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方法論記事

シナプシスおよび組換えの評価のためのマウス卵母細胞からの減数分裂染色体スプレッドの調製

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DOI:

10.3791/68749

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2025年7月18日

1Department of Biomedical Sciences, Cornell University, 2Cornell Reproductive Sciences Center, Cornell University

この記事について

サマリー

シナプスと組換えの減数分裂エラーは、哺乳類の卵母細胞に共通しています。これらのプロセスに関与するタンパク質の厳密な分析は、卵子形成がどのように、そしてなぜしばしばうまくいかないのかを理解するために不可欠です。ここで紹介する技術により、組換えとシナプスを包括的にモニタリングし、マウスの卵子の質を評価することができます。

要約

3つの重要で相互依存的なプロセスが減数分裂前期Iを定義します:相同染色体は互いに対になる必要があり、シナプトネマ複合体と呼ばれるタンパク質性構造は相同体をつなぎ合わせるために形成され(シナプス)、相同体は組換えを受け、遺伝物質を相互に交換してクロスオーバー(CO)を形成します。これらのプロセスのエラーは、早期卵巣機能不全、異数性、そして最終的には流産や不妊につながる可能性があります。減数分裂組換えは卵子で特にエラーが発生しやすく、ヒト卵子の7%以上がクロスオーバーなしで少なくとも1つの染色体ペアを含み、卵子の20%〜80%に対して精子の2.5%〜7%が異数性です。しかし、染色体異常がなぜこれほど顕著な性差を示すのかは、いまだにわかっていません。本プロトコルは、胎児マウスおよび若年マウスからの卵母細胞前期I染色体および中期I染色体スプレッドの調製および分析の方法をそれぞれ説明する。減数分裂前期I全体の重要な染色体動態を追跡するために、このプロトコルは、減数分裂組換えの一般的なマーカー(二本鎖切断のためのRAD51、CO中間体のMSH4、およびほとんどのCOを識別するためのMLH1 / MLH3)およびシナプス(染色体軸のためのSYCP3、シナプス領域のためのSYCP1、および非シナプス領域のためのHORMAD1)の免疫蛍光染色を採用しています。さらに、このプロトコルは、中期Iにおける対になった染色体(二価)およびクロスオーバー(キアズマ)の総数を評価するために収集された卵母細胞の in vitro 成熟を使用します。これらの技術は、女性の減数分裂における初期の染色体動態を調節するメカニズムを調べるための包括的かつ定量的なフレームワークを提供します。

概要

減数分裂は、一倍体配偶子の産生に不可欠な特殊な細胞分裂です。前期Iでは、相同染色体(それぞれがコヒーシンによって結合された姉妹染色分体からなる)は、3つの重要なタスクを達成する必要があります:1)互いに認識してペアになる、2)それらの側軸間にシナプトネマ複合体(SC)を形成することによって一緒にジッパーを合わせる、および3)相同組換えを介してDNAを交換し、非姉妹染色分体間のクロスオーバー(CO)をもたらす1,2.コヒーシンによって維持されるクロスオーバー形成に起因する物理的結合は、中期I3,4,5中の適切な染色体の二配位と分離を保証します。

減数分裂前期Iは5つの段階からなり、各段階はシナプシス6の状態によって定義される。レプトネマ(ギリシャ語で細い糸)では、軸要素(SYCP3でマーク)が染色体軸に沿って形成されるときに染色体が凝縮します。ザイゴネマ(結合された糸)の間、SCの横要素(SYCP1)が軸7の間に形成されるにつれて、相同体がシナプスを形成し始める。パキネマ(太い糸)では、染色体はその全長に沿ってシナプスされています。その後、SCはディプロネーマ(2つの糸)の間に分解され、交差部位(chiasmata)でのみホモログが接続されます。キアズマタは、DNA二本鎖切断(DSB)のプログラムされた誘導によって開始されるプロセスである相同組換えの産物です。数百のDSBのうち、COになるのは~10%だけです。マウスでは、ほとんど(90%-95%)がMutLγによって促進されるクラスI CO経路(MLH1-MLH3)を介して形成され、残りのCOはMUS81-EME1によって産生され、クラスII CO経路8,9,10,11を介して形成されます。

