方法論記事

SCAnED - 表皮および真皮皮膚コンパートメントにおける半自動細胞および核検出のためのオープンソースの皮膚セグメンテーションマクロ

DOI：

10.3791/68746

⸱

2025年8月8日

 ,  , 
1Department of Dermatology, Medical University of Vienna

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、皮膚セグメンテーション用の無料のImageJベースのマクロであるSCAnEDを使用して、皮膚切片の免疫細胞と非免疫細胞を同定および定量するための半自動プロトコルを紹介します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

組織内の免疫細胞と非免疫細胞の空間分布と細胞特異的マーカーの発現は、その 場での細胞機能に関する重要な情報を提供します。人間の皮膚は、多様な表現型を持つさまざまな細胞で構成される明確なコンパートメントを持つ非常に複雑な器官です。多蛍光標識を使用することにより、異なる皮膚細胞集団を決定し、さらに特性評価することができます。しかし、現在、表皮または真皮内の細胞を単一細胞解像度でイン シリコ でセグメンテーションできる皮膚サンプルの画像解析のための非商用ツールの利用可能性は限られています。ここでは、無料で入手できるツールSCAnED(Skin Compartment Analysis of Epidermis and Dermis)を使用した皮膚切片の免疫蛍光染色、共焦点顕微鏡、および画像分析のための段階的なプロトコルを提供します。SCAnEDマクロは、ヒトの皮膚の表皮と真皮の両方のコンパートメントにある細胞と核の正確な識別と分類を可能にします。細胞質や核などのさまざまな細胞や細胞コンパートメントにおけるメーカー発現の平均強度レベルを決定する方法と、Google Colabで実行されるすぐに使用できるJupyterノートブックとして提供される付属のPythonパイプラインを使用して、さまざまな量のこれらのマーカーを発現する細胞を定量する方法に関するガイドラインを提供します。このプロトコルにより、経験の浅いユーザーでも皮膚組織内の細胞特異的発現プロファイルを決定し、表皮および真皮コンパートメント内の細胞の空間分布に関する洞察が得られ、人間の皮膚の複雑な組織構造と細胞組成をより深く理解できるようになります。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

細胞レベルで皮膚組織を理解し、表皮と真皮の両方のコンパートメント内での細胞表現型、形態、およびそれらの局在を識別することは、皮膚科学研究と組織病理学において極めて重要です1,2。ケラチノサイト、メラノサイト、ランゲルハンス細胞を含む表皮内の細胞組成は、健康な状態では、炎症性皮膚疾患やがんでは大幅に不均衡になります。さらに、表皮の下に位置し、線維芽細胞と免疫細胞の大部分を保有する真皮内の細胞の表現型と局在は、疾患において大きく変化する可能性があります。したがって、細胞および核のセグメンテーションは、細胞数、タンパク質発現、形態および空間組織などの細胞属性、およびサイズ、形状、転写因子発現などの核特性を評価するために不可欠であり、それによって皮膚の恒常性と疾患の理解を助けます3,4,5。

QuPath6、CellProfiler7、ilastik8などの汎用画像解析プラットフォームが利用可能であるにもかかわらず、これらのツールは、皮膚組織の構造の複雑さや不均一な細胞形態に適応するために、広範なカスタマイズとスクリプト作成を必要とすることがよくあります。表皮と真皮のコンパートメントの自動セグメンテーション用に特別に調整されたツールはほとんどなく、利用可能なソリューションの多くは商用であり、自由にアクセスできません。これらの制限により、専門家でない人が皮膚固有の分析のための効率的なパイプラインを実装することが困難になります。

ここでは、半自動画像解析パイプラインを使用した組織染色から画像解析までのすべての重要なステップをカバーする、皮膚組織とそのコンパートメント内の細胞と核を分析するための包括的なプロトコルを提示します。表皮/真皮セグメンテーションのためのE-カドヘリンによる染色や、細胞/核検出のための4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)による染色など、皮膚組織の免疫蛍光染色に関する詳細な情報から始めます。検証の目的で、ビメンチン(VIM)とCD90の2つのマーカーが含まれていました。再現性を確保するために、最適化された濃度の抗体を使用し( 表1を参照)、レーザー強度、露光時間、解像度を一貫した設定で共焦点顕微鏡を使用して画像をキャプチャすることをお勧めします。

