方法論記事

腫瘍細胞の1型従来の樹状細胞様細胞への扱い可能な in vivo 再プログラミング

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DOI：

10.3791/68739

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2025年8月1日

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1Molecular Medicine and Gene Therapy, Science for Life Laboratory, Lund Stem Cell Centre, Lund University, 2Wallenberg Centre for Molecular Medicine, Lund University, 3Centre for Neuroscience and Cell Biology, University of Coimbra

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

このプロトコルは、転写因子PU.1、IRF8、およびBATF3の強制発現を通じて、腫瘍微小環境内のマウスがん細胞を1型樹状細胞にin vivo で再プログラミングすることを記述しています。

要約

がん免疫療法の有効性は、1 型従来の樹状細胞 (cDC1) による固形腫瘍に対する細胞傷害性 T 細胞応答の動員と活性化に依存しています。しかし、がん免疫療法のための cDC1 の生成は、細胞収量の低下、機能的不均一性、腫瘍微小環境 (TME) における免疫抑制に対する感受性など、重大な制限に直面しています。私たちは最近、がん細胞を免疫原性cDC1様細胞にin vivo で再プログラミングすることに基づく免疫療法モダリティを開発し、がん細胞が腫瘍抗原をcDC1として提示することを可能にし、ポリクローナル細胞傷害性T細胞応答と持続的な全身性抗腫瘍免疫を誘発しました。ここでは、癌細胞における最小限のcDC1特異的遺伝子調節ネットワークであるPU.1、IRF8、およびBATF3(総称してPIBと呼ばれる)を過剰発現させ、続いて形質導入細胞と親細胞の混合物を皮下移植することにより、TME内にcDC1様細胞を生成するための扱いやすいプロトコルについて説明します。PIBの過剰発現は、造血マーカーCD45と専門抗原提示複合体MHCクラスIIの腫瘍細胞上の段階的な獲得を促進し、 in vivo cDC1リプログラミングのための細胞表面の読み出しとして機能します。in vitroでの リプログラミングプロセスと比較すると、YUMM1.7マウス黒色腫モデルのin vivoの リプログラミングは、より速い速度論とより高い効率を示しました。cDC1様細胞は、最初の3日以内に宿主免疫細胞を動員し、9日目までに三次リンパ構造の形成につながることにより、TMEの急速なリモデリングを誘導しました。再プログラムされたcDC1様細胞は、少なくとも9日間腫瘍に持続しましたが、15日目には検出されませんでした。ここで説明する in vivo cDC1リプログラミングプロトコルは、「免疫温熱」腫瘍を「免疫温熱」に効果的に変換するための扱いやすく堅牢な方法を提供します。全体として、cDC1 を介した抗腫瘍免疫の根底にあるメカニズムを研究し、他のがん免疫療法法との相乗的な組み合わせを明らかにするための強力なプラットフォームを提供します。

概要

免疫チェックポイント遮断 (ICB)、養子細胞療法 (ACT)、ワクチンなどのがん免疫療法の最近の進歩により、がん治療の状況が変化しました1。黒色腫では、プログラム細胞死タンパク質 1 (PD-1) および細胞傷害性 T リンパ球関連タンパク質 4 (CTLA-4) 阻害に対する応答率は最大 60%2 に達する可能性があります。それにもかかわらず、黒色腫患者の 40% 以上が ICB に反応せず、乳がん、マイクロサテライト安定結腸直腸がん、神経膠芽腫などの免疫原性の低いがんの奏効率は 5% 未満のままであり、臨床的ギャップを浮き彫りにしています 3,4,5。広範な臨床的成功に対する主な障壁は、腫瘍微小環境(TME)6内の効率的な抗原提示に依存する細胞傷害性T細胞応答の活性化が不十分であることです。

従来の1型樹状細胞(cDC1)はまれですが、腫瘍特異的免疫の開始に不可欠であり、T細胞応答をプライミングするための3つの重要なシグナルを提供します:(1)主要な組織適合性複合体(MHC)クラスIおよびII上の抗原の専門的な処理と提示、(2)CD80およびCD86を介した共刺激、および(3)IL-12を含む炎症誘発性サイトカインシグナル伝達 7,8.樹状細胞(DC)サブセットの中で、cDC1は、腫瘍細胞関連抗原を交差提示して、記憶CD8 + T細胞をプライミングまたは再活性化したり、CD4 + T細胞を1型ヘルパー(TH1)細胞に分化させたりすることに優れています9。さらに、cDC1は、腫瘍組織へのT細胞動員を媒介するケモカイン、C-X-Cモチーフケモカインリガンド9および10(CXCL9 / 10)の主な生産者です10、11、12、13。過去数年間、多くの研究で、腫瘍拒絶反応と ICB または ACT に対する効果的な反応が腫瘍内 cDC1 の存在と強く相関していることが強調されています12,13。したがって、cDC1 はがん免疫療法の魅力的な標的として発展しており、その独自の特徴をうまく活用することで、大きな翻訳の可能性を秘めることができます。

cDC1を生成する現在の方法は、CD34+前駆細胞または多能性幹細胞からの血液分離または分化に基づいています14,15,16。主な臨床戦略は、血液から自家 DC サブセットの混合物を単離し、トール様受容体アゴニストまたは炎症誘発性サイトカインで ex vivo で刺激して、再注入前に成熟した免疫原性プログラムを誘導することに依存しています16。ただし、これらの戦略は、細胞成熟不良、TMEの免疫抑制障壁、およびcDC1の割合がごくわずかに存在する注入DC混合物のサブセットの不均一性によって制限されます7。さらに、がん免疫療法またはワクチン接種のためにcDC1のみを分離することは、末梢血中の存在量が非常に低いため(0.3%<16)。さらに、cDC1は、サイトカインとNOTCHシグナル伝達を使用して、CD34+前駆細胞または人工多能性幹細胞から産生できます。ただし、これらの方法は複雑で長いプロトコルを必要とし、DCサブセット17、18、19の数が少なく、不均一な集団を生成します。

