方法論記事

水耕栽培 14C放射性標識アッセイと蛍光体イメージングを使用した植物組織中の有機化合物の取り込みと局在化のモニタリング

DOI：

10.3791/68735

⸱

2025年10月10日

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Calgary

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この記事では、 14種類の C 標識有機汚染物質を使用した植物媒介修復を研究する方法の概要を説明します。水耕栽培植物の準備、放射性標識の取り込み、および汚染物質の吸収、転座、および代謝を追跡するための蛍光体イメージングについて説明します。この技術は、さまざまな植物種や環境汚染物質にわたる植物修復の可能性を評価するための貴重なツールを提供します。

要約

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環境汚染物質を軽減するために植物を使用する植物レメディエーションは、汚染された場所を清掃するための持続可能でコスト効率の高いアプローチを提供します。植物の汚染物質の吸収と代謝の背後にあるメカニズムの解明に役立つ方法を開発することは、植物修復の実践を改善するために非常に重要です。この記事では、放射性標識化合物を使用して植物による有機汚染物質の取り込みと変換を評価する方法について説明します。 14名モデル 14C-ナフテン酸などの C 標識有機化合物は、植物組織におけるそれらの吸収、転座、局在化、および代謝を追跡するために使用されます。私たちは以前、 Elymus trachycaulus や Salix interiorを含む複数の植物種でこの方法を使用してきました。これらの観察は、ここでは、改良されたホーグランド溶液で水耕栽培で栽培されたモデル植物である シロイヌナズナと裏付けられています。放射性標識の取り込みは、液体シンチレーション計数と蛍光体イメージング によって 監視され、植物組織内の放射性標識化合物の視覚化と定量が可能になります。この方法では、植物材料の調製、放射性標識化合物の使用、植物内の汚染物質の分布と運命を分析するプロセスについて詳しく説明します。この方法には、化合物の滲出を評価するための戦略も含まれており、植物の取り込みと環境汚染物質の転座の両方の評価を可能にします。このアプローチは、植物を介した修復プロセスに関する洞察を提供し、幅広い環境汚染物質や植物種の研究に適用できます。

概要

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バイオレメディエーションは、植物や微生物などの生物学的実体によって媒介される修復技術です。植物または植物製品を使用して環境から汚染物質を除去する植物修復は、微生物ベースの修復を補完または代替として機能し、微生物のみを使用することの制限のいくつかを克服できます1,2,3,4。植物の太陽光駆動のプロセスにより、植物は汚染物質が根や新芽から吸収され、細胞や組織の間で輸送され、そこで代謝、隔離、または揮発される可能性があるため、費用対効果が高くなります5。植物修復に最も効果的な植物は、通常、ポプラス属やサリックス属に見られるような、高い蒸散速度、急速なバイオマス生産、および深い根系を備えた、回復力があり、ストレス耐性のある種です6。固着生物として、植物は環境中の有毒化合物を処理するために多様な代謝経路を進化させてきました1。これにより、汚染物質を管理する能力を高める幅広い遺伝子と生化学的プロセスが彼らに与えられます。

Sandermann et al. (1977)7によって最初に提案された植物分解フレームワークは、植物を介した汚染物質の無害化のための3段階プロセス(形質転換、結合、および区画化)を概説しています。各段階で、汚染物質は酵素修飾を受け、親水性を高め、毒性を低減し、隔離またはさらなる無機化作用により適しくなります4。しかし、植物は主に炭素固定のために大気中の二酸化炭素に依存しているため、有機汚染物質を完全に無機化する能力は限られている可能性があります。代わりに、汚染物質は液胞または細胞壁に隔離されるか(植物隔離)、大気中に揮発される(植物揮発)可能性があります1。

ファイトレメディエーション研究における重要な課題は、植物が環境から有機汚染物質を吸収して変換できるかどうかを検出することです1。従来の検出方法では、汚染物質の取り込みと転座の経路を正確に追跡できないことが多く、特定の汚染物質を修復する植物の能力を評価することが困難になります1,5。放射性標識炭素 14 (14°C) 有機化合物は、この問題に対する強力な解決策を提供します。植物を 14種類の C 標識汚染物質にさらすことで、研究者は植物組織への放射性標識炭素の取り込みを追跡し、汚染物質の取り込み、転座、変換についての正確な洞察を得ることができます。この技術により、特定の有機汚染物質を修復できる植物種の同定が可能になり、関与する生理学的経路を評価する信頼できる方法が提供されます。最終的に、14種類の C 標識化合物を使用することで、植物修復の可能性についての理解が深まり、環境修復のためのより効果的で的を絞った戦略の開発がサポートされます。

