サンプル入力ファイルを使用する場合、このステップの出力ファイルは Downloads フォルダーにあり、
      edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_"timestamp"_SPIA_Results.csv.
      この命名スタイルは、入力ファイル名、実行されるプロセス、および出力を反映します。これにより、複数のファイルが処理される場合にファイルを識別する際の混乱が回避されます。
    5. その他のパラメータは、以下で説明するように調整します。
      1. このライブラリのSPIAアルゴリズムのデフォルトパラメータは1,000順列です。これを 2,000 の順列に増やして、結果の信頼性を高めます。perm = 2000 を目的の順列数に変更して、このスクリプトの 84 行目と 85 行目の順列数を調整します。その他のパラメータは、以下で説明するように調整します。
      2. padj.method = 'BH'を削除して、84行目と85行目のp値補正アプローチを調整します。これにより p 値は修正されず、偽陽性の結果が出る可能性が高くなります。

6. SPIA出力でのPathway2Targetsターゲット優先順位付けアルゴリズムの実行

  1. R を実行している場合は、GitHub の R スクリプトまたは 補足コーディング ファイル 3 を使用します。次のコマンドを使用して、このアルゴリズムを呼び出します
    Rscript --vanilla Pathway2Targets.R
  2. R Studio を使用して実行する場合は、GitHub の R スクリプトまたは 補足コーディング ファイル 4 を使用します。R Studio で [ファイル] メニューの [ ファイルを開く ] オプションをクリックし、スクリプト名を選択して、Pathway2Targets.R スクリプトを開きます。
    1. RStudio コード・ウィンドウ (左上のパネル) で、22 行目のファイル名を SPIA 結果のファイル名 (例データから) など) に置き換えます
      infile <- "edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_2025-04-23_
      10-56-45.12767_SPIA_Results.csv"
    2. ファイル内のすべてのコード行を選択し、コードウィンドウの上と右側にある [実行] ボタンをクリックします。リアルタイムの進行状況ステータスメッセージが右下のパネルに連続して表示されます。実行に成功すると、(類似) というファイルが生成されます。
      "edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_2025-04-23_
      10-56-45.12767_SPIA_Results.csv-RankedTargets.tsv"       ダウンロードディレクトリにあります。ファイルの命名スタイルは、入力、プロセス、および出力を反映します
      edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_2025-04-23
      _10-56-45.12767_SPIA_Results.csv
      は、そのようなファイルの入力です。
      注:このステップは、有意なp値を持つシグナル伝達経路の数、それらの重要な経路の遺伝子産物の数、および既知の薬物標的である遺伝子産物の数に応じて、1時間から数時間かかる場合があります。
  3. Pathway2Targets アルゴリズムの一部のパラメーターは調整できます。具体的には、乗数値 (スクリプトの 31 行目から 38 行目) を調整して、各メトリックの重み付けスキームをカスタマイズします。このステップで何が起こるかの詳細については、対応する GitHub リポジトリ (https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/tree/main を参照してください。
    注:参考までに、この例では、数百の個々の標的からなる132の経路から潜在的な薬物を特定するには、完了するまでに約2時間かかります。この指標に基づいて、合計コンピューティング時間を推定することは合理的です。

7. 優先順位付けされた標的と治療薬の結果ファイルを開く

  1. 優先順位付けされたターゲットとそのメトリックを含むファイルが生成されます。サンプル入力ファイルには、Downloads フォルダーにある次の出力ファイルを使用します。
    edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_"timestamp"_SPIA_Results.csv-RankedTargets.tsv
    1. このファイルは、デフォルトでは、カスタム重み付けされたメトリックに基づいて降順にソートされたターゲットでソートされます。出力ファイルを手動で確認して、結果が生物学的に関連性があり、標的が評価対象の表現型に対して論理的であることを確認します。
  2. 優先順位付けされた治療薬とその指標を含むファイルも生成されます。サンプル入力ファイルの場合は、Downloads フォルダー内の出力ファイルを使用します。
    edgeR_dge.rds-TreatmentTumor-TreatmentNativeTissue_"タイムスタンプ"_SPIA_Results.csv-Treatments.tsv
    1. 同様に、この出力ファイルもデフォルトで、重み付けされたメトリックに基づいて降順にソートされたさまざまなターゲットの治療薬(ステップ7.1.1)でソートされます。基礎となる生物学的システムに関する十分な背景知識を使用してファイルを手動で確認し、追加の実験が正当化されるかどうかを判断します。多くの標的が市場に出回っている複数の治療薬の影響を受けるため、複数の治療薬が同じ加重指標を持つ可能性があると予想されます。

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結果

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プロトコルのステップ1〜3で説明したセットアップは、SPIAとPathway2Targetsアルゴリズムの後続の実行を可能にするために必要です。各ステップの最後に、ソフトウェアのインストールが成功したことを確認するメッセージが生成されます。ステップ4は、提供されたサンプルファイル、別の既存のファイルを含む、既存の差動発現結果の既存のセットをダウンロードするか、カスタムRNAシーケンシングデータセットを前処理するかのいずれかで構成されます。ステップ 4 の主な要件は、ワークフローで微分式アルゴリズムとして edgeR を使用し、結果が rds ファイル内の SingleCellExperiment オブジェクトとして格納されることです。

SPIAアルゴリズム(補足コーディング ファイル1 および補足 コーディング ファイル

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

プロトコルの手順 1 から 3 は、特に、ダウンストリーム ソフトウェアを正常に実行するための基になる R ソフトウェア、スクリプト、および依存関係のインストールに関するものです。必要な R ライブラリの詳細なリストが利用可能です (補足表 4)。プロトコルのステップ4では、差分式分析からの出力を含むRデータ(.rds形式)ファイルの取得を行います。このステップの一般的なソフトウェアには、edgeR6、DESeq24、および limma5 が含まれます。このワークフローは、次のパラメーターを使用して、rds形式のedgeR出力と互換性があるように構築しました:100万あたりのlog2カウントを使用した正規化(log = TRUE)、正規化のために考慮される転写産物長オフセット(offset = dge0$offset)、保持する遺伝子のフィルタリング(min.count = 10)、すべてのサン...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

BEPはPythia Biosciencesの株式を保有しています。現在の作業のために外部資金は獲得されませんでした。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ブリガム・ヤング大学のリサーチ・コンピューティング・オフィスが、キャンパスの高性能コンピューター環境にアクセスする際の専門知識とサポートに感謝します。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Pathway2Targets Rスクリプトブリガムヤング大学(ピケット研究室)バージョン3.1https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/blob/main/Pathway2Targets.R
R ソフトウェア包括的Rアーカイブネットワーク(CRAN)バージョン:4.4.3https://cran.r-project.org
R Studioデスクトップソフトウェア仮定バージョン: 2024.12.1+563https://posit.co/download/rstudio-desktop/
SPIA R スクリプトブリガムヤング大学(ピケット研究室)バージョン:3.1https://github.com/bpickett/Pathway2Targets/blob/main/SPIA_Code.Rmd

参考文献

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