これらの制限に対処するために、in vivoリプログラミングは、cDC1の表現型、転写、および機能的特性に類似したcDC1様細胞を生成するための癌免疫療法に適した戦略を提供します20。cDC1特異的最小遺伝子調節ネットワーク(PU.1、IRF8、およびBATF3(総称してPIBと呼ばれる))の過剰発現を通じて、線維芽細胞、間質細胞、および癌細胞は徐々にcDC1様細胞に再プログラムされ、腫瘍抗原プロセシングとMHCクラスIおよびIIへの提示、CD80およびCD86を介した共刺激シグナル伝達、およびCXCL9/10およびIL-12を含むサイトカイン/ケモカイン分泌を可能にします20。21、22、23。cDC1リプログラミングは、免疫抑制とは無関係に、in vivoでヒト異種移植片全体でより速く、より効率的に進行し、成熟した免疫原性シグネチャを持つcDC1様細胞を生成しました20。同系黒色腫腫瘍では、cDC1様細胞がTMEをリモデリングし、三次リンパ構造(TLS)の形成を誘導し、ポリクローナルTH1および細胞傷害性メモリーT細胞を動員および増殖させ、長期的な全身性免疫につながることを観察しました20。最後に、アデノウイルスベクター20の腫瘍内注射によるがん細胞のcDC1様細胞へのin situリプログラミングに基づく新しいがん免疫療法モダリティを開発しました。これらの発見は、cDC1の機能特性を利用できる新しいがん免疫療法モダリティとしてのcDC1リプログラミングの臨床翻訳への道を開きます。

ここでは、in vivo cDC1リプログラミングに基づいてTME内にcDC1様細胞を生成するための扱いやすいプロトコルを提示します。PIBのがん細胞へのレンチウイルス送達と、形質導入されたがん細胞と形質導入されていない親がん細胞の定義された混合物としての移植により、TME内のがん細胞の制御された部分のin vivoリプログラミングが可能になります。さらに、この方法は、ウイルスベクター20のin situ送達効率によって制限されない。同系黒色腫モデルYUMM1.7を例に、効率的なレンチウイルスベクター産生、機能的滴定、およびin vivo cDC1リプログラミングの手順を概説します。腫瘍解離後のフローサイトメトリーによって in vivo で再プログラムされた cDC1 様細胞を分析するための実験セットアップとゲーティング戦略について詳しく説明します。また、腫瘍切片の凍結保存、切片化、免疫蛍光染色、続いて共焦点顕微鏡検査を行うことにより、TMEの変化を評価する手順も提供します。最後に、腫瘍の増殖と生存を測定することにより、cDC1誘発性免疫を監視する方法について説明します。この扱いやすくスケーラブルなアプローチは、研究者に、in vivo cDC1 リプログラミングによる組み合わせ治療戦略を評価し、がんモデル全体で TME および TLS 新生の変化を特徴付けたり、抗原提示やサイトカイン/ケモカイン分泌などのさまざまな免疫経路の発現を修飾する大規模なスクリーニングを実行したり、抗腫瘍免疫への影響を解明したりするための貴重なツールを提供します。

プロトコル

動物実験手順は、スウェーデン農業委員会の承認後、スウェーデンの規制に従って実施されました。

1. 試薬の調製

  1. ダルベッコの修飾イーグル培地(DMEM)完全培地を調製するには、10%(v / v)ウシ胎児血清(FBS)、1 mMピルビン酸ナトリウム、100 U / mLペニシリン(Pen)、2 mMグルタミン置換物、および100 mg / mLストレプトマイシン(Strep)を加えます。
  2. RPMI 1640完全培地を調製するには、10%(v/v)FBS、2 mMグルタミン置換物、1 mMピルビン酸ナトリウム、50 mM 2-メルカプトエタノール、100 U/mL Pen、および100 mg/mL Strepを加えます。
  3. DMEM/F12完全培地を調製するには、10%(v/v)ウシ胎児血清(FBS)、1 mMピルビン酸ナトリウム、0.1 mM非必須アミノ酸、100 U/mL Penおよび100 mg/mL Strepを加えます。
  4. 1 mg/mLのポリエチレンイミン(PEI)を調製するには、100 mgのPEI粉末をガラスビーカーまたはコニカルチューブ内の滅菌脱イオン水100 mLに溶解します。ビーカーをマグネチックスターラーの上に置き、室温(RT)で撹拌して、完全に溶解するまで渦を作ります。pHを6.9〜7.1に調整し、塩酸(HCl)/水酸化ナトリウム(NaOH)を滴下し、0.22μmのPESメンブレンフィルターで溶液をろ過します。
  5. 1 mM酪酸ナトリウムを調製するには、1.10 mgを10 mLの滅菌脱イオン水に溶解します。
  6. 8 mg/mL ポリブレンを調製するには、80 mg のポリブレン粉末を 10 mL の滅菌脱イオン水に溶解します。
  7. FACSバッファーを調製するには、2%FBSと1 mM EDTAをリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に加えます。