この記事では、14種類のC放射性標識有機汚染物質を使用して、植物による水耕栽培溶液からのこれらの汚染物質の取り込み、転座、および運命を監視する方法について説明します。最近の出版物では、葉面散布時の14種類のC標識除草剤の運命を追跡するための同様の方法が説明されています8。ただし、ここで説明する方法は、水耕栽培溶液からの放射性標識汚染物質の除去と転座を評価する方法の概要を示し、この方法を土壌の使用に適応させる方法についてのコメントがあります。

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プロトコル

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注:このプロトコルを進める前に、関連する機関および国の放射性同位元素安全ガイドラインおよび規制を参照することが重要です。簡単に言えば、すべての放射性物質、または放射性同位元素と接触した可能性のあるものはすべて、二重手袋、白衣、安全ゴーグルを着用して取り扱ってください。この手順は、放射性同位元素を含むセクションをマークするためのテープを使用して、研究室の専用スペースで実行されました。また、すべての手順の後、ガラス器具と器具をすぐに洗浄し、綿棒で刺し、シンチレーションカウント で 汚染放射性同位元素の存在を検査します。これらのアッセイで使用されるすべての材料と液体も、専用の放射性廃棄物容器に廃棄され、カルガリー大学とカナダ原子力安全委員会のガイドラインに従って適切に廃棄されました。

1. ホーグランド溶液の調製

  1. 市販の混合物から0.5倍(半強度)のホーグランド溶液を調製するか、0.5 mM NH4H2PO4、3 mM KNO3、2 mM Ca(NO3)2、1 mM MgSO4、23 μM H3BO3、5 μM MnCl2•4H2O、400 nM ZnSO4•7H2O、 200 nM CuSO4•5H2O、70 nM H2MnO4•1H2O、45 μM FeSO4•7H2O。
  2. MESまたは別の適切なバッファーを添加して、最終濃度10 mMを達成します。
  3. pHを希望の値に調整します(ここでは、pHは5.0でした)。

2. 放射性標識液の調製

  1. 必要な量の0.5xホーグランド溶液(反復あたり50 mL)をクリーンフラスコに移します。
  2. 0.1〜0.26 kBq / mLの放射性標識化合物をホーグランド溶液に加えます。
    注:この研究では、メタノールに溶解した 14個のC-AdCA(アダマンタン-1-カルボン酸)を使用しました。
  3. フラスコを2〜3分間回転させて完全に混合します。
  4. 50 mLの放射性標識溶液を125 mL三角フラスコにリコートします。

3.シロイヌナズナ( Arabidopsis thaliana (L.)Heynh。 植物の準備

注:水耕栽培で成長するためのプロトコル シロイヌナズナ (2013)9.

  1. 植物ごとに、標準的な1.7 mLマイクロフュージチューブからキャップをハサミで取り外し、革の穴あけパンチを使用してキャップの中央に直径3 mmの穴を開けます。
  2. キャップの上部をテープで一時的に密封し、0.8%寒天を含む溶融0.5xホーグランド培地でキャップを満たし、改変されたチップボックス(発芽タンク)の蓋に入れます(図1A)。
  3. シロイヌナズナの種子を70%エタノールで10分間、次に5分間連続洗浄して表面滅菌し、滅菌濾紙のフローフードで乾燥させます。
  4. 微量遠心分離機キャップの上部に開けられた穴から寒天培地に種子を播種します。
  5. チップラックで種子を4°Cで2〜4日間層状にします。
  6. 発芽タンクを長時間の条件下(~150μmol / m、2秒の光、22°Cで16時間の光、8時間の暗闇)で成長チャンバーに移動します。
  7. チップラックに0.5倍のホーグランド溶液を充填します。
    注:乾燥を防ぐために、溶液が寒天に触れていることを確認してください。
  8. 寒天が水耕栽培溶液と接触したままになるように、必要に応じて(3〜4日ごと)植物を育て、必要に応じて溶液を補充します。
  9. キャップと苗木を、ドリルとドリルソービットで50 mLのFalconチューブ蓋の中央を切り開いた直径10 mmの開口部に移植します(図1B)。
  10. 直径30mmのドリルソービット(熟成タンク)で10Lのプラスチック製トートリッドに12個の穴を開けます。
  11. ファルコンチューブの蓋をトートトップの開口部に置き、根が下のトートに入るようにします。
  12. 成熟タンクの底にエアストーンを取り付け、根がほとんど水没するまでホーグランド溶液で満たします。
  13. 植物を成長チャンバーに戻し、ロゼットの直径が約10 cmになるまで、さらに6〜8週間(~150 μmol / m2秒の光と22°Cで16時間明るい、8時間暗い)成長します。