ペアリング、シナプス、および組換えは、高度に制御され、相互依存的なプロセスです。通常、エラーはチェックポイントメカニズムを引き起こし、細胞死につながります。女性では、初期の前期Iエラーによる生殖細胞の喪失は、早期卵巣機能不全を引き起こす可能性があり12,13、一方、晩期エラー(例えば、COの形成に失敗するホモログ、COの不適切な配置、または早期のコヒーシン喪失)は、染色体のミスグレッションおよび異数性につながる可能性があります。人間では、減数分裂エラーは流産と不妊の主な原因です。女性の減数分裂は特にエラーが発生しやすいです。ヒトの卵子の約20%〜80%(精子の2.5%〜7%)は異常な染色体数を持っており、そのほとんどは最初の減数分裂のエラーに起因します14,15,16,17。年齢は母性異数性の最大の原因として特定されていますが、卵子がエラーを起こしやすい理由は不明のままです。

卵子の高いエラー率の根底にある要因を理解することの重要性にもかかわらず、前期Iイベントの調節に関する私たちの知識のほとんどは、男性の減数分裂の研究から来ています。成体の精巣材料の小さな断片は、減数分裂および減数分裂後の生殖細胞のすべての段階を評価するのに十分な材料を提供するため、男性の減数分裂は長い間研究者にとってより容易にアクセスできてきました。対照的に、女性の減数分裂は不連続な方法で発生します。マウスでは、前期Iは胎児の卵巣で半同期的に進行し、性交後約14日から始まります(dpc;図1A)、性腺の性決定18,19,20の直後。出生の頃、卵母細胞は排卵月(マウス)または数十年(ヒト)まで口述停止に入ります21,22,23。その結果、特定の前期I期は限られた発達期にのみアクセス可能であり(図1A)、前期I後のイベントは、若年および成人の一度に数個の卵子でのみ発生します。技術の進歩により、哺乳類の卵子減数分裂研究は改善されましたが、これらの方法は、男性の研究で使用される同等の技術と比較して、依然として困難で時間がかかります。

雌減数分裂解析は、サブステージのパキテン卵子の制限によってさらに複雑になります - クロスオーバーの指定と成熟を研究するために重要です。男性の研究は、十分に特徴付けられた性染色体対形成のダイナミクスと、初期、中期、および後期のパキネマ24,25,26のマーカーとして機能するヒストン変異体H1tの存在から恩恵を受けています。しかし、パキテン卵母細胞のサブステージに対する信頼できる方法は定式化されていません。

ここで紹介するプロトコルは、初期前期Iから中期Iまでのマウス卵子のシナプスと組換えの包括的な分析を容易にします。この研究は、Peters et al.27 と Tarkowski28 によって開発された古典的な染色体拡散技術と、Hunt29 と Sun and Cohen30 によるこれらの方法の以前の改良に基づいています。このプロトコルは、1)特定の前期Iサブステージの濃縮と同定、2)胎児卵巣のペアごとに実行されるアプリケーションの数を最大化すること、および3)シナプス欠損の評価と病巣からキアズマへの組換えのための徹底的でアクセス可能な指標を強調するために開発されました。