2. レンチウイルスの産生

  1. 予熱したDMEM完全培地9 mLに1 mLの細胞を加えてHEK 293T細胞を解凍し、細胞を350 × g で5分間遠心分離します。細胞ペレットを20 mLのDMEM完全培地に再懸濁し、150 mmプレートで5%CO2で37°Cで細胞を培養します。
  2. HEK 293T細胞が80〜90%のコンフルエントに達したら、増殖および分割します。細胞を分割するには、PBSで1回洗浄し、5 mLのトリプシンを加えてプレートから解離させ、5%CO2で37°Cで5〜10分間インキュベートします。
  3. 5 mLのDMEM完全培地で細胞を採取し、350 × g で5分間遠心分離し、トランスフェクションの48時間前に新しい150 mmプレートに1:6で分割します。
    注:レンチウイルス産生細胞株の品質は、高力価を生成するために非常に重要です。セルが95%のコンフルエンシーを超えないようにし、<30%のコンフルエンシーでシードすることは避けてください。
  4. 48時間後、または細胞が70〜80%のコンフルエントに達したら、50 mLのコニカルチューブでトランスフェクションミックスを調製します。次のトランスファープラスミドを使用します:1)SFFV-PIB-IRES-eGFP-転写因子PU.1、IRF8、BATF3、内部リボソーム侵入部位(IRES)、および蛍光形質導入レポーターとしての増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)を含むポリシストロンレンチウイルスベクター。または 2) SFFV-eGFP、複数のクローニング部位と eGFP を備えた対照レンチウイルス ベクター。または3)SFFV-mCherry、mCherryを発現するレンチウイルスベクター。10 μgのトランスファープラスミド、7.5 μgのパッケージングプラスミドpsPAX2、および2.5 μgのエンベローププラスミドpMD2.Gを加えます。チューブにOpti-MEMを補充して、総容量2mLにします。最後に、トランスフェクション試薬PEI(1 mg/mLストックから)60 μLをトランスフェクションミックスに加えます。
    注:レンチウイルスベクターSFFV-eGFPは、レンチウイルスを介した免疫原性を説明するための再プログラミング実験の形質導入コントロールとして使用され、SFFV-mCherryは蛍光標識がん細胞株の生成に使用されます。
  5. トランスフェクションをボルテックスして1分間完全に混合し、RTで15分間インキュベートして、DNA-脂質複合体の形成を可能にします。
    注:コンフルエントはウイルス力価に大きく影響します。70%未満のコンフルエントで細胞をトランスフェクションすると、プラスミドを受け取る細胞が少なくなるため、ウイルス力価が低くなります。
  6. HEK 293T細胞の培地を吸引し、ペン/ステップなしで10 mLのDMEMを10%滅菌ろ過したFBSを加えます。
  7. トランスフェクションミックスを150 mmプレートに滴下し、5%CO2で37°Cで16時間インキュベートします。
  8. トランスフェクション後、培地を1 mM酪酸ナトリウムを添加した20 mLのDMEM完全培地と交換し、細胞を5%CO2で37°Cで24時間インキュベートします。
    注:酪酸ナトリウムはクラス1ヒストン脱アセチル化酵素(HDAC)阻害剤であり、ヒストンの高アセチル化を誘導することにより、HEK 293T細胞の遺伝子発現を増強することができ、クロマチン構造を開き、ウイルスパッケージングおよびトランスファープラスミドの転写を促進します。トランスフェクション効率は、蛍光顕微鏡を使用してeGFP発現をチェックすることで評価できます。
  9. トランスフェクションの48時間後および60時間後に、レンチウイルス含有上清を50 mLコニカルチューブに回収します。最初の収集後、2回目の収集のために、150 mmプレートあたり12 mLの予熱されたDMEM完全培地を追加します。コレクションを4°Cで保存し、0.45μmの低タンパク質結合PESフィルターでろ過し、組み合わせます。
  10. ウイルスを濃縮するには、37 gのレンチウイルス含有培地を38.5 mLのオープントップ薄壁ポリプロピレンチューブにピペットで入れます。ベンチスケールを使用してチューブの重量を測定します。
    注:レンチウイルス含有培地の重量は、重量の方がバランスの精度が高いため、その体積ではなく重量を測定してください。超遠心分離機の損傷を避けるために、チューブの重量はバランスが取れている必要があります。
  11. チューブを超遠心分離バケットに入れ、蓋を閉め、バケツをスイングバケットローターに入れます。25,000 × g で 4 °C で 90 分間遠心分離します。
  12. 遠心分離後、バケツからチューブを取り出し、上清を吸引します。
    注:同じチューブを繰り返し充填し、合計3回の遠心分離ラウンドに使用して、チューブあたりより大きなレンチウイルスペレットを製造できます。
  13. オープントップの薄壁ポリプロピレンチューブを実験室のワイプまたは同様の吸収材料の上に5分間逆さまに置き、余分な液体を排出してペレットを乾燥させます。
  14. HEPESまたはPBSを添加した200 μLの氷冷DMEMを各ペレットに加えます。微量遠心チューブを50 mLの円錐形チューブに入れ、蓋を閉めて無菌状態を維持します。
  15. ペレットを4°Cで一晩インキュベートして、再懸濁を可能にします。
  16. 再懸濁したペレットを混ぜ合わせ、アリコートし、-80°Cで最長1年間保存します。
    注:凍結融解の繰り返しによる力価の損失を避けるために、より少ないアリコート量(例:50〜200 μL)を使用してください。

3. 機能性ウイルス滴定

注:このステップは、形質導入(eGFP +)細胞と非形質導入(eGFP-)細胞の1:1の比率を達成するために必要な最適なウイルス用量を決定するために、レンチウイルスのバッチごとに繰り返す必要があります。

  1. 適切な培地(例えば、DMEM/F12完全培地中のYUMM1.7マウス黒色腫細胞株)でがん細胞を解凍および増殖させます。
    注:細胞は、再プログラミング実験の前に少なくとも1ラウンドの分裂を受ける必要があります。細胞の継代は、実験間で類似している必要があります。
  2. 腫瘍形成の1日前に、培地を吸引し、PBSで1回洗浄し、100mmプレートまたは150mmプレートあたり2mLまたは5mLのトリプシンを加えることにより、がん細胞を増殖させます。5%CO2 で37°Cで5〜10分間インキュベートし、100 mmまたは150 mmプレートあたりそれぞれ8 mLまたは5 mLの完全培地を50 mLのコニカルチューブに添加して細胞を回収します。
  3. 細胞を350× g で5分間遠心分離してトリプシンを除去し、完全培地に再懸濁します。
  4. 10 μLの細胞アリコートを取り、10 μLのトリパンブルーを加え、血球計算盤を使用して生細胞をカウントします。
  5. 6 ×10 5 個の細胞を 12 mL の完全培地を含む新しい 50 mL コニカル チューブに移し、12 μL の 8 mg/mL ポリブレンを細胞懸濁液に加えて、8 μg/mL の作業濃度に達します。
  6. 2 mLの細胞懸濁液を6ウェル組織培養プレート上の各ウェルにピペットで移します。
    注:必要に応じて、細胞数を6ウェルプレートあたり1.2〜1.8 x 106 に増やします。
  7. 各ウェルにレンチウイルスの容量を増やして、形質導入(eGFP+)細胞と非形質導入(eGFP-)細胞の1:1の比率を達成するために必要な最適な容量を決定します。
    注:レンチウイルスの推奨量を1、2、4、8、16、および32 μLに3回追加します。空のコントロールレンチウイルスベクターSFFV-eGFPおよびSFFV-mCherryの機能滴定を実行します。
  8. 細胞を5%CO2で37°Cで24時間インキュベートします。
  9. 0日目に、レンチウイルス含有培地を除去し、新鮮な培地と交換し、5%CO2で37°Cで72時間インキュベートします。
  10. 3日目に、蛍光顕微鏡で細胞のeGFP発現をチェックします。
    注:このステップは、細胞形質導入の迅速な検証を提供しますが、eGFP+ とeGFP- 細胞の正確な比率を決定するためにステップ3.14でフローサイトメトリーによって実行された分析に取って代わるものではありません。
    一部のがん細胞(B16マウス黒色腫細胞など)では、eGFPシグナルが低く、蛍光顕微鏡を使用して検出するのが難しい場合があります。フローサイトメトリーに直接進むことをお勧めします。
  11. 培地を吸引し、PBSで細胞を1回洗浄し、ウェルあたり500 μLのトリプシンを加えます。5%CO2で37°Cで5〜10分間インキュベートします。
  12. 1.5 mLのFACSバッファーで各ウェルの細胞を上昇させ、細胞懸濁液を5 mLのポリスチレンチューブにピペットで入れます。アリコートを取り、血球計算盤とトリパンブルー染色を使用して生細胞をカウントします。
  13. 細胞懸濁液を350 × g で5分間遠心分離し、ペレットを100 μLのFACSバッファーに再懸濁し、フローサイトメトリー分析を続行します。
  14. 形質導入(eGFP+)細胞と非形質導入細胞(eGFP-)の正確な比率をフローサイトメトリーで定量化します。 in vivo 試験では、1:1の比率に最も近いレンチウイルスの体積を使用します。
    注:eGFP+ とeGFP- 細胞の比率を正確に決定するには、形質導入されていない癌細胞をゲーティングの陰性対照として含めます。