さらに、カスタム設計のImageJ9 マクロSCAnED( Skin Compartment Analysis of Epidermisと Dermisの略)を紹介し、表皮と真皮の両方の核と細胞のイン シリコ セグメンテーションと検出に必要なすべてのステップを提供します。ユーザーは、SCAnEDプロトコルに進む前に、シンプルで高速な閾値処理、またはディープラーニングツールStarDist10 とトレーニングされた皮膚モデルのいずれかを使用して、2つの異なる核検出方法から選択できます。一般的なツールとは異なり、SCAnEDは皮膚組織学専用に開発されており、表皮と真皮領域の自動区画化と、両方の領域にわたる複数のマーカーの統合定量化を可能にすることで、それらを上回っています。これは、プログラミングやディープラーニングの専門知識が不足している研究者にとって特に役立ち、肌画像分析に合わせたすぐに使用できるツールを提供します。

さらに、最大5つの異なる目的のマーカーの免疫蛍光画像から、細胞あたりの平均強度レベルがどのように抽出されるかを示します。最後に、Google Colab11 で記述・実行し、Jupyterノートブックとして共有した取得したシングルセルデータの統計解析のためのPythonコードを提供します。当社のプロトコルとSCAnEDマクロは、高度な免疫蛍光とコンピューティングの専門知識を持たない皮膚研究者に、表皮と真皮のコンパートメントに焦点を当てて、ヒトの皮膚の細胞とマーカーの発現を標識および半自動定量化するための実用的なツールを提供することを目的としています。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. E-カドヘリン、VIM、CD90の免疫蛍光標識、パラフィン包埋皮膚切片におけるDAPIによる核染色

注:プロトコルは、パラフィン包埋切片の手順を示しています。新鮮および凍結組織サンプルの場合は、組織切片を固定し、プロトコルのステップ1.3に進みます。

  1. ファンまたはオーブンを使用してパラフィンを溶かします。
  2. 水分含有量が増加する段階的なアルコール(例えば、キシレン→100%エタノール→85%エタノール→70%エタノール→水)を通過して切片を再水和します。
  3. 抗原に応じて抗原検索ステップを実行します。
  4. PBS中の0.3%Triton Xで組織切片を透過処理します(3 x 20分)( 表2を参照)。
  5. PBSでスライドを洗浄します(1 x 5分)。
  6. 各サンプルを疎水性スライドマーカーペンで囲み、液体のこぼれを防ぎ、試薬の量を最小限に抑えて乾燥させます。
  7. 一次抗体(Absのバッファー:PBS + 2%BSA)を適用します( 表1 および 表2を参照)。スライドを加湿チャンバーボックス(ウェットボックス)に入れ、一晩インキュベートします。
  8. PBS中の0.3%Triton Xでスライドを洗浄します(3 x 5分)。
  9. スライドをPBSで洗浄して余分な洗剤を取り除きます(1 x 5分)。
  10. 二次抗体とヤギ血清を適用します( 表1を参照)。スライドを暗所で1時間インキュベートします。
  11. PBS中の0.3%Triton Xでスライドを洗浄します(3 x 5分)。
  12. スライドをPBSで洗浄して余分な洗剤を取り除きます(1 x 5分)。
  13. 核染色用のDAPIを追加します( 表1を参照)。スライドを暗所で30分間インキュベートします。
  14. PBS中の0.3%Triton Xでスライドを洗浄します(3 x 5分)。
  15. PBSでスライドを洗浄します(1 x 5分)。
  16. 蛍光封入剤を各サンプルに1液滴(~5〜15 μL)塗布し、カバーガラスを慎重に置きます(必要に応じて気泡を取り除きます)。スライドを暗所で乾燥させます。
抗体と色素作業集中希釈
抗ビメンチン抗体0.8 μg/mL1:50
抗E-カドヘリン抗体1 μg/mL1:333
抗CD90抗体1:1000
AF488 アンチマウス1:500
AF568アンチウサギ1:500
AF647アンチマウス1:500
DAPIの1 μg/mL