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図1:シロイヌナズナの発芽および成熟水耕栽培タンクと 14C-AdCA処理容器。 (A)水耕栽培のためにシロイヌナズナの種子を発芽させるために使用される発芽タンク。(B)実験の準備ができている成熟タンク内のシロイヌナズナ植物。(C)実験中に 根を14C-AdCA溶液に沈めたシロイヌナズナ植物。50 mLフラスコ( 14C処理容器)は通常、藻類の増殖を防ぐために、曝露中にアルミホイル(図示せず)で覆われています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. バルト海ラッシュ (Juncus balticus Willd. ) 植物の準備

  1. 4°Cのシャーレで2枚の湿らせたろ紙の間に種子を1〜2週間層状にします。
  2. 上部のろ紙を取り除き、皿を長時間の条件下(~150 μmol / m、2秒の光、22°Cで16時間の光、8時間の暗)下の成長チャンバーに1週間置きます。
  3. シロイヌナズナについて説明されているように、苗木を改造されたチップラックに移植します(ステップ3.1〜3.4)。
  4. 2〜3週間(~150μmol / m、2秒の光と22°Cで16時間の光、8時間の暗)、または根の長さが3〜4 cmに達するまで植物を育てます。
  5. 植物をエアストーンで改造した10 Lトートに移植し、根がほとんど水没するまでホーグランド溶液で満たし、さらに6〜8週間成長します(16時間の光、8時間の暗闇、~150μmol / m、2秒の光と22°C)。

5.砂州ヤナギ(Salix interior Rowlee)の小植物の準備

注:サンドバーヤナギの小苗を育てるためのプロトコルは、Alberts et al.(2021)10に記載されています。

  1. 10 cmの茎の挿し木(直径5 mm)を切り、室温でdiH2Oに一晩浸して、水分を補給して発根を刺激します。
  2. 水和挿し木を10 Lの0.5xホーグランド溶液で曝気水耕栽培タンクに移し、1か月間成長させ(~150 μmol / m、2秒の光と22°Cで16時間光、8時間暗)、根と新芽の成長を確立します。
    注:小株の発育中の栄養不足を防ぐために、2週間ごとにホーグランド溶液をリフレッシュしてください。

6. 放射性同位元素の標識

  1. 放射性標識溶液を作った後、溶液から100 μLのアリコートを採取して液体シンチレーション計数を行い、初期同位体濃度を決定します。
  2. 植物の根をそっと吸い取り、乾燥させ、ファルコンチューブキャップアセンブリを、ステップ2.4の14C標識有機化合物を含む0.5xホーグランド溶液を含む125 mL三角フラスコ(14C処理容器)に移します。
  3. フラスコに溶液レベルをマークし、蒸発散を考慮して、実験中に開始量まで補充できることを確認します。
  4. フラスコをアルミホイルで包み、アッセイ中、または標識された植物が追跡期間、放射性標識なしで0.5倍のホーグランド溶液に移されるまで、植物育成ライトの下で40〜60 rpmで振とうします。
  5. 100 μLのアリコートを収集する前に、ステップ6.3で作成したラインまでフラスコ内の容量を1〜2時間ごとに補充します。各フラスコに添加されたホーグランドの量を必ず測定して、各溶液からの蒸発散速度を比較してください。最初の6〜8時間後、サンプリング時間は12〜24時間ごとに増やすことができます。
    注:このステップは必要に応じて数日間続く場合がありますが、実験の進行に合わせてアリコート中の放射能を毎日監視してください。
  6. オプション:追跡期間中の滲出液をモニタリングするために、植物とファルコンチューブキャップアセンブリを50 mLの新鮮なホーグランド溶液( 14C標識化合物を含まない)の入ったフラスコに移し、最初の6〜8時間は2時間ごとに100 μLのアリコートを除去し、その後は実験の開始から24時間間隔で。
    注:植物の根からの化合物の受動的びまん性と能動的滲出を区別するために、シクロスポリンAなどの能動輸送阻害剤を20μMの濃度で添加することができます。
  7. 液体シンチレーションカウンターを使用して、ステップ6.1〜6.6の間に収集された各アリコートの放射性カウントを測定します。