4. in vivo リプログラミングのための皮下腫瘍の確立

  1. mCherry発現細胞を生成するために、適切な培地でがん細胞を解凍および増殖させます。
    注:mCherryの発現は、フローサイトメトリー分析中のがん細胞を腫瘍内の他の集団、例えば内因性間質細胞および免疫細胞と区別することを容易にします。
  2. ステップ3.2〜3.4を実行し、1mLあたり10〜5 細胞の濃度で細胞を完全培地に再懸濁します。
  3. 8 μg/mLのポリブレンと測定された量のSFFV-mCherryレンチウイルスを細胞懸濁液に加え、>90%の形質導入効率に達します。
    注:あるいは、>90%の形質導入を達成すると細胞生存率が損なわれる場合は、形質導入の72時間後に蛍光活性化細胞選別(FACS)によってmCherry + 細胞を選別し、培養中で選別された細胞を増殖させます。
  4. 100 mmプレートあたり5 mLの細胞懸濁液(5×105 個を含む)をプレートし、細胞を37°Cで5%CO2 で24時間インキュベートします。
  5. 24時間後、培地を10 mLの完全培地と交換し、再プログラミング実験を開始する前に、5%CO2 で37°Cで少なくとも7日間培養して細胞を増殖させます。
  6. 増殖後、ステップ3.2〜3.4に従って、以前に決定されたSFFV-PIB-IRES-eGFPの容量でその後形質導入のための細胞懸濁液を調製し、その結果、3日目に形質導入(eGFP +)細胞と非形質導入(eGFP-)細胞の比率が1:1に最も近い。
  7. 8 μg/mLのポリブレンを、以前に決定した量のレンチウイルスとともに、50 mLのコニカルチューブ内の細胞懸濁液に細胞懸濁液に加えます。泡を出さずによく混ぜます。
  8. 6ウェル組織培養プレートにウェルあたり2 mLの細胞懸濁液(105 細胞を含む)をピペットで移し、5%CO2で37°Cで24時間インキュベートします。
    注:または、100 mm組織培養プレートの5 mL形質導入培地に細胞をプレーニングします。ただし、形質導入効率は大量に低下する可能性があり、ステップ3.1〜3.13で説明されているように経験的に決定する必要があることに注意してください。
    形質導入プロセス中の潜在的な細胞損失を補い、腫瘍形成中のピペッティングまたは注射に十分な量を確保するために、少なくとも10%多くの細胞を形質導入することをお勧めします。
  9. 24時間後、レンチウイルス含有培地を除去し、PBSで2回洗浄し、各ウェルに500 μLのトリプシンを加え、5%CO2で37°Cで5〜10分間インキュベートします。
  10. 細胞がプレートから完全に解離したかどうかを光学顕微鏡で確認し、完全な培地で50 mLの円錐形チューブに集めます。
  11. 細胞を350× gで5分間遠心分離してペレット化し、PBSでペレットを洗浄し、350×gで5分間再度遠心分離 します。アリコートを取り、血球計算盤とトリパンブルー染色を使用して生細胞をカウントします。
  12. ペレットを氷冷PBSに再懸濁して、腫瘍あたり50 μLの注入量で1〜2〜2×107細胞/mLの濃度に達する×107細胞に相当します。
    注:重要なことに、これらの数値は、フローサイトメトリー分析のためにin vivoで再プログラムされたcDC1様細胞を単離するために、YUMM1.7黒色腫腫瘍について検証されています。他の細胞株や、腫瘍の増殖や生存実験などの他の実験的読み出しについては、数値を経験的にテストする必要があります。腫瘍の増殖と生存の実験では、腫瘍あたり100,000〜250,000の細胞の範囲で、より少ない細胞数が推奨されます。
  13. 動物実験を行う作業エリアに移動し、細胞を氷上に置いてください。
    注:細胞調製後、細胞生存率が時間の経過とともに低下するため、できるだけ早く細胞注射を行ってください。
  14. マウスあたり3 μLのキシラジン(20 mg / mL)、27 μLのケタミン(100 mg / mL)、および30 μLのPBSを含む麻酔液を調製します。
  15. CD45.1マウスに60μLの麻酔薬を腹腔内に注射して麻酔します。マウスを無作為化し、体温の低下を避けるために加温パッドの上に置いてください。麻酔中の眼の脱水症状を防ぐために、アイクリームを目に塗ります。
    注:野生型CD45.2対立遺伝子を発現する in vivo で再プログラムされたcDC1様細胞と内因性免疫細胞を区別するには、CD45.1マウスを使用することが重要です。細胞株がCD45.1の場合、C57BL/6マウス(CD45.2)をレシピエントとして使用できます。マウスは実験群間で性別と年齢を一致させ、腫瘍形成前に無作為化する必要があります。
  16. すべてのマウスが完全に麻酔されるまで5〜10分待ちます。
  17. カミソリを使用してマウスの右脇腹を剃ります。オプションで、耳切りを使用してマークを付けます。その部分を消毒し、残りの髪を70%エタノールで拭き取ります。
  18. P1000ピペットを使用して上下にピペッティングすることにより、がん細胞を再懸濁します。細胞懸濁液を0.5 mL 30 Gシリンジにロードします。
  19. 2本の指でマウスの剃った脇腹の皮膚をそっと持ち上げ、皮膚にしわができるところに針の先端を挿入します。
    注意: 針で指に穴を開けないように注意してください。
  20. 皮膚を解放し、片手で注射器を所定の位置に保持し、もう一方の手の2本の指でマウスの皮膚を伸ばします。
  21. がん細胞懸濁液50μLをゆっくりと注入し、注射部位に楕円形の膨らみ(皮下腫れ)を作ります。
    注:バルジが形成されない場合は、懸濁液が周囲の皮下組織に漏れている可能性があり、腫瘍形成に一貫性がない、または失敗する可能性があります。
  22. 処置後、すべてのマウスの目覚めを監視して、麻酔後の生存を確認します。
  23. マウスを23±2°Cの制御された温度環境と固定された12時間の明暗サイクル、および食物と水への自由なアクセスで維持します。
    注:腫瘍の増殖を監視する場合は、ステップ4.24〜4.26に進みます。それ以外の場合は、これらの手順をスキップして、次のセクションに直接進んでください。
  24. 腫瘍の成長を監視するには、片手でマウスをそっと拘束し、腫瘍をはっきりと視覚化します。
  25. 電子ノギスを使用して、腫瘍の長さ (l)、幅 (w)、高さ (h) を測定します。式を使用して腫瘍体積(V)を計算します: V =(l x w x h)/ 2。
  26. 2〜3日ごとに腫瘍の寸法を測定します。腫瘍が人道的エンドポイント基準(例:1,500 mm³)を満たす体積に達したら、倫理的および制度的ガイドラインに従って動物を安楽死させます。