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プロトコル

すべての動物の取り扱いと手順は、プロトコル2004-0063に基づくコーネル大学動物管理および使用委員会(IACUC)の承認後に実施されました。

1. 卵母細胞前期I染色体スプレッドスライドの作製

  1. 午後遅くに、C57BL/6J雌マウス(生後2〜6か月)と雄マウス(生後2〜12か月)の時限交配を設定します。翌日から、毎朝(午前9時前)にメスに交尾プラグがないかチェックします。プラグの日の正午は 0.5 dpc と定義されています。
  2. 妊娠中のマウスを犠牲にする前に、以下を準備してください。
    1. 室温H2Oの加湿チャンバーを設置します。
    2. Milli-Q 水に 30 mM Tris-HCl、50 mM スクロース、17 mM クエン酸ナトリウム、5 mM EDTA、2.5 mM DTT、および 0.5 mM PMSF からなる 10 mL の低張抽出バッファー(HEB;表 1 を参照)を調製します。DTTとPMSFを添加する前に、50 mMのホウ酸を使用してpHを8.2〜8.4に調整します。HEBを新鮮にして、DTTを追加してから2時間以内に使用してください。
    3. 100 mM スクロースを 10 mL の超高純度 H2O に 342 mg スクロースを加えて調製します。使用しないときは 4 °C で保存してください。
    4. 超高純度H2Oを標準マイクロ波で1分間(90〜95°Cまで)予熱します。ヒュームフードの下で、加熱した超高純度H2Oを0.5 gのパラホルムアルデヒド(PFA)に加えます。1 N NaOHを2滴加え、ボルテックスで混合し、室温まで冷まします。50 mMのホウ酸を使用してpHを9.2〜9.3に調整し、Triton X-100を0.15 %(v/v)まで添加します。超高純度H2Oを最終容量50 mL(1% PFA固定液)に加え、50 mLガラス製Coplin染色ジャーに固定液を注ぎます。
      注:このプロトコルは、PFAを調製するために沸騰に近い水を使用して最適化されました。ただし、PFAを溶液中で65°C以上に加熱すると、劣化して有毒ガスが放出される可能性があります。あるいは、超高純度H2Oをウォーターバスで60°Cに予熱します。
    5. 70%エタノールでスライドするきれいなガラス顕微鏡。疎水性バリアPAPペンを使用して、最大3つの正方形(約20 x 20 mm、 図1Eを参照)を描きます。1組の卵巣は、6つの正方形(またはそれぞれ3つの正方形の2つのスライド)に十分な材料を提供します。
  3. IACUCガイドラインに従って、CO2 窒息および子宮頸部脱臼による妊娠マウス14.5 - 18.5 dpcを犠牲にします。
    1. C57BL/6JマウスにおけるプロフェーズIの特定の段階の濃縮のタイムポイントを 図1Aに示します。所与の発生時点について、前期Iの各段階における卵子のおおよその割合は、Evansら(1982)31からのデータを用いて提供されている。接合子卵母細胞の場合は、16.5 dpcで収集します。17.5 DPCの初期のパキテン。および中パキテン - ジプロテンは18.5 dpcです。
  4. 解剖ハサミを使用して腹腔を開き、子宮角を取り除きます。
  5. 子宮角、脱落膜組織、および卵黄嚢から胎児マウスを解剖します。マウスの胎児を、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む100 mmのシャーレに入れます。
  6. 一度に1人の女性胎児から卵巣を解剖し、残りは1x PBSで維持します。IACUCガイドラインに従って、胎児マウスを斬首して犠牲にします。ステンレス製の試料ピンを使用して、胴体の腹面を解剖皿のシリコンパッドまで固定します。
  7. マイクロダイセクションハサミを使用して、臍のすぐ下に腹部を切開し、動脈を傷つけないように注意します。細い鉗子を使用して、胎児の子宮角が見えるまで腸を変位させます。
  8. 卵巣を見つけるには、各子宮角を膀胱から腎臓に向かって外側にたどります。卵巣と卵管は、腎臓のすぐ下、腹腔の後部近くに位置する子宮角の末端に小さな小球構造として現れます(図1B)。
  9. 細い鉗子を使用して卵巣をつまみ、750μLの1x PBSで満たされた小さな時計グラスに卵巣を集めます。
  10. 周囲の組織から卵巣を切開し、卵巣が完全に水没するように注意しながら、750μLのHEBが入ったウォッチグラスに両方の卵巣を置きます( 図1C および 1Dを参照)。卵巣を室温で15分間インキュベートします。
  11. 100 mMスクロース35 μLを凹面スライドにピペットで移します。細い鉗子を使用して、両方の卵巣をHEBからスクロースに移します。
  12. 25Gの針を使用して卵巣をスライドに固定し、2本目の針を使用して斜角にして卵巣から卵子を押し出します。
    1. 卵巣が透明でゼリー状になったら、HEBから卵巣を取り出し、2番目の卵巣でこのプロセスを繰り返します。溶液を静かにピペットで動かして細胞を分散させます。
  13. スライドをPFAのCoplin染色ジャーに浸し、スライドの端をペーパータオルで軽くたたきます。PFAを各正方形の疎水性境界に沿って小さな滴に集めたら(図1E)、卵子-スクロース溶液を5 μLをPFAの各滴にピペットで注入します。
  14. スライドを前後にゆっくりと傾けて、卵子を正方形の部分に広げます。1つの正方形の溶液が隣接する正方形にこぼれないように注意してください。
  15. スライドを湿ったチャンバーに入れ、卵子ショ糖溶液がなくなるまでスライドの作成を続けます。
  16. すべての女性胎児が使用されるまで、手順1.6〜1.15を繰り返します。スライドを湿ったチャンバー内で室温で2時間インキュベートします。
  17. インキュベーション後、湿ったチャンバーを開きます。ほとんど(すべてではないにしても)液体/固定剤はスライド表面(各正方形のセクションで約10μL)にまだ存在するはずなので、スライドをペーパータオルに静かに移し、スライドを実験室のベンチで室温で完全に風乾させます(このプロセスには、地域の湿度にもよりますが、通常30〜60分かかります)。
    注:スライドは、残留PFAガスへの潜在的な曝露を軽減するために、ヒュームフードの下で風乾することもできます。これにより、乾燥も約20〜30分に短縮されます。
  18. スライドを0.4%湿潤剤で超高純度H2O中で2分間洗浄します。スライドを完全に乾かします。
    注:この時点で、スライドは-80°Cで保存できます。ただし、特定のエピトープは不安定です(たとえば、私たちの経験では、MLH1の染色は不十分であり、SYCP3の染色には凍結後に重大なアーティファクトがあります)。スライドは直ちに免疫染色することを強くお勧めします。

