サンプリングからデータに依存しない取得質量分析までの神経ペプチド特性評価ワークフロー

Summary

このプロトコルは、データ依存の取得-並列蓄積-連続フラグメンテーション(DDA-PASEF)とデータ非依存の取得(DIA)質量分析を組み合わせた、ラット脳組織における包括的な神経ペプチドミクスワークフローの概要を示しています。

Abstract

内因性神経ペプチドは脳機能の重要な調節因子であり、行動、ストレス、痛み、恒常性調節において重要な役割を果たしていますが、その分析は依然として困難です。生物学的には、それらは存在量が少なく、急速に分解され、前駆体タンパク質からさまざまに処理され、発現は小さな局所的な細胞集団に限定されます。技術的には、それらの検出は、広いダイナミックレンジ、多様な翻訳後修飾、および質量分析データセットのまばらな信号によって複雑になります。このプロトコルは、timsTOFプラットフォーム上でデータ依存取得(DDA)とデータ非依存取得(DIA)質量分析(MS)の両方を使用して、 Rattus norvegicus 脳組織における神経ペプチド分析の包括的なワークフローを概説しています。解剖、ペプチド抽出、クリーンアップなどの最適化された脳サンプル調製に続いて、イオンモビリティー気相分画を伴うナノ液体クロマトグラフィー(LC)-MSを実行し、検出感度と精度を向上させます。DDAで生成されたスペクトルライブラリは、SkylineでのDIAベースの定量をサポートし、信頼性の高いMS2レベルの測定を可能にします。この統合されたワークフローにより、神経ペプチドの被覆率が増加し、定量的再現性が向上し、複雑な脳組織内の神経ペプチドを研究するための堅牢なプラットフォームが提供されます。

Introduction

神経ペプチドは、機能的に多様なクラスの内因性シグナル伝達分子であり、ニューロンコミュニケーション、神経および神経内分泌系機能の重要なモジュレーターとして機能します。神経調節物質、ホルモン、または共伝達物質として作用し、痛みの調節、ストレス反応、概日調節、食欲制御などの幅広い生理学的プロセスに影響を与えます。低分子として合成される古典的な神経伝達物質とは異なり、神経ペプチドはmRNAの翻訳によって合成される大きな前駆体タンパク質内にコードされています。前駆体タンパク質、つまりプロホルモンは、タンパク質分解処理を受けて活性ペプチドを放出し、高密度コア小胞(DCV)にパッケージ化されます。刺激を受けると、神経ペプチドが放出され、G タンパク質共役受容体との相互作用を通じて、調節作用を発揮し、通常はより遅く、より長期的な効果を発揮します。中枢神経系および末梢神経系の機能を維持する上でのそれらの重要性により、それらは生物学的および臨床的に強い関心のある分野となっています1,2,3,4,5。

その関連性にもかかわらず、神経ペプチドは依然として分析的に特徴付けが困難です。それらの非常に不均一な構造は、短い配列から拡張配列まで多岐にわたり、多くの場合、アミド化、アセチル化、リン酸化、アミノ酸異性化、または切断などの多様な翻訳後修飾(PTM)を伴い、質量分析(MS)1,6,7,8におけるイオン化およびフラグメンテーション挙動の変動につながります.さらに、それらは通常、生物学的マトリックス成分に比べて低濃度で存在し、分解されやすく、神経系の複雑な組織内に空間的に制限された方法で局在します。これらの特徴は、特に予測可能な酵素消化と均一なペプチ^ド特性9,10,11に依存する従来のプロテオミクスアプローチを使用する場合、同定と定量の両方を複雑にします。

ここでは、神経ペプチドに特に重点を置いて、 Rattus norvegicusの脳内の内因性ペプチドの同定と定量のための包括的な戦略を提示します。ここでのワークフローは、最適化された脳サンプリング手順から始まり、その後広範な液体クロマトグラフィー(LC)分離が続き、トラップドイオンモビリティー分析(TIMS)プラットフォーム^{12、13、14、15、16}で並列蓄積連続フラグメンテーション(PASEF)を使用した高分解能MS分析で終了します.前駆体選択前にイオンモビリティー気相分別(IM-GPF)を組み込むことにより、データ依存取得PASEF(DDA-PASEF)アプローチにより、前駆体分離の改善と、一次元DDAワークフローでは見逃される低存在量の神経ペプチドの検出の強化が可能になります¹⁷。