5. フローサイトメトリー解析のための腫瘍分離

  1. 腫瘍サンプルを採取するために、はさみ、鉗子、FACSバッファー、および氷冷RPMI完全培地を含む12ウェル非組織培養プレートを調製します。
  2. 腫瘍ごとに30 μLの100 mg/mLコラゲナーゼDと3 μLの10 mg/mL DNAse Iを3 mLのRPMI完全培地に混合することにより、腫瘍消化液を調製します(1 mg / mLコラゲナーゼDおよび10 μg / mLDNAse Iの作業濃度に達するため)。
    注:消化効率が最適でない場合は、コラゲナーゼ活性をサポートするために2〜5 mM CaCl2 を添加します。
  3. 隔離当日に子宮頸部脱臼またはCO2 窒息によってマウスを安楽死させます。
  4. はさみと鉗子で皮下腫瘍を切除し、各腫瘍を氷冷RPMIで12ウェル非組織培養プレートのウェルに入れます。非腫瘍組織の切除を最小限に抑えるようにしてください。
  5. はさみを使用して腫瘍サンプルを1〜2 mmの3 個に切断し、3 mLの消化液を含む50 mLの円錐形のチューブに収集し、200〜250 rpmで30〜45分間振とうしながら37°Cでインキュベートします。
    注:消化プロセスを容易にするために、15分ごとにボルテックスまたはピペットを使用。
  6. 消化後、5 mLの血清学的ピペットを使用して混合物を1分間激しくピペットで移します。細胞懸濁液を70 μmの細胞ストレーナーを通して新しい50 mLコニカルチューブにろ過します。
  7. 10 mLシリンジのプランジャーを使用して、未消化の破片を70 μmのセルストレーナーに押し付け、ストレーナーを10 mLのRPMI完全培地ですすいでください。
  8. 細胞懸濁液を350 × g で4°Cで5分間遠心分離し、1 mLのFACSバッファーに再懸濁し、生細胞をカウントします。
  9. 細胞懸濁液を5 mLポリスチレンチューブに移し、細胞を350× g で5分間ペレット化し、FACSバッファー100 μLあたり106 個の生細胞を再懸濁します。
  10. 単色(SC)およびFMOコントロール用のセルを別々のポリスチレンチューブに分離します。
  11. ラット血清(1:100)を含む抗体染色マスターミックスを調製して、非特異的結合をブロックします。分析で死んだ細胞を除外するための固定可能な生存率色素(1:100)。蛍光標識抗体の抗CD45.1、抗CD45.2、および抗MHC-IIを最適濃度で提供します。各サンプルに100 μLのマスターミックスを加え、暗所で4°Cで20分間インキュベートします。
  12. サンプルを2 mLのFACSバッファーで2回洗浄し、フローサイトメトリー分析を続行します。
  13. 形質導入(eGFP+)がん細胞(CD45.1-mCherry+)でゲーティングすることにより、CD45.2および/またはMHC-IIを発現するcDC1様細胞の割合を定量化します。
    注:このプロトコルは、内因性リンパ性および/または骨髄性免疫細胞集団に対する抗体で染色パネルを補完することにより、 in vivo cDC1リプログラミング後の腫瘍の免疫表現型検査を実行するために使用できます。

6. 共焦点顕微鏡分析のための腫瘍凍結と切片化

  1. 手順5.1および5.3に従って腫瘍分離の準備をします。はさみと鉗子で皮下腫瘍を切除します。
  2. 新たに調製した4%パラホルムアルデヒド(PFA)をPBS中の4°Cで穏やかに振とうしながら固定します。組織1mm³あたり1時間をガイドラインとして、腫瘍のサイズに応じて固定時間を調整します。
  3. 腫瘍をPBS中の15%スクロースに移し、チューブの底に沈むまで組織を穏やかに振とうしながら、4°Cでインキュベートします。次に、同じ条件下でPBS中の20%スクロースに移動させます。
  4. 腫瘍がチューブの底に定着したら、PBSおよびOCT化合物中の20%スクロースの1:1混合物で、振とうしながら4°Cで30分間インキュベートします。
  5. 混合物を取り出し、組織を100%OCTでクライオモールドに埋め込み、液体窒素を使用してスナップフリーズします。
    注意: 冷やけどや急速な蒸気膨張による怪我を防ぐために、常に適切な個人用保護具(クライオグローブ、フェイスシールド、白衣)を着用してください。窒息の危険を避けるために、換気の良い場所で作業してください。
    1. 脱水を防ぐために、ブロックは密閉容器に-80°Cで保管してください。