表1:抗体と色素。

1.染色バッファー
試薬最終濃度量
BSAの2%1グラム
PBSの1倍50ミリットル
トータル該当なし50ミリットル
2. 透過処理バッファー
試薬最終濃度量
トリトンX0.30%300 μL
PBSの1倍100ミリットル
トータル該当なし100ミリットル

表2:ソリューションのレシピ。

2. 共焦点イメージング

注:このプロトコルでは、10倍の対物レンズ(NA 0.4)と4本のレーザーライン(405 nm、488 nm、561 nm、640 nm)を備えた共焦点レーザー走査顕微鏡を使用しました。

  1. 蛍光顕微鏡を使用して画像を取得します( 図1の画像例を参照)。
  2. 次のスキャン サイズ パラメーターを使用して、マクロを作成し、StarDist モデルをトレーニングし、理想的には画像取得に使用します: 画像サイズ = 4,096 x 4,096 ピクセル (または 1,273 x 1,273 ミクロン)、ビット深度 = 16 ビット、最小ピクセル サイズ = 0.3 ミクロン、信号対雑音比 (SNR) = 最小 3。

figure-protocol-1
図1:皮膚切片の免疫蛍光染色。 DAPI:核を標識、CD90:線維芽細胞マーカー、E-カドヘリン:表皮の標識に使用、VIM:VIM発現細胞、マージ:DAPI(マゼンタ)、CD90(青)、E-カドヘリン(黄色)、およびVIM(緑)染色のマージ。スケールバー = 100μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. SCAnEDマクロを用いた画像解析(補足ファイル1、補足ビデオS1、補足ビデオS2)