DDAは、その高品質のMS/MSスペクトルにより、ペプチド同定において依然として最も一般的に使用される戦略ですが、強度による前駆体イオンの選択に依存しているため、本質的に制限されており、存在量の少ない種に偏っています18,19,20。さらに、その半確率的サンプリングにより、反復間で欠損値が発生し、再現性のある定量化が妨げられます。これらの制限を克服するために、DDA-PASEFデータを使用して堅牢なスペクトルライブラリを構築し、その後データに依存しない取得(DIA)分析に使用できます。DDAとは対照的に、DIAは定義されたm/zウィンドウ内のすべての前駆体イオンをサンプリングし、豊富なペプチドと希少なペプチドの両方の一貫したサンプリングを保証し、スペクトルライブラリおよびSkylineのターゲット分析と組み合わせると、高感度で再現性のあるMS2レベルの定量が可能になります21,22,23,24。

脳ペプチド抽出、クロマトグラフィー分離、イオンモビリティー増強MS取り込み、DDA/DIAベースのハイブリッド定量にまたがるこの統合的アプローチは、神経ペプチドの複雑さを念頭に置いて開発されました。データ損失を最小限に抑えながらペプチドのカバレッジを最大化し、より単純なDDA駆動のペプチドミクスの主要な制限に対処します。そのため、哺乳類の脳における神経ペプチドの状況を探索するための柔軟で強力なプラットフォームを提示し、幅広い実験上の質問や組織サンプルに容易に適応できます。

Protocol

この研究のすべての動物実験は、イリノイ州施設動物管理および使用委員会 (23228) によって承認された動物使用プロトコルに従って実施され、動物の倫理的治療とケアに関する国家基準と ARRIVE 基準の両方を厳格に遵守しました。

1. 動物の解剖と脳の隔離

1. 冷生理食塩水灌流を行った直後に組織スナップ凍結を行い、神経ペプチドの完全性を維持し、分解アーティファクトを最小限に抑え、下流のペプチドム分析のデータ品質を向上させます。
2. 施設の動物管理ガイドラインに従って、CO₂ 法を使用してラットを安楽死させます。心拍の欠如と反射神経の欠如による死亡を確認します。
3. ラットを仰臥位に置きます。胸腔を露出させる切開を行います。
4. 心臓の左心室に小さな切開を入れます。
5. 右心房に小さな切開をして、血液と灌流液の流出を可能にします。
6. 50 mLの氷冷生理溶液(0.9%生理食塩水やmGBSSなど)で満たされた60 mLシリンジに取り付けられたサイズに合わせてカットされたプラスチックピペットチップを左心室に挿入します。
7. 溶液で動物の体を灌流します。鋭利なハサミまたはギロチンを使用してネズミの首を切り落とします。
8. 脳を覆っている皮膚と頭蓋骨をロンジャーまたは細いはさみで取り除きます。
9. 脳を頭蓋腔から慎重に持ち上げ、必要に応じて脳神経を切断します。
10. すぐにドライアイスで脳を凍結するか、ドライアイスで冷やしたイソペンタンでスナップフリーズします。
11. 標識されたクライオバイアルまたはホイルに移し、-80°Cで保存します。

2. ラット脳組織からのペプチド抽出

1. 全脳サンプルの場合は、分析天びんを使用して各凍結組織をすばやく計量します。10%の氷酢酸と1%の水をメタノールに含むLC-MSグレードの溶液を、10:1(v/w)の溶媒と組織の比率で使用して、組織を均質化します。
2. 均質化されたサンプルを氷上で20分間インキュベートします。
3. サンプルを16,000 × g で4°Cで20分間遠心分離します。 ペレットを乱さずに上清を慎重に収集します。
4. 10:1(v/w)の溶媒と組織の比率を使用して、ペレットをLC-MSグレードの水に再懸濁し、氷上で20分間インキュベーションを繰り返します。
5. 同じ条件(16,000 × g、20分、4°C)で再度遠心分離し、2番目の上清を回収します。
6. 両方の上清を結合し、総体積の1/10を下流処理のために新しいチューブに移します。このアリコートを真空濃縮器を使用して完全に乾くまで乾燥させます。将来の使用のために、残りの抽出物を-80°Cで保存してください。