7.腫瘍切片の免疫蛍光染色

  1. クライオスタットを使用して、腫瘍を厚さ約8μmの切片に切断し、顕微鏡スライドガラスに取り付けます。必要に応じて、スライドを-80°Cで保管します。
    注:組織の完全性を維持するために、クライオスタットへの輸送中、およびクライオスタットからの輸送中、腫瘍カットが取り付けられたブロックとスライドをドライアイス上に保管してください。セクショニング中は、クライオスタットが-20°Cに維持されていることを確認します。
  2. スライドをPBSで5分間解凍し、RTで4%PFA溶液に10分間固定します。
  3. 固定後、スライドをPBSで5分間洗浄します。
    注:組織が水分を保つことを確認してください。その後のすべての染色ステップでは、常に液体の中に保管してください。実験を一時停止する必要がある場合は、スライドを RT で PBS に最大 3 時間保存できます。スライドをPBSに一晩保管することは避けてください。
  4. 抗原回収は、蒸し器に水を入れて電源を入れます。脱イオン水の入った瓶と10 mMのクエン酸ナトリウム(pH 6)の入った瓶をスチーマーに入れ、開口部をアルミホイルで覆います。蓋を外さずに、蒸し器の蓋の通気口に温度計を挿入し、アルミホイルに穴を開けて温度を監視し、溶液が~99°Cに達することを確認します。
  5. バッファーが~99°Cに達したら、スライドを脱イオン水に10秒間浸し、抗原回収溶液にすばやく移します。
  6. スライドを~99°Cで15分間インキュベートします。
  7. スライドを1x PBSで3 x 5分間洗浄します。
  8. 疎水性バリアパップペンを使用して各組織切片の輪郭を描き、組織に添加された液体が漏れるのを防ぐ疎水性の周囲を形成します。
    注:その後のPBS洗浄は、組織を取り巻く疎水性の周囲を破壊する可能性があり、更新が必要になります。必要に応じてもう一度描きます。
  9. 150 μLのブロッキングバッファー(1x PBS中の5%血清および0.5%Triton X-100)で組織をRTで60分間ブロックおよび透過処理します。すべての染色ステップには、二次抗体の宿主と同じ種の血清を使用します。
  10. スライドを1x PBSで3 x 5分間洗浄します。
  11. 組織をブロッキングバッファー(1X PBS中の5%血清および0.5%Triton X-100)中の20 μg/mLの一次抗CD45抗体とともに4°Cで一晩インキュベートします。
    注:他の抗体を使用するには、抗体濃度を経験的に検証します。
  12. スライドを1x PBSで3 x 5分間洗浄します。
  13. 組織切片を、AlexaFluor-647と結合したヤギ抗ラット二次抗体をブロッキングバッファー(5%血清)で1:250希釈して、室温で暗所で2時間インキュベートします。
    注:二次抗体を添加した後、蛍光色素の光退色を防ぐために、暗闇の中で後続のすべてのステップを実行します。
  14. スライドを1x PBSで3 x 5分間洗浄します。
  15. 組織をブロッキングバッファー(5%血清)中のブロッキングバッファー(5%血清)中の1 μg/mLのAlexaFluor-594結合抗体とともに、RTで暗所で1時間インキュベートします。
  16. スライドを1x PBSで3 x 5分間洗浄します。
  17. 各腫瘍切片に封入液を一滴加え、カバーガラスに封入剤を数滴塗布します。カバーガラスをスライドに素早く反転させて取り付け、腫瘍の近くに気泡がないことを確認します。
  18. スライドを一晩乾燥させ、共焦点顕微鏡で画像化します。

結果

扱いやすいin vivoリプログラミングプロトコルの概略図を図1に示します。まず、cDC1 指示リプログラミング因子 PU.1、IRF8、BATF3 をコードするポリシストロン レンチウイルス ベクター SFFV-PIB-IRES-eGFP (PIB-eGFP) を作製し、続いて HEK 293T パッケージング細胞株の内部リボソーム侵入部位 (IRES) と増強された緑色蛍光タンパク質 (eGFP) を作製しました。レンチウイルスを介した免疫原性を制御するために、複数のクローニング部位(MCS)とIRES-eGFPを含むが、リプログラミング因子を除外した空のSFFV-MCS-eGFP(eGFP)ベクターを作製しました。ウイルス産生後、レンチウイルス含有上清を回収し、超遠心分離により濃縮しました。形質導入(eGFP+)細胞と形質導入されていない細胞(eGFP-)の比率を1:1に達成するために必要な量を決定するためにウイルスを機能的に滴定し、形質導入後3日目に評価しました。次に、得られたウイルス量を使用して、選択したがん細胞株を-1日目に形質導入しました。24時間後、細胞を採取し、皮下に移植して腫瘍を確立しました。この戦略により、形質導入された細胞がTME内でin vivoでcDC1様細胞に再プログラムされることが保証されました。生着後の指定された時点で、in vivo リプログラミング効率を定量化するための解離腫瘍細胞のフローサイトメトリーや、TME の変化を特徴付けるための凍結保存された腫瘍切片の免疫蛍光染色など、下流の分析のために腫瘍を切除および処理しました。

まず、高いレンチウイルス力価の産生を確実にするために、トランスフェクション前にHEK 293T細胞を監視し、70〜80%のコンフルエントに達することを目標とし、24時間後に蛍光顕微鏡によるeGFP発現によるトランスフェクション効率を評価しました(図2A)。次に、トランスフェクションの48時間後と60時間後にウイルス含有培地を収集し、超遠心分離し、-80°Cでアリコートで保存しました(図2B)。次に、YUMM1.7黒色腫細胞において、eGFP+ とeGFP- 細胞の比率を1:1にするために必要な最適なウイルス量を決定しました。6ウェルプレートにウェルあたり10個の5 YUMM1.7細胞を播種し、レンチウイルスの体積を増やして細胞を形質導入し、24時間後にウイルス含有上清を新鮮なDMEM / F12完全培地に置き換えました(図2C)。3日目に、蛍光顕微鏡でeGFP発現を評価し、フローサイトメトリーによるeGFP + 細胞の正確なパーセンテージの定量化に進みました(図2C)。eGFP+ とeGFP- 細胞の比率を定量化するために、生きた単一細胞をゲートして、死んだ細胞とダブレットを除外しました(図2D)。産生されたレンチウイルスバッチの最適量は、PIB-eGFPと対照eGFPウイルスの両方について、105 YUMM1.7細胞あたり2 μLとして決定され、それぞれ50.0 ± 0.3%および63.0 ± 0.9%のeGFP+ 細胞が得られました(図2E)。

次に、in vivoリプログラミング効率を評価するために、蛍光標識(mCherry+)がん細胞株(YUMM1.7-mCherry)を作製しました。これにより、フローサイトメトリー分析で生mCherry+細胞をゲーティングすることで、がん細胞と間質細胞または免疫細胞を区別できるようになりました(図3A、B)。次に、YUMM1.7-mCherry細胞を105細胞あたり2 μLのPIB-eGFPまたは対照eGFPウイルスで形質導入し、1:1のeGFP+とeGFP-の比率を達成しました。CD45.1マウスに腫瘍あたり1.6×106細胞を皮下移植し、比較のために細胞のアリコートを保持してin vitroで培養しました。フローサイトメトリー、ゲーティングライブmCherry+ eGFP+およびCD45.1-細胞によってリプログラミング効率を評価し、eGFPまたはmCherryを飲み込んだ宿主免疫細胞を除外しました(図3B)。1日目から9日目にかけて、CD45.2および/またはMHC-II発現の段階的な獲得を観察し、部分的に再プログラムされたcDC1様細胞(CD45.2 + MHC-II-またはCD45.2-MHC-II+)および完全に再プログラムされたcDC1様細胞(CD45 + MHC-II+)をマークしました(図3C)。マウスがん細胞のin vivoのリプログラミングは、in vitro条件と比較して9日目にcDC1様細胞の割合が高いことを検証しました(9.54 ± 1.54% CD45+ MHC-II+ in vivo vs. 4.72 ± 1.1% CD45+ MHC-II+ in vitro