  1. マクロ(SCAnED.mp4ムービー)を開始します。
    1. デフォルト設定のBio-Formatsを使用して、Fiji/ImageJで免疫蛍光画像を開きます。
      メモ: このステップではチャンネルを分割しないでください。
    2. SCAnEDマクロをダウンロードして実行し、プラグイン|マクロ |SCAnED マクロ・スクリプト (補足ファイル 1) を実行して選択します。
    3. マクロによって提供される画面上の段階的な指示に従います。
  2. SCAnEDマクロを用いた表皮と真皮のインシリコセグメンテーション
    1. プロンプトが表示されたら、E-カドヘリンチャネルを選択します。
    2. [ 画像] |調整 |しきい値をクリックし 、E-カドヘリン チャネルの OKをクリックして、表皮領域を完全にキャプチャします。
    3. 必要に応じて、ImageJの[ Flood Fill Tool ]アイコンを選択し、表皮の上部をクリックして[ OK ]をクリックして、E-カドヘリンマスクのギャップを閉じる[Flood Fill]ステップを確認します(図S1A-E およびディスカッションセクションのトラブルシューティングのヒント)。
    4. マスクが反転している場合は、選択を反転するように求められたら、[ はい ]と[ OK ]を選択します。それ以外の場合は、[ いいえ ]と[ OK ]を選択します(説明セクションの補 足図S1F、G およびトラブルシューティングのヒントを参照)。
    5. プロンプトが表示されたら、DAPI チャネルを選択します。表皮-真皮セグメンテーションの前後の核画像を 図2に示します。
  3. 閾値関数を用いた核セグメンテーション
    1. 強度レベルを自動定義します。
  4. StarDistを用いた核セグメンテーション
    1. ImageJでStarDistを開きます(図3)。
    2. 核検出モデル(補足ファイル2)をStarDist GUIにロードします(図4)。StarDistモデルを作成するための対応するトレーニングペアを補 足図S2に示します。
      注:StarDistエラーが発生した場合は、このモデルにTensor Flowバージョン1.15を使用する必要があります( 補足図S3を参照)。
    3. 最初に核チャネルをクリックします。
    4. それに応じてタイル設定を調整します(タイルの数が予想されるパッチサイズ(256 x 256 px)と一致していることを確認します( 図3 および 図4を参照)。
      注:StarDistセグメンテーションは、核の数によっては時間がかかる場合があります。
  5. 核タンパク質の強度測定と定量
    注: SCAnED を実行する前に、[ 分析] |測定を設定し 、パラメータを設定して、正確で適切なデータ出力を保証します(図5)。
    1. プロンプトが表示されたら、[ はい ]を選択して、核内のマーカー強度を測定します。
    2. 適切なマーカーチャンネルを選択します(最大5つまで)。
    3. マクロの指示に従って、結果をCSVファイルとして保存します。
    4. チャンネルごとに繰り返します。
    5. すべてのチャネルが処理されたら、マクロの指示に従って結果を CSV ファイルとして保存します。
      注:より良い視覚化のために、残りの分析のために特定の皮膚領域の拡大ビューを含めました(図6)。
  6. 細胞セグメンテーション(細胞質領域)
    注:細胞セグメンテーションは核ROIの拡大に基づいているため、核セグメンテーション後に開始する必要があります。
    1. しきい値関数が核セグメンテーションに使用されている場合は、バイナリ拡張を適用します。
    2. StarDistを核セグメンテーションに使用した場合は、処理時間が長い拡大拡張を使用します( 補足図S4を参照)。
  7. 細胞質タンパク質の強度測定と定量
    1. [ はい ]を選択すると、細胞全体のマーカー強度を測定できます。
    2. マクロの指示に従って、結果のCSVファイルを保存します。
    3. マーカーチャンネルごとに順番に繰り返します。
    4. 出力データの一貫性を維持するために、核と細胞の両方の測定で同じチャネルの順序を維持します。
    5. 表皮と真皮の間で核データが混在しないように、マクロプロンプトが表示されたらいつでも 破棄 を選択します。 図 7 は、しきい値ベースのセグメンテーションのすべてのステップを示しています。

figure-protocol-2
図2:表皮および真皮核におけるチャネル特異的核の分析と分離。 DAPIの免疫蛍光染色は、皮膚全体の核の形態と空間分布を示しています(左の画像)。DAPIで染色された表皮核の核チャネル表現により、表皮コンパートメント内の核の分布に関する洞察が得られます(中央の画像)。DAPIで染色された真皮核の核チャネル表現により、真皮コンパートメント内の核分布を視覚化します(右の画像)。スケールバー = 100μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-3
図3:「StarDist」オプションの使用 メニュー/Plugins/StarDist/StarDist 2D 内の「StarDist 2D」オプションの場所を強調表示するスクリーンショット。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-4
図4:核検出モデルの使用手順。 「nuclei_detection_model.zip」ファイルをダウンロードし、[ 参照 ] セクションにそのファイル パスを入力します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-5
図5:測定設定の構成。(A)メニュー内の[測定値を設定]オプションの場所を強調表示し、後続の分析のために測定パラメータをカスタマイズできるスクリーンショット。(B) 測定設定を調整するためのインターフェイスを表示する測定設定ボックスで、ユーザーはデータ収集と分析のためのパラメータを指定できます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-6
図6:特定の領域の拡大図。 (A)DAPI(マゼンタ)とVIM(緑)染色のマージ。(B)Aからの特定の領域の拡大ビューで、皮膚組織内のVIM発現を詳細に視覚化します。表皮と真皮内の核の形態が異なることに注意してください。スケールバー = 100 μm (A)、20 μm (B)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-7
図7:閾値を使用した核と細胞の表皮と真皮のSCAnEDセグメンテーション。 (A)全体像:DAPI(マゼンタ)とVIM(緑)染色のマージ。上部:(B)分離後にDAPIとVIMで染色した表皮核の融合。(C)閾値を使用した表皮核のマスク。(D)DAPIとVIMのマージに重ねられた表皮核の核セグメンテーションは、表皮コンパートメント内の核分布の視覚化を助けます。(E)DAPIとVIMのマージに重ねられた表皮核の細胞セグメンテーションは、選択領域が核よりも大きいことを示すため、閾値と拡張を使用して表皮コンパートメント内の核分布の視覚化を支援します。下部:(F)分離後にDAPIとVIMで染色した真皮核の融合。(G)閾値を使用した真皮核のマスク。(H)DAPIとVIMのマージに重ねられた真皮核の核セグメンテーションは、真皮コンパートメント内の核分布の視覚化を助けます。(I)DAPIとVIMのマージに重ねられた真皮核の細胞セグメンテーションは、真皮コンパートメント内の核分布の視覚化を助けます。スケールバー = 20 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