7. 植物の蛍光体イメージング

  1. 放射性標識を含まない0.5xホーグランド溶液で根を15分間すすぎ、緩く結合した放射性同位元素を除去します。
  2. 液体シンチレーションカウントのために100 μLのリンス溶液を収集します。
  3. 植物または非木質植物材料の重量を量って、新鮮な質量を決定します。
  4. 植物材料をゲルドライヤーでラベル付き濾紙の上に50°Cの真空下で2時間乾燥させ、室温で一晩乾燥させます。
    注:乾燥させた後、植物は長期間(4〜6か月)保存でき、放射性信号の低下を最小限に抑えて後日イメージングを行うことができます。
  5. 蛍光体消しゴムの強光に15分間さらして、蛍光体スクリーンをクリアします。
  6. 放射能が知られている放射性を含む2〜10 μLの放射性標識溶液を濾紙に分注し、室温で一晩乾燥させます。
    注:ここでは、放射能の標準である67、33、17、8、4、および2 Bqが使用されていますが、これはプラントサンプルからの信号強度に対応するために変更できます。
  7. 蛍光体スクリーンを乾燥した植物サンプルと放射性標準物質の上に置き、暗所または密閉された不透明な容器に入れ、少なくとも24時間暴露します。
    メモ:画像が露出不足または露出オーバーの場合は、それに応じて露出時間を調整してください。
  8. レーザー走査型蛍光体イメージングシステムで50μmの解像度でスクリーンを画像化します。
  9. ImageJソフトウェア11を使用して蛍光体画像信号の強度と分布を解析します。
    1. ImageJの手順:ファイル>分析>測定値を設定...[領域]を選択し、[平均グレー値]>[OK]を選択します。組織に最適な形状選択ツールを選択します。画像をクリックしてドラッグし、関心のある領域を強調表示します。Ctrl + M キーを押し、面積と平均グレー値をスプレッドシートにコピーします。
  10. 標準曲線の放射性標準を使用して、平均グレー値をBqに変換します。
  11. 植物組織の総活性(積分密度)を次の式で計算します。
    積分密度 (Bq) = (組織の平均 Bq (Bq/cm2) - 背景 (Bq/cm2)) * 面積 (cm2)
    1. オプション:ImageJソフトウェア11を使用して、グレースケール画像を色強度スケールに変換します。

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結果

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14C ラベル取り込み手順は、Salix interior、Elymus trachycaulus (Link) Gould ex Shinners、Juncus balticus10,12 などの湿地種など、シロイヌナズナ以外のさまざまな植物種に適用できます。ただし、代表的な目的のために、シロイヌナズナエコタイプColumbia-7(Col-7)の結果を提示します。以前、ナフテン酸(NA)などの環境汚染物質が、水耕栽培溶液で成長したいくつかの植物種によって取り込まれ、代謝されることを実証しました10,12。NAは、モデル植物であるシロイヌナズナ13,14,15の成長、細胞小器官の形態と動態、および遺伝子発現に影響を与える

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ディスカッション

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ファイトレメディエーションは、産業廃棄物や汚染された場所を洗浄するための受動的で経済的で環境に優しい方法として、ここ数十年で注目を集めています1。汚染物質の取り込みが促進された植物種を特定し、有機分子の吸収を支配する分子プロセスを理解することで、植物修復戦略が改善される可能性があります。他の間接的な方法とは異なり、ここで説明する放射性標識取り込みおよび蛍光体イメージング技術は、植物における標的生体異物および内因性有機化合物の取り込みと転座を追跡するために広く使用できます。

根圏の状態をシミュレートするために、放射性標識溶液を pH 5.0 に調整し、植物の根の中およびその周囲に通常見られる弱酸性環境を反映しました。ただし、土壌に残留する可能性のあるこの自然な酸性勾配は、水耕栽培溶液に残らないため、緩衝液の添加が必要です12,16。さらに、安全性と最適な...