3. C18スピンカラムを用いた固相抽出(SPE)

注:すべての溶媒はLC-MSグレードである必要があります。特に明記されていない限り、遠心分離ステップは、卓上遠心分離機を使用して室温で1,500 × g で実行されます。

1. 試薬調製
   1. 活性化液(A):50%アセトニトリル/50%0.1%ギ酸を水中で調製します。
   2. 平衡化を調製し、洗浄液(B):0.1%ギ酸を水中に溶かします。
   3. 溶出液(C):50%アセトニトリル/50%0.1%ギ酸を水中で調製します。
2. サンプル前処理
   1. 乾燥ペプチド抽出物を200 μLの溶液(B)で再構成します。
   2. サンプルを16,000 × g で4°Cで10分間遠心分離します。
   3. SPE用の上清を慎重に収集します。
3. カラムのコンディショニングと平衡化
   1. 150 μLの溶液(A)をC18スピンカラムに加えます。
   2. 1,500 × gで1分間遠心分離します。
   3. 手順 3.3.1 と 3.3.2 を 2 回繰り返して、完全にアクティブ化します。
   4. 150 μLの溶液(B)を加えます。
   5. 遠心分離機で1分間。
   6. 手順 3.3.4 と 3.3.5 を 2 回繰り返します。
4. サンプルのローディングと洗浄
   1. 調製したサンプル溶液200 μLをカラムにロードします。
   2. 遠心分離機で1分間。
   3. フロースルーをカラムに3回リロードして、ペプチドの保持を最大化します。
   4. 150 μLの溶液(B)を加えます。
   5. 遠心分離機で1分間。
   6. 手順3.4.4と3.4.5を3回繰り返して、保持されていない汚染物質を除去します。
5. ペプチド溶出
   1. 150 μLの溶出液(C)をカラムに加えます。
   2. 遠心分離機で1分間。
   3. 溶出ステップ 3.5.1 から 3.5.2 をもう一度繰り返します。
   4. 両方の溶出液を組み合わせて氷上に保管するか、真空下で乾燥させます。

4. LC-MS/MS 分析

1. 溶液(A)を調製します:0.1%ギ酸水溶液。(B):アセトニトリル中の0.1%ギ酸、溶液。(C):25 fmol/μL 保持時間標準 (iRT) 0.1% ギ酸水中。
2. LC-MS注入の前に、サンプルを20 μL溶液(C)に再懸濁します。
   注:2つの生物学的サンプルを分析し、DDAとDIAの両方の実行でそれぞれを5回注入した結果、サンプルごとにメソッドごとに5回の技術的反復が得られました。
3. 高速液体クロマトグラフィー(HPLC)システムを使用して、移動相 A を溶液 (A) から、移動相 B を溶液 (B) から構成してペプチド分離を実行します。
4. 1 μL のサンプルを 25 個の C18 分析カラム(150 μm × 250 mm、粒子 1.9 μm、孔径 120 Å)にロードし、実行中ずっと 40 °C に維持します。
5. 次のグラジエントプロファイルを使用して、600 nL/minの流量でLC分離を実行します:0-5分:2-10%B;5〜85分:10〜45%B;85-87分:45-50%B;続いて、高有機洗浄と再平衡化が続きます。
   注:LCは、イオン源を介してtimsTOF MSに直接結合されました。
6. DDA解析には、timsTOF MSでデフォルトの適用方法 DDA PASEF-standard_1.1sec_cycletime を使用します。
   1. 簡単に言うと、動的除外を有効にしたPASEFモードで質量分析計を操作します。各サイクルは、1.1秒のデューティサイクルで10回のPASEF MS/MSスキャンで構成されるように設定します。
   2. 100.0 msのランプ時間を使用して、質量範囲を m / z 100-1700に、イオン移動度範囲を0.60〜1.60 V·s / cm²に設定します。イオン移動度の関数として衝突エネルギーを20.0eVから59.0eVに上昇させます。
7. イオンモビリティー気相分別(IM-GPF)
   1. 0.6-1.6 V·s/cm² のイオン移動度範囲を、0.6-1.0、0.9-1.3、および1.2-1.6 V·s/cm²の3つの重複するウィンドウに分割します。
   2. これを行うには、timsControlまたはtimsControlエディタのTIMS設定タップでモビリティの開始値と終了値を対応するウィンドウ値に変更します。
   3. ウィンドウごとにデータを取得します。すべてのイオンモビリティー取得ウィンドウで、100 msの一定の蓄積時間とランプ時間を使用します。
   4. DDA-PASEFモードで、ステップ4.6で詳述したのと同じパラメータを使用してデータを集録します。
8. DIA分析では、400〜1200 m/zの質量範囲で25 m/zの分離ウィンドウ幅を採用します。DDA法で使用したのと同じイオンモビリティー実験(IMEX)設定を採用します。
   1. 追加のDIA設定には、1つのMS1ランプと1サイクルあたり16MS/MSランプが含まれ、合計サイクルタイムは1.8秒になります。
   2. デフォルトのプロテオミクスDIA-PASEF法をDIA法開発のテンプレートとして使用します。DIAメソッドを作成したら、Hystarのメソッドタブにロードします。DIAモードのアクティブ化は必要ありません。
      メモ: DIA メソッドは、正常にロードされると自動的に登録されます。