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ディスカッション

このプロトコルでは、固形腫瘍からのがん細胞の in vivo リプログラミングに基づいてcDC1様細胞を生成する扱いやすい方法について説明します。私たちの結果は、PU.1、IRF8、およびBATF3の過剰発現が、9日目までTMEにおけるcDC1表現型の段階的な獲得を促進し、その後cDC1様細胞が腫瘍から枯渇することを示しています。最終的に、これは3日目までにTMEへのCD45細胞の浸潤の増加につながり、「免疫冷」TMEのリモデリングを「免疫熱」に引き起こします。

cDC1を生成するための現在のプロトコルには、末梢血からの自己DCの濃縮、CD34+ 造血前駆細胞からの分化、または多能性幹細胞からの分化14、15、16、17、18、19が含まれます。しかし、これらの方法には、不十分な成熟、抗原提示および in vivo でのサイトカイン/ケモカイン産生能力の低下、免疫抑制に対する感受性、高い DC 不均一性、および生成細胞の数の少なさなどの制限要因があります7。ここでは、機能的および機構的研究のために、 in vivoでの cDC1様細胞のスケーラブルな生成を可能にするプロトコルを提供します。

この方法により、転写因子の組み合わせPU.1、IRF8、およびBATF3の発現が in vivo リプログラミングを促進するのに十分であるかどうかをテストしました。移植された遺伝子組み換え細胞の用量を変えることが治療効果に直接影響するため、このプロトコルにより送達効率を正確に制御できます。我々は以前に、0.15%のCD45+ およびMHC-II+ cDC1様細胞に対応する2%の形質導入細胞が抗腫瘍免疫を誘発するのに十分であることを示しました20。さらに、3日目に観察された急速な免疫浸潤は、この時点で完全に再プログラムされたcDC1様細胞の実質的な増加がないため、部分的に再プログラムされたcDC1様細胞が in vivoで機能的に活性であることを示唆しています。将来的には、定義された時点で選択された細胞集団で細胞死を誘導する自殺遺伝子を含む改変ベクターを使用して、抗腫瘍効果における部分的に再プログラムされたcDC1様細胞と完全に再プログラムされたcDC1様細胞の機能的役割を解明することは興味深いでしょう24。このプロトコルはさらに、エピジェネティックなアジュバントとの組み合わせを探索するために使用することができ、再プログラミング効率を高めることができる25。最後に、この方法は、 in vivoで他のDCサブタイプを生成するためにも適応し、抗ウイルスまたは寛容性応答などのさまざまなタイプの免疫応答を開始することができます14。さらに、 in vivo リプログラミングをプラットフォームとして活用し、転写因子の組み合わせのバーコードスクリーニングを実行し、多様な免疫細胞型を生成することができます。この可能性は、特定の免疫サブセットの多様な機能特性を活用することで、治療の柔軟性を高める可能性があります。

以前の研究では、免疫抑制性の in vivo 環境がヒトがん細胞の免疫原性 cDC1s への再プログラミングを妨げないことを実証しました20。この記事では、マウスでは、リプログラミングがin vitroよりもin vivoでより迅速かつ効率的であることを示し、in vivoで観察された強化されたリプログラミングが両方の種にわたって保存された現象であることを示唆しています。ただし、この方法の限界の1つは、最初のベクター送達中にin vivo環境がないことです。したがって、環境の手がかりが生体内送達効率に影響を与えるかどうかを識別することはできません。これは、異なる部分を比較することによってその場で決定する必要があります。アデノウイルスベクターは、in situ送達のためにレンチウイルスベクターよりも効率的であることが特定されており20 、線状、環状、自己増幅RNAまたは低分子カクテルなどの非ウイルス部分と比較することができます2 6,27。

我々は以前に、cDC1 リプログラミングが癌細胞に炎症誘発性サイトカインとリンパ球動員ケモカイン分泌、および専門的な抗原プロセシングを付与し、黒色腫モデルにおける MHC-I および MHC-II の提示を示しました23,28。これにより、TLS形成が誘導され、細胞傷害性エフェクターT細胞、NK細胞、およびB細胞の浸潤が増加し、調節性T細胞や枯渇性T細胞などの免疫抑制集団が減少することにより、TMEが「免疫温熱」状態にリモデリングされます20。患者では、免疫療法に対する陽性反応は腫瘍内のTLSの存在に関連しており、腫瘍抗原に対する持続的なT細胞およびB細胞プライミングが腫瘍特異的抗体応答を生成する29,30。将来的には、この扱いやすい in vivo cDC1 リプログラミング プロトコルを使用して、さまざまながんタイプにわたる誘導された TLS 新生、TME リモデリング、および抗腫瘍免疫のメカニズムを解明し、腫瘍特異的抗体の産生が刺激されるかどうかを特徴付けることを想定しています。

我々は以前に、 in vivo cDC1 リプログラミングと抗 PD-1 または抗 CTLA-4 による ICB との間の相乗効果を観察しました20。これは、cDC1 リプログラミングによって作成された「免疫ホット」TME が、T 細胞受容体 (TCR)-T 細胞、キメラ抗原受容体 (CAR)-T 細胞、または腫瘍浸潤リンパ球 (TIL) を含む ACT などの他の免疫療法との組み合わせ可能な環境を提供する可能性があることを示唆しています。この方法のもう 1 つの利点は、免疫受容体、サイトカイン、ケモカイン、またはリンモトキシンが耐性腫瘍タイプの cDC1 様細胞で過剰発現または枯渇する可能性のある大規模な偏りのない組み合わせスクリーニングまたは CRISPR スクリーニングを実行できるため、cDC1 媒介性免疫の増強における異なる経路の役割を解明します。結論として、 in vivo cDC1 リプログラミングはがん免疫療法における機構研究と治療革新のための柔軟で強力なプラットフォームであるため、現在のプロトコルは幅広い科学コミュニティに貴重なリソースを提供します。

開示事項

C.-F.P.は、in vivo DCリプログラミング技術に基づくがん免疫療法を開発するAsgard Therapeutics ABの株式を持ち、管理職を務めています。C.-F.Pは、付与された特許US 11,345,891、JP 7303743、CN ZL201880005047.3、およびAsgard Therapeuticsが保有する特許出願WO 2018/185709およびWO 2022/243448(E.A.とともに)の発明者であり、ここで説明する細胞リプログラミングアプローチをカバーしています。