2. 前期I染色体スプレッドの免疫蛍光染色

  1. 10% (v/v) Normal Goat Serum、3% (w/v) ウシ血清アルブミン (BSA)、および 0.05% Triton X-100 を 1x PBS に含有する 10x 抗体希釈バッファー (ADB; 表 2 を参照) を調製します。0.45μmフィルターを使用してフィルター滅菌し、4°Cで最大2週間保存します。
  2. 0.4%湿潤剤を入れたCoplin染色ジャーでスライドを1x PBSで10分間洗浄します。0.1% Triton X-100 の Coplin 染色ジャーでスライドを 1x PBS で 10 分間洗浄します。1x ADBのCoplin染色ジャーで10分間スライドします。
  3. 選択した一次抗体を10x ADBで希釈します(抗体のリストとそれぞれの希釈については 、材料の表 を参照してください)。
    1. マルチプレックス免疫染色用の抗体の4つの組み合わせを調製します:(1)SYCP332,33、SYCP133、HORMAD133;(2)SYCP332,33、RAD5132,33、MLH332;(3)SYCP332,33、MSH432、MLH332;(4)SYCP334、MLH1 32,33,34、CREST 35。
  4. ADBからスライドを取り出し、余分な液体を軽くたたいて、室温の水を入れた加湿チャンバーにスライドを置きます。各スライドの正方形セクションごとに30 μLの希釈抗体を塗布し、1つの正方形の抗体が隣接する正方形にこぼれないように注意してください。
  5. 加湿チャンバーを閉じ、スライドを室温で一晩インキュベートします。
  6. 翌朝、湿潤チャンバーを開き、スライドから希釈した抗体を取り出します。手順2.2を繰り返します。
  7. 選択した二次抗体を10x ADBで希釈します( 材料の表を参照)。
    注:この時点から、スライドと抗体は感光性になります。その後のインキュベーションはすべて暗闇で完了します。
  8. ADBからスライドを取り出し、余分な液体を軽くたたいて、室温の水の加湿チャンバーにスライドを置きます。各スライドの正方形セクションごとに、選択した希釈抗体30 μLを、1つの正方形の抗体が隣接する正方形にこぼれないように注意して塗布します。
  9. 加湿チャンバーを閉じ、スライドを室温で2時間インキュベートします。
  10. スライドを1x PBS中の0.4%湿潤剤のCoplin染色ジャーでそれぞれ3回5分間洗浄します。スライドを超高純度H2O中の0.4%湿潤剤のCoplin染色ジャーで5分間洗浄します。
  11. 4'、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)または同等の核酸染色剤を塗布した退色防止封入剤を少量(約10 μL)塗布します。60 mm x 24 mm No.1.5ガラスカバースリップを各スライドに置き、余分な液体を慎重に拭き取ります。
    注:スライドは、透明なマニキュアまたはゴムセメントで密封できます。硬化封入剤を使用する場合、スライドをシールする必要はありません。スライドは、4°Cのスライドボックスまたはフォルダーに保管する必要があります。 染色後すぐにスライドを画像化することがベストプラクティスですが、私たちの経験では、4°Cの暗闇で保存されたスライドは、数か月から1年間信号強度を保持することができます。長期保存の場合、キープスライドは信号品質を大幅に損なうことなく、数年間-20°Cに保つことができます。
  12. 落射蛍光顕微鏡を用いて細胞を63倍で画像化します( 材料の表を参照)。画像解析ソフトウェア(Zen of ImageJなど、 Table of Materialsを参照)を使用して、軸に沿ったすべてのチャネルのSCの長さと蛍光強度を測定します。各染色体軸(SYCP3)の長さをセントロメア(CRESTまたはDAPI密集領域)からトレースします。
    1. HORMAD1およびSYCP1の分析では、蛍光シグナルのピークの長さを記録します。HORMAD1ピークまたはSYCP1ピークの全長を計算し、それらを染色体軸の長さで除算します。
    2. MSH4 の分析では、SYCP3 の各測定における蛍光シグナルのピーク数を定量化します。原子核あたりの MSH4 ピークの総数と、MLH3 ピークと重なる MSH4 ピークの数の両方を記録します。ピークを対応する病巣カウントと比較することにより、MSH4 のカウントを確認します。