5. データ処理

注:データ取得後、ペプチド同定は、PEAKS Online、PEAKS Studio、MSFragger、Maxquant、または同様のプラットフォームなどのバイオインフォマティクスツールを使用して実行する必要があります。この調査では、.d形式の生データを処理できるPeaks Onlineを使用しました。

1. データベース検索
   1. ペプチド検索には、キュレーションされたラットシグナル伝達ペプチドデータベース、ラットプロテオーム、ヒトプロテオーム、またはサンプルソースに基づくキュレーションされたシグナル伝達ペプチドデータベースなど、適切な参照データベースを使用します。
      注:これらのデータベースは、NCBIやUniProt(https://www.uniprot.org/)などの信頼できるソースから入手できます。データベース内のタンパク質またはペプチドのみが識別されることに注意してください。ラットシグナルデータは、UniProtの 「シグナルペプチド」 アノテーションによってラットプロテオームをフィルタリングすることによってキュレーションされました。Uniprotの用語では、「 シグナルペプチド」 によるフィルタリングとは、プロテオームを分泌、膜局在化、またはコンパートメント輸送に関与するタンパク質に絞り込むことを意味します。このカスタムデータベースには、5630のタンパク質が含まれています。タンパク質データベースのサイズを50,000から5,000に制限すると、いくつかの利点があります。まず、ランダムなペプチドとスペクトルの一致の可能性を減らすことで同定の信頼性を高め、それによってペプチド割り当ての精度を高めます。第二に、データベースが小さいほど計算効率が向上し、処理時間が短縮され、計算リソースの需要が削減されます。第三に、より簡潔なデータベースは、誤発見率(FDR)のより適切な制御につながり、その結果、より信頼性が高く、統計的に堅牢なタンパク質同定が可能になります。ただし、信頼度スコアの人為的なインフレや不正確なFDR推定を避けるために、データベースは比較的大きくする必要があります。
   2. プログラムGUIで、次の推奨パラメータを使用してデータベース検索を構成します。前駆体質量誤差許容度:10-25 ppm;フラグメント質量誤差許容度:0.01-0.05 Da;酵素特異性:なし(非特異的消化);ペプチドの長さの範囲:4〜45アミノ酸。
   3. 検索に含める PTM のセットを定義します。
   4. データベース検索が完了したら、標準のフルモビリティー範囲(0.6-1.6 V・s/cm²)を含む、各イオンモビリティーウィンドウに対応するpepxmlおよびmzXML(またはMGF)ファイルをエクスポートします。
2. スカイライン図書館の建設
   1. Skyline を開いて新しいドキュメントを作成し、 プロテオミクス インターフェイス が選択されていることを確認し、特に指定がない限り デフォルト設定 を使用します。
   2. [ファイル]> [インポート]> [ペプチド検索]に移動します。
   3. ペ プチド検索のインポート ウィザードで、[ ビルド] を選択し、関連するpepxmlファイルを追加します(対応するmzXMLまたはMGFファイルが同じディレクトリにあることを確認してください)。
   4. [iRT 標準ペプチド] を [自動] に設定し、ワークフローとして [DIA] を選択して、[次へ] をクリックします。
   5. ライブラリー構築後、反復間でアライメントするためのiRT標準として約10〜15個のペプチドを選択します。iRT の再キャリブレーションを求められたら、[ OK ] をクリックして続行します。
   6. [ クロマトグラムの抽出 ]ページで、[ 参照 ]をクリックしてすべての DIA raw ファイルを選択してインポートし、[ 続行]をクリックします。
   7. 遷移設定ウィンドウで、前駆体電荷範囲を1〜5に、製品電荷範囲を1〜3に、イオンタイプを、p、y、bに設定し、イオン2から最後のイオンまでプロダクトイオンの選択を定義します。その他の推奨設定:イオンマッチ許容誤差:0.05 Da、ピックするピーク:5。