謝辞

造血免疫研究所の細胞リプログラミング研究所のメンバーであるマリアナ・ロペス氏とカミーユ・シャトレイン氏に、原稿の編集と校正をしてくださったことに感謝します。

この研究は、スウェーデン研究評議会が資金提供する国立ATMP研究学校の文脈の中で達成されました。ここで議論されるプロジェクトは、欧州連合のHorizon 2020研究イノベーションプログラム(866448-TrojanDC and 101189370)、Novo Nordisk Fonden(NNF22C0079466)、European Innovation Council(101130218-RESYNC)、Cancerfonden(23 2932 Pj)、Swedish Research Council(2020-00615)、Swedish Innovation Agency(2024-02178)、ALF(44410)、FCT(2022.02338.PTDC)、およびPlano de Recuperação e Resiliência de Portugal pelo fundo NextGenerationEUによって共同出資されました。(C644865576-00000005)。クヌート・アンド・アリス・ワレンベルク財団、ルンド大学医学部、スコーネ地方は寛大な財政支援で認められています。

材料の入手可能性:

再プログラミングに使用されるコンストラクトとベクターは、Asgard Therapeuticsとの材料譲渡契約に基づいて入手できます。論文の結論を評価するために必要な他のすべてのデータは、本文または補足資料に記載されています。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.45 & ミュー;m 低タンパク質結合フィルター、150 mLボトルトップ真空フィルターフィッシャーサイエンティフィック15983297
2-メルカプトエタノール 50 mMサーモフィッシャーサイエンティフィック31350010
抗マウスCD45モノクローナル抗体(クローン:30-F11)、ラットIgG2b、κサーモフィッシャーサイエンティフィック14-0451-82
B6.SJL-PtprcaPepcb/BoyCrl (CD45.1)ジャクソン研究所002014
BD マイクロファイン U-100 インスリンシリンジ (0.5 mL)フィッシャーサイエンティフィック11395751
C57BL/6Jマウスジャクソン研究所000664
コラゲナーゼDシグマ・アルドリッチ11088882001
50mlコニカルチューブで使用するためのCorning Falconセルストレーナーシグマ・アルドリッチCLS352340
コーニングカバーグラス 24 x 50 mm シグマ・アルドリッチCLS2975245
DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール、二塩酸塩)サーモフィッシャーサイエンティフィックD1306
DNase Iシグマ・アルドリッチ10104159001
eBioscience 固定可能生存率色素 eFluor 450インビトロゲン65-0863-14
eBioscience IHC 抗原検索液 - 低 pH (10x)サーモフィッシャーサイエンティフィック00-4955-58
ウシ胎児血清 (FBS)サーモフィッシャーサイエンティフィックA5256701
Fluoromount-G 封入剤サーモフィッシャーサイエンティフィック00-4958-02
GFP抗体 [Alexa Fluor 594]ノバスバイオロジカルズNB600-308AF594
Gibco DMEM/栄養混合物 F-12 (DMEM/F-12)サーモフィッシャーサイエンティフィック31331028
Gibco MEM 非必須アミノ酸溶液 (100x)サーモフィッシャーサイエンティフィック11140035
Gibco Opti-MEM Iサーモフィッシャーサイエンティフィック11058021
ギブコ ロズウェル パーク メモリアル インスティテュート (RPMI) 1640 ミディアムサーモフィッシャーサイエンティフィック52400025
ギブコピルビン酸ナトリウム(100 mM)サーモフィッシャーサイエンティフィック11360070
Gibco トリパン ブルー ソリューション、0.4%サーモフィッシャーサイエンティフィック15250061
グルタMAXサプリメント サーモフィッシャーサイエンティフィック35050061
ヤギ抗ラット IgG (H+L) 交差吸着二次抗体、ポリクローナル、Alexa Fluor 488サーモフィッシャーサイエンティフィックA-11006
HEK 293T細胞ATTCのCRL-11268
臭化ヘキサジメトリン(ポリブレン)シグマ・アルドリッチH9268
ハイクローン・ダルベッコの高グルコース改良イーグル培地(DMEM)サイトバSH30243.01
HyClone ペニシリン ストレプトマイシン 100x 溶液 (Pen/Strep)サイトバSV30010
HyClone リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)サイトバSH30028.02
ケタミノール獣医。注射液 100 mg/mLMSDアニマルヘルススウェーデンQN01AX03
ミクロトームブレード - C35PFMメディカル207500005
マウス抗CD45.2(104)、表面、APC、モノクローナルバイオレジェンド109814
マウス抗MHCII(M5/114.15.2)、表面、PE-Cy7、モノクローナルバイオレジェンド107630
ノーマルゴートセラムアブカムアブ7481
ノーマルラット血清(無菌)アブカムAB7488
オープントップ薄肉ポリプロピレンチューブベックマン・コールター・ライフサイエンス326823
パラホルムアルデヒド、16% w/v aq. soln.、メタノールフリーサーモフィッシャーサイエンティフィック043368.9メートル
pFUW-tetO-Batf3、モノシストロンカセットエンコードマウスBatf3アドジーン139837
pFUW-tetO-Irf8、モノシストロンカセットエンコードマウスIrf8アドジーン139838
pFUW-tetO-Pu.1、モノシストロンカセットエンコードマウスPu.1アドジーン139839
プラスミド pMD2.Gアドジーン12259
プラスミドpsPAX2アドジーン12260
プラスミドSFFV-eGFP(eGFP)社内クローン作成-
プラスミドSFFV-mCherry(mCherry)社内クローン作成-
プラスミド SFFV-PIB-eGFP、 マウスPU.1、IRF8、およびBATF3(PIB) をコードするポリシストロンカセット。社内クローン作成-リプログラミングに使用されるコンストラクトとベクターは、Asgard Therapeuticsとの材料譲渡契約に基づいて入手できます
ポリエチレンイミン(PEI)、リニア、MW 25000、トランスフェクショングレードポリサイエンス23966
ReadyProbes 疎水性バリアパップペンサーモフィッシャーサイエンティフィックR3777
酪酸ナトリウムシグマ・アルドリッチ303410
蔗糖シグマ・アルドリッチS7903
SuperFrost Plus 接着顕微鏡スライドエプレディアJ1800AMNZ
Tissue-Tek OCTコンパウンドサクラファインテック4583
TrypLE Express Enzyme (1x) フェノールレッド不使用サーモフィッシャーサイエンティフィック12604021
TT Cryomold Intermediate、正方形 (15 x 15 x 5 mm)サクラファインテック4566
超純度 0.5 M EDTA、pH 8.0インビトロゲン15575020
ザイソル獣医。注射液 20 mg/mLVMファーマQN05CM92
YUMM1.7細胞アンティネオ

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