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開示事項

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著者らは、利益相反はないと宣言している。

謝辞

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この研究は、ゲノムアルバータ州およびゲノムケベック州と提携して、大規模応用研究プロジェクト(LSARP)助成金(#18207)を通じてゲノムカナダによって支援されました。共同資金は、アルバータ州政府がアルバータ・イノベーツと雇用経済貿易省を通じて提供した。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ホーグランド変性基礎塩混合物フィトテクノロジー研究所H353硫酸第一鉄を含む
寒天バイオショップAGR001
MES(2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸)バイオショップMES555
pHメーターメトラー・トレドファイブイージー
メタノールバイオショップMET302
12C-アダマンタンカルボン酸シグマ・アルドリッチ106399
14C-アダマンタンカルボン酸ビトラックスカスタム合成
125 mL三角フラスコVWRの30623-174
50 mL FalconチューブVWRのCA21008-940
マイクロセンチフュージチューブVWRの87003-294
植物成長チャンバーコンビロン
チップボックスダイアメッドDIATEC530-8376
ラバーメイド ラフネック 3 ギャル トートアマゾンB0B3345MYH
濾紙VWRのCA28320-020
ペトリ皿VWRの11019-566
フラスコホルダー付きシェーカーフォルマ・サイエンティフィックモデル 4516
シンチレーションカクテルResearch Products International(リサーチプロダクツインターナ111195
シンチレーションバイアルVWRの10014-296
シンチレーションカウンターベックマン・コールターLS6000ICの使用するバイアルはシンチレーションカウンターによって異なります
ジェルドライヤーバイオラッドモデル 583
レーザー走査型蛍光体イメージャーバイオラッド分子イメージャーFX

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kafle, A., et al. Phytoremediation: mechanisms, plant selection and enhancement by natural and synthetic agents. Environ Adv. 8, 100203(2022).
  2. Reis, P. C. J., et al. Microbial degradation of naphthenic acids using constructed wetland treatment systems: metabolic and genomic insights for improved bioremediation of process-affected water. FEMS Microbiol Ecol. 99 (12), fiad153(2023).
  3. Saleem, M. H., Zhu, H., Liu, L. Synergistic and sustainable impact of reducing nitrogen fertilizer on growth, yield, and quality of ramie (Boehmeria nivea L.). Plant Prod Sci. 25 (3), 289-297 (2022).
  4. Kamal, A., et al. Ball-milled synthesis of maize biochar-ZnO nanocomposite (MB-ZnO) and estimation of its photocatalytic ability against different organic and inorganic pollutants. J Saudi Chem Soc. 26 (3), 101445(2022).
  5. Abhilash, P. C., Jamil, S., Singh, N. Transgenic plants for enhanced biodegradation and phytoremediation of organic xenobiotics. Biotechnol Adv. 27 (4), 474-488 (2009).
  6. Isebrands, J. G., Richardson, J. Poplars and willows: trees for society and the environment. , CAB International and FAO. Boston, USA. (2014).
  7. Sandermann, H., Diesperger, H., Scheel, D. Metabolism of xenobiotics by plant cell cultures. Plant tissue culture and its biotechnological application. , (1977).
  8. Mendes, K. F., Martins, B. A. B., Reis, F. C., Dias, A. C. R., Tornisielo, V. L. Methodologies to study the behavior of herbicides on plants and the soil using radioisotopes. Planta Daninha. 35, e017154232(2017).
  9. Conn, S. J., et al. Protocol: optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9 (1), 4(2013).
  10. Alberts, M. E., et al. Detection of naphthenic acid uptake into root and shoot tissues indicates a direct role for plants in the remediation of oil sands process-affected water. Sci Total Environ. 795, 148857(2021).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  12. Alberts, M. E., et al. The effect of rhizosphere pH on removal of naphthenic acid fraction compounds from oil sands process-affected water in a willow hydroponic system. Sci Total Environ. 948, 174720(2024).
  13. Leishman, C., et al. The effect of oil sands process-affected water and naphthenic acids on the germination and development of Arabidopsis. Chemosphere. 93 (2), 380-387 (2013).
  14. Widdup, E. E., et al. Identification of detoxification pathways in plants that are regulated in response to treatment with organic compounds isolated from oil sands process-affected water. Chemosphere. 139, 47-53 (2015).
  15. Alberts, M. E., Chua, G., Muench, D. G. Exposure to naphthenic acids and the acid extractable organic fraction from oil sands process-affected water alters the subcellular structure and dynamics of plant cells. Sci Total Environ. 651, 2830-2844 (2019).
  16. Martinière, A., et al. Uncovering pH at both sides of the root plasma membrane interface using noninvasive imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (25), 6488-6493 (2018).

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