   8. ペプチド設定ウィンドウで、4.1.3で説明されているピーク検索設定に一致する変更を設定します。
   9. [ 分離スキーム] ページで、分離とスキームの名前を入力し、[ 事前に指定された分離ウィンドウ] を選択します。 インポート をクリックしてDIAファイルの1つをロードし、実験の分離ウィンドウ構成を自動的にインポートします。
   10. フルスキャン取得設定は、次のパラメーターで設定します。取得方法:DIA;製品質量分析装置:重心;分離スキーム: 上記で定義したものを使用します。質量精度:10-20 ppm;モビリティ分解能:30-50;[予測された RT から 5 分以内のスキャンのみを使用する] を有効にします。オプションで、MS1 クロマトグラムのインポートが必要な場合は、MS1 フィルタリングを変更します。最適な MS1 クロマトグラム抽出のために、適切な質量分析装置と分離能を選択してください。
   11. FASTAをインポートし、おとりを生成します。デコイの生成方法:シャッフルシーケンスを設定します。
   12. 酵素の選択:消化は内因性ペプチド分析では非特異的です。酵素のドロップダウンメニューから [ 追加 ] を選択して、酵素を編集します。酵素の名前を設定し、 Type をbothに設定し、 c-terminal をKRに切断し、 n-terminalをKRに切断 し、半切断を許可して OKをクリックします。 ミス・クリーブを 3に設定します。
   13. ターゲットの FASTA ファイルをインポートし、[ 完了] をクリックします。プロンプトが表示されたら、 関連するタンパク質ページ を確認します。
   14. スペクトルライブラリが正常に作成され、DIAデータがインポートされていることを確認します。同定されたペプチドのリストを手動で検査し、下流の定量的および定性分析に進みます。
3. 定性的および定量的測定
   注:定性的および定量的分析はSkylineで行われます。SkylineでのDIAデータの解析については、https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorial_dia_swath をご覧ください。
   1. DDAデータが読み込まれている場合は、メニューから[設定]>[遷移設定]を選択し、[取得方法]で[DDA]を選択します。[設定]>[ペプチド設定]で、定量用にMS 1レベルを選択します。
   2. DIAデータが読み込まれている場合は、[ 設定]>[遷移設定]で[ 取得方法]で[DIA]を選択します。[ 設定]>[ペプチド設定]で、定量用にMS 2レベルを選択します。
   3. [View > Document Grid]で、[Peptide Quantification]、[スプレッドシートのエクスポート]の順に選択します。DDA結果とDIA結果のスプレッドシートを結合します。
      注:スプレッドシートは、すべてのサンプルにわたるライブラリ内のすべてのペプチドのピーク面積を要約したものです。この実験では、ペプチドピーク面積を、Pierce保持時間混合物の一部である保持時間標準ペプチドGISNEGQNASIKに正規化しました。正規化は、各ペプチドのピーク面積と標準物質のピーク面積の比率を計算することによって実行されました。

Results

代表的な実験スキームを 図1に示します。標準イオンモビリティー範囲とIM-GPFの両方を使用して取得したDDA-PASEFデータ(図2)の分析により、IM-GPFアプローチのペプチドカバレッジが大幅に高いことが明らかになりました(図2B)。特に、標準的なDDA-PASEF法を使用して同定されたほとんどのペプチドは、IM-GPFデータセットで見つかったものと重複していました。ペプチド同定カバレッジを最大化するために、両方のアプローチからの同定を統合することにより、包括的なスペクトルライブラリーが生成されました。