4. 抽出した単一細胞データの分類と可視化(補足動画S3)

注:各免疫蛍光マーカーは、表皮コンパートメント用と真皮コンパートメント用の2つのCSVファイルを生成します。

  1. アイソタイプコントロールサンプルを使用して、マーカー固有の強度閾値を確立します。
    1. SCAnEDマクロによって生成されたCSV出力ファイルを、提供されたJupyter Notebookを使用してGoogle Colabにインポートします。まず、適切なJupyter Notebook( 補足ファイル3 や 補足ファイル4など)をダウンロードし、Google Colab(https://colab.research.google.com/)に移動し、「ファイル」をクリックしてノートブックを開き、ファイルを選択し、コードセルを1つずつ実行します。[ ファイルを選択] というプロンプトが表示されたら、ボタンをクリックして.csvファイルをアップロードします。
    2. 各抗体について、アイソタイプコントロールから平均蛍光強度を計算します。各抗体のカットオフを決定するには、DotPlotノートブック(補足ファイル4)を開き、対応するアイソタイプコントロールファイルをアップロードして、コードを実行します。
    3. アイソタイプコントロールと特異的抗体プロットのドット分布に基づいて、適切な強度閾値を選択して、バックグラウンド(アイソタイプコントロール)とシグナル(特異的染色)を分離します。これらの値をカットオフとして使用して、個々のセルをマーカー発現の陽性または陰性として分類します。
  2. 実験サンプルのマーカー強度を計算された閾値と比較します。
    1. 強度≥閾値を持つ細胞を陽性として分類します。
    2. 強度<しきい値を持つ細胞を負として分類します。
    3. マーカー発現の組み合わせに基づいて亜集団を分類し、たとえば、単一陽性、二重陽性、または三重陽性の細胞集団を識別します。
  3. マーカー式の分布と関係を、次の 2 種類のプロットを使用して視覚化します。
    1. ヒストグラムコードを実行して、ヒストグラムを作成し、ヒストグラムをオーバーレイして、条件(対照肌と病変肌など)間の強度分布を比較します(補足ファイル3をダウンロードし、Google Colab(https://colab.research.google.com/)にアクセスし、[ファイル]をクリックしてノートブックを開き、ファイルを選択し、コードを実行します)(図8)。
    2. ドットプロットを作成して、フローサイトメトリースタイルの散布図をシミュレートして、共発現パターンを評価するためのドットプロットを作成します(補足ファイル4をダウンロードし、Google Colab(https://colab.research.google.com/)にアクセスし、[ファイル]をクリックしてノートブックを開き、ファイルを選択し、コードを実行します)(図9)。
    3. 統計検定を使用して、追加の分析と有意差の評価のために処理されたデータをエクスポートします。

figure-protocol-8
図8:VIM陽性細胞の平均強度を比較したオーバーレイヒストグラム。 真皮内の健康なサンプル (H) の青色と乾癬サンプル (P) のオレンジ色の VIM 細胞の平均強度を比較するヒストグラム オーバーレイ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-9
図9:ドットプロット上の二重正の信号。 単一陽性、二重陽性、および二重陰性集団のより良い視覚化に役立つ二重染色ドットプロットのデモンストレーション。この例は、(A)健康な皮膚と(B)乾癬の皮膚の真皮、および(C)健康な乾癬の皮膚サンプルの表皮におけるCD90とVIMの二重染色を示しています。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