厳選されたラットシグナル伝達ペプチドデータベースを使用して、DDAおよびDIA-PASEFを介して取得された複製データセット(図3)のさらなるデータベース分析により、両方の方法に共通する217のタンパク質が明らかになりました。さらに、115のタンパク質がDIA-PASEFによって一意に同定され、69のタンパク質はDDA-PASEFに排他的でした。DDAおよびIM-GPFデータから得られたスペクトルライブラリを利用した探索的分析により、DIA-PASEFがNPAFLFQPQRF(神経ペプチドSF)やYGGFMRRVGRPEWWMDYQ(プロエンケファリン由来)などの神経ペプチドを確実に検出できることが実証されました。これらの神経ペプチドは、ピーク割り当てが不十分なため、対応するDDA-PASEFデータセットで確実に検出されませんでした(図3B、C)。

定量的な観点から見ると、 図4A の散布図は、両方のアプローチが同じペプチドを定量するが、異なるイオンタイプを捕捉することを考えると、予想通り、DDA前駆体強度とDIAフラグメントイオン強度の間に中程度の正の相関があることを示しています。 図4B に示す選択されたペプチドの箱ひげ図は、両方のアプローチで得られた定量的測定値の再現性をさらに示しています。箱ひげ図は、DIAおよびDDAで測定された各ペプチドの相対的なピーク面積を示し、エラーバーは技術的反復間の測定変動性を表します。選択されたペプチドは、プロエンケファリン (PENK) やプロジノルフィン (PDYN) などのオピオイド プロホルモンに由来しており、どちらも痛みと鎮痛の調節に中心的な役割を果たします。

図1:ラット脳組織からの内因性ペプチドの同定と定量のためのペプチドミクスワークフローの概要。 ワークフローには、組織解剖、ペプチド抽出および精製、気相分別(IM-GPF)を使用したLCイオンモビリティー-MS(LC-IM-MS)データ取得、およびスペクトルライブラリの生成と定量分析を実行するためのデータ処理が含まれます。Figure の一部は BioRender で作成されました。タン、Y. (2025) https://BioRender.com/vrejrsk。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:データベースペプチドとタンパク質の同定。 (A)異なるイオンモビリティーウィンドウで同定された前駆体、ペプチドスペクトル一致(PSM)、および固有のペプチドの総数を比較した棒グラフ。(B)すべてのモビリティウィンドウで一般的に同定されたペプチドの割合と、個々のウィンドウ内で一意に検出されたペプチドの割合を示す円グラフ。(C、D)移動度範囲全体(0.6-1.6 V·s/cm²)(C)および移動度制限ウィンドウ(0.6-1.0 V·s/cm²)(D)のm/zおよびイオン移動度寸法にわたるイオン信号の分布を示すヒートマップ。(E)DDAおよびDIA法を使用して取得されたデータセットで同定されたタンパク質の数を示すアップセットプロットで、共有された固有のタンパク質同定を強調しています。(F)DIA獲得反復(上パネル)およびDDA獲得反復(下パネル)で同定されたプロエンケファリン前駆体に由来するペプチドを表すヒートマップ。4回のDDA反復のうち2回でロイエンケファリンは検出されておらず、DDAベースの取得における潜在的な欠損値を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:スペクトルライブラリを使用したDDA-PASEFおよびDIA-PASEFデータの比較および探索的分析。 (A)DIAおよびDDA-PASEF複製にわたる神経ペプチドSFの保持時間アライメント。(B)DIA(上)およびDDA(下)データセットからのPENK(212-229)フラグメントイオンのEIC。(C)DIAレプリケートからのニューロペプチドSFのフラグメントイオンクロマトグラムは、高い共溶出とスペクトル品質を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:DIA-PASEF(MS2レベル)とDDA-PASEF(MS1レベル)の定量的測定の比較。 (A)この散布図は、DIAモードとDDAモードを使用して得られたペプチドシグナル強度を比較します。具体的には、x軸はDDAからのlog₁₀変換前駆体ピーク面積を表し、y軸は各ペプチドのDIAからのlog₁₀変換フラグメントピーク領域を示します。(B)箱ひげ図は、PENK 107-133、PENK 188-195、PDYN 221-233、およびPDYN 235-248の4つの代表的なペプチドの相対ピーク面積を表しています。エラーバーは、技術的な反復間の変動性を表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

Discussion

ペプチドミクスでは、特に内因性ペプチドを分析する場合、天然ペプチドプロファイルを保存することは、データの完全性と生物学的解釈に不可欠です。冷たい生理食塩水灌流は血液を除去するだけでなく、脳を冷やすため、内因性プロテアーゼの活性により急速に発生する死後のタンパク質分解を大幅に減少させます。脳温度を下げることにより、酵素活性が遅くなり、循環プロテアーゼが血管系から洗い流されると同時に、死後の代謝変化も減少します^25,26。氷のように冷たい生理食塩水を灌流すると、脳の血管系から血液も洗い流されます。血液には神経ペプチドの検出を妨げる可能性のある高存在量のタンパク質(アルブミンやグロブリンなど)と循環プロテアーゼが含まれているため、このステップは特に重要です。豊富な血液タンパク質の死後分解は、神経ペプチド抽出物の複雑さを増し、低存在量のシグナルを隠蔽し、最終的に同定と定量の両方を損なう可能性があります25,26,27。ドライアイス上または冷やしたイソペンタンでの急速凍結により、脳組織を即時凍結すると、酵素プロセスがほぼ瞬時に停止します。この保存は、存在量が少ない完全長の成熟神経ペプチドを検出し、信頼性の高い定量を確保するために特に重要です。これらの手順を踏まないと、ペプチドの分解によりばらつきが増加し、同定と定量の両方が損なわれるアーティファクトが発生する可能性があります。したがって、採血、冷灌流、および急速な脳冷却は、測定前のペプチドミクスデータの品質、感度、再現性に直接影響する基本的な技術です。

ラット脳から抽出したペプチドの分析により、2つの異なるイオン移動度プルームの存在が明らかになりました(図2C、D)。この現象は、異なる分子クラスまたはペプチドのさまざまな電荷状態に起因する可能性があります。プルームが異なる分子クラスに対応する場合、共溶出する非ペプチド種は、選択と断片化のためにペプチドと競合する可能性があります。また、電荷状態の違いから分離が生じた場合、高電荷ペプチドを含むプルームは、より高品質のMS/MSスペクトルを生成することが期待され、より信頼性の高いペプチド同定が容易になります。

これを調査するために、イオン移動度分別戦略を実装し、0.6-1.0、0.9-1.3、および1.2-1.6 V·s/cm²の3つの離散移動度ウィンドウにわたってデータを取得しました。これらのウィンドウは、ペプチドの標準的なDDA-PASEF実験で通常分析されるイオン移動度範囲全体にまたがっています。 図2に示すように、検出された前駆体の総数は全スキャン範囲(0.6-1.6 V·s/cm²)で最も多かったが、0.6-1.0 V·s/cm² ウィンドウ内で有意に多くのペプチドスペクトルマッチ(PSM)が観察された。この発見は、2つのプルームの存在が実際に他の分子からの干渉によるものである可能性があることを示唆しています。

イオンモビリティーベースの前駆体分画により、従来のフルスキャン法と比較してペプチド被覆率が30%増加しました。フルスキャンデータセットで同定されたペプチドの約82%が、分別を使用して同定されたペプチドと重複しており(図2B)、分別戦略の一貫性と堅牢性が強調されています。これらの観察に基づいて、イオン移動度分別とフルスキャンデータを使用して、DIA-PASEFを使用した神経内分泌ペプチドの定量分析のためのスペクトルライブラリを構築しました。

DDAおよびDIAを介して取得した複製データセットのデータベース解析により、DIAデータでは、DIAによって一意に同定された115のタンパク質を含む、より多くのペプチドおよびタンパク質同定が明らかになりました(図2E)。これらには、Pro-FMRFamide 関連ペプチド FF および VF などの神経ペプチドが含まれていました。対照的に、69のタンパク質はDDAによって排他的に同定され、その多くは細胞接着とニューロンの発達に関連しています。これらの知見は、DDAとDIAの方法論を補完的な方法で適用して、より広いペプチドカバレッジを達成できることを示唆しています。