以前の研究では、SCAnEDを使用して、ヒト皮膚の真皮内の細胞における細胞と細胞質タンパク質であるリシルオキシダーゼ(LOX)と転写因子低酸素誘導因子1(HIF-1)の発現レベルを検出および定量することに成功しました12 、皮膚研究へのこのツールの適用性を強調しました。

表皮および真皮コンパートメント内の細胞および核の識別における皮膚セグメンテーションマクロの精度をさらに評価するために、パラフィンが埋め込まれた健康および炎症を起こした乾癬皮膚組織サンプルを、核および表皮/真皮のセグメンテーションのためのDAPIおよびE-カドヘリンで染色し、VIMおよびCD90を代表的なマーカーとして組み合わせました。III型中間フィラメントであるVIMとCD90はどちらも、線維芽細胞などの真皮の間葉系細胞で主に発現しており、ランゲルハンス細胞、他の免疫細胞、メラノサイトなどのいくつかの表皮細胞もこれらのマーカーを発現します13,14。...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SCAnEDプロトコルは、ヒト皮膚組織の免疫細胞と非免疫細胞の両方のコンパートメント特異的分析のための半自動方法です。このワークフローは、E-カドヘリンベースの染色プロトコルを統合して、表皮と真皮のセグメンテーション、DAPIベースの核と細胞の検出を可能にし、その後、ImageJベースのマクロを使用して核と細胞のマーカー発現を定量化します。さらに、抽出された単一セルデータを視覚化するためのPythonワークフローの分析をユーザーにガイドします。このプロトコルは柔軟性があり、最大5つの異なる対象マーカーの分析をサポートします。

SCAnEDの強みの1つは、表皮と真皮の領域を区別できることです。細胞の区画化された分析は、感染または炎症中の特定の皮膚領域への免疫細胞浸潤を標的とする研究において、正確な定量化に不可欠です。たとえば、健康な皮膚サンプルと炎症性皮膚疾患乾癬患者の皮膚を比較したところ、健康な皮膚の表皮には VIM 陽性細胞の 5% しか存在しないのに対し、この値は乾癬サンプルでは約 8% に増加することが明らか...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この画像解析パイプラインの開発は、ドナウ川アレルギー研究クラスターの一部としてLand NiederösterreichとFellinger Krebsforschungによって資金提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.3% トリトン X シグマ・オルドリッチT9284
BSA(牛血清アルブミン)シグマ・オルドリッチ
CD90細胞シグナル伝達D3V8A
DAPI ロシュ10236276001
脱イオン水
E-カデリン アブカムAB1416
蛍光マウント培地およびダコS3023
ヤギ抗マウスIgG1交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 488 (AF 488 アンチマウス)サーモフィッシャー・サイエンティフィックA-21121
ヤギ抗マウスIgG2a交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 647(AF 647抗マウス抗体)サーモフィッシャー・サイエンティフィックA-21241
ヤギ抗ウサギIgG(H+L)交差吸着二次抗体、Alexa Fluor 568(AF 568 抗ウサギ抗体)サーモフィッシャー・サイエンティフィックA-11011
ヤギ血清 アジレント・テクノロジーズ&OUML;sterreich GmbH、ダコX0907
PBS ギブコ14190-094
ヴィメンティン ダコM7020
<ストロング>マテリアルズ
チャンバーボックス(ウェットボックス)
カバースリップ サーモ・フィッシャー
液体をはじくスライドマーカーペンで、着色(疎水性) 大堂上業Z37782124×50mm
Solutions
透過バッファー(PBS中の0.3% Triton X)およびnbsp;表2を参照してください
染色バッファー(PBS中の2% BSA) 表2を参照してください
Software and Datasets
共焦点レーザー走査顕微鏡 オリンポス逆さまのIX83をベースにしたFV300010倍対物レンズ(NA 0.4)、4本のレーザーライン(405 nm、488 nm、561 nm、640 nm、コヒーレント)を装備
フィジー(ImageJ) V1.54h
Google Colabググる
GraphPadプリズム グラフパッド・ソフトウェア株式会社プリズム10さらなる統計解析のために
後光インディカ・ラボ
PythonプログラムPython 3.11.12
クパスオープンソフトウェア(Bankhead, P. et al, https://doi.org/10.1038/s41598-017-17204-5)v0.5.1
スターディストTF1.15.0のCPUバージョンをインストールする