さらなる分析により、DIAの取得は、DDAを使用した内因性ペプチド分析で頻繁に遭遇する欠損値の問題の一部に効果的に対処できることが実証されました。たとえば、Leu-エンケファリンは 4 回の DDA 反復のうち 2 回のみで検出されましたが (図 2F、下のパネル)、4 回の DIA 反復すべてで一貫して同定されました (図 3F、上のパネル)。

定量的プロテオミクスに広く使用されているプラットフォームであるSkylineは、DDAデータセットとDIA-PASEFデータセットの両方の分析に利用されました²⁸。このソフトウェアは、スペクトルライブラリマッチング、フラグメントイオン共溶出、および保持時間アライメントを通じてペプチドの同定を容易にします。欠損同定を減らすDIA-PASEFの能力を評価するために、DIAデータセットでのみ検出されたペプチドの定性的評価を実施しました。

図3Dに示すように、神経ペプチドSFは、同じ保持時間枠内のすべてのDIA反復で一貫して検出されました。DDA反復での検出は、25分から45分の範囲の保持時間で、かなりのばらつきを示しました(図3A)。図3Bに示すように、信頼度スコアの低いピークの誤割り当てを含む観察された不整合は、フラグメントイオンのカバレッジが限られているか、品質が低いことが原因である可能性があります。対照的に、図3Cは、ニューロペプチドSFに対応するフラグメントイオンがすべてのDIA複製にわたって十分に整列していることを示しており、信頼性の高い自動同定を支えています。

プロエンケファリン由来のPENK(212-229)ペプチドのMS/MSスペクトル品質の比較により、DIA-PASEFの利点がさらに実証されました。DIAから得られたスペクトルは、DDAと比較して高い強度と改善されたフラグメントイオン品質を示し(図3)、これは存在量の少ない内因性ペプチドの検出に特に有益です。

定量分析により、DIA-PASEFは、DDAに匹敵する性能で、生物学的反復全体で一貫した再現性のある測定値が得られることが確認されました(図4)。さらに、DIAはMS2レベルでの定量を可能にし、MS1ベースのDDAと比較してフラグメントイオンレベルの特異性とペプチド同定の信頼性を高めました。これらの知見は、特にデータの完全性と再現性が重要な場合に、複雑な生物学的マトリックスにおける標的神経ペプチド定量のための信頼性が高く効率的なアプローチとしてDIA-PASEFを使用することを裏付けています。

このプロトコルは、神経ペプチドの分析と定量のための包括的な戦略を概説します。IM-GPFアプローチは、高品質のスペクトルライブラリの構築を容易にします。DIA-PASEFは、DDA-PASEFと比較して再現性が向上し、ペプチドカバレッジが増加する一方で、MS2ベースの定量も強化されます。両方の取り込み戦略を組み合わせると、それぞれの方法が個別のペプチドの同定に独自に寄与するため、全体的なペプチドカバレッジが増加します(図2E)。このプロトコルの限界は、スペクトルライブラリの生成とDDAおよびDIA-PASEF法によるデータ収集の両方をサポートするための十分なサンプル材料が必要であることです。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1%ギ酸ウォーター	ッシャーサイエンティフィック	LS118-500	LC/MSグレード
酢酸	フィッシャーサイエンティフィック	A11350	LC/MSグレード
アセトニトリル	フィッシャーサイエンティフィック	AA47138K7	LC / MSグレード
ギ酸	ッシャーサイエンティフィック	PI28905	LC/MSグレード
ノール	フィッシャーサイエンティフィック	AA47192K7	LC/MSグレード
nanoELute2	Bruker	N/A
Pierce C18スピンカラム	Fisher Scientific	AA47192K8
Pierce ペプチド保持時間校正混合物	Thermo Fisher	A11351	LC/MS グレード
SpeedVac 真空濃縮器	Genevac	https://scientificproducts.com/product_cat/benchtop-solvent-evaporators/	この研究で使用した特定のモデルは、メーカーから入手できなくなりました。現在の同等モデルへのリンクは、参考
timsTOF Pro2	Bruker	https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mass-spectrometry/timstof/timstof-pro-2.html
Water	Fisher Scientific	AA47146M6	LC/MSグレード