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lichtenberger, B. M., Kasper, M. Cellular heterogeneity and microenvironmental control of skin cancer. J Intern Med. 289 (5), 614-628 (2021).
  2. Watt, F. M. Mammalian skin cell biology: at the interface between laboratory and clinic. Science. 346 (6212), 937-940 (2014).
  3. Bergstresser, P. R., Pariser, R. J., Taylor, J. R. Counting and sizing of epidermal cells in normal human skin. J Invest Dermatol. 70 (5), 280-284 (1978).
  4. Régnier, M., Patwardhan, A., Scheynius, A., Schmidt, R. Reconstructed human epidermis composed of keratinocytes, melanocytes and Langerhans cells. Med Biol Eng Comput. 36 (6), 821-824 (1998).
  5. Régnier, M., Staquet, M. J., Schmitt, D., Schmidt, R. Integration of Langerhans cells into a pigmented reconstructed human epidermis. J Invest Dermatol. 109 (4), 510-512 (1997).
  6. Bankhead, P., et al. QuPath: Open source software for digital pathology image analysis. Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).
  7. McQuin, C., et al. CellProfiler 3.0: Next-generation image processing for biology. PLoS Biol. 16 (7), e2005970(2018).
  8. Berg, S., et al. ilastik: interactive machine learning for (bio)image analysis. Nat Methods. 16 (12), 1226-1232 (2019).
  9. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  10. Schmidt, U., Weigert, M., Broaddus, C., Myers, G. Cell detection with star-convex polygons. Medical Image Computing and Computer Assisted Intervention - MICCAI 2018. Frangi, A., Schnabel, J., Davatzikos, C., Alberola-Lopez, C., Fichtinger, G. 11071, Springer. Cham. Lecture notes in Computer Science 265-273 (2018).
  11. Google Colab. , Google. https://colab.research.google.com/ (2025).
  12. Balsini, P., et al. Stiffness-dependent lysyl oxidase regulation through hypoxia-inducing factor 1 drives extracellular matrix modifications in psoriasis. J Invest Dermatol. 1145 (7), 1653-1669.e10 (2024).
  13. Mahrle, G., Bolling, R., Osborn, M., Weber, K. Intermediate filaments of the vimentin and prekeratin type in human epidermis. J Invest Dermatol. 81 (1), 46-48 (1983).
  14. de Waal, R. M., Semeijn, J. T., Cornelissen, M. H., Ramaekers, F. C. Epidermal Langerhans cells contain intermediate-sized filaments of the vimentin type: an immunocytologic study. J Invest Dermatol. 82 (6), 602-604 (1984).
  15. Bata-Csorgo, Z., Hammerberg, C., Voorhees, J. J., Cooper, K. D. Flow cytometric identification of proliferative subpopulations within normal human epidermis and the localization of the primary hyperproliferative population in psoriasis. J Exp Med. 178 (4), 1271-1281 (1993).
  16. Nakamura, Y., et al. Expression of CD90 on keratinocyte stem/progenitor cells. British Journal of Dermatology. 154, 1062-1070 (2006).
  17. Wetzel, A., et al. Increased neutrophil adherence in psoriasis: role of the human endothelial cell receptor Thy-1 (CD90). J Invest Dermatol. 126 (2), 441-452 (2006).
  18. RRID:SCR_018350. , Indica Labs. https://www.indicalab.com/halo/ (2025).

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