3. キアズマの観察のためのジアキネシス/前中期調製

  1. 減数分裂能力のある卵子の収量を最大化するには、幼若の雌マウス(25〜28日齢)を使用します。
    注:卵子採取の48時間前に、雌マウスに5IUの妊娠牝馬の血清ゴナドトロピン(PMSG)を腹腔内注射することにより、収量を増やすために刺激を行うことができます。.しかし、キアズマタ解析の目的のために、刺激を受けていない女性から十分な胚小胞(GV)卵子を採取することができる。
  2. マウスを生贄にする前に、以下の試薬と溶液を調製してください。
    1. M2(マウスあたり3 mL)とKSOM(マウスあたり1 mL)を細胞培養インキュベーター(37 °C、5 % CO2)で少なくとも1時間平衡化します。
      注:凍結培地アリコートのチューブは、卵子採取の前夜に蓋を緩めた状態でインキュベーターに入れることができ、約14時間の平衡化が可能になります。
    2. 2.5 μMミルリノン(減数分裂の再開を防ぐホスホジエステラーゼアイソザイム阻害剤)36でM2培地を調製します。20 μLのM2 + ミルリノンを5滴滴35 mmのシャーレにピペットで移し、軽質鉱物油で覆います(図2C)。
    3. 20 μL KSOMを5個分35 mmのシャーレにピペットで滴下し、軽質鉱物油で覆います(図2C)。
      注意:温度とpHの制御は、卵子のin vitro成熟にとって重要です。卵子の収集は、加熱された(37°C)ベンチトップで行う必要があります。すべての培地は、使用するまでインキュベーターに保管し、周囲の空気への曝露による混乱を制限するために、培地の皿を一度に1つずつ取り出す必要があります。
    4. 70%エタノールでスライドし、風乾させるきれいなガラス顕微鏡。顕微鏡ガラススライドの裏側に、~4 mm x 4 mm の正方形の 5 x 5 グリッドを (ひし形ペンで) 軽く切り込むか (耐水性インクで) 描きます (例を 図 2B に示し、グリッドをトレースするために使用できます)。
  3. 一度に1匹のマウスから卵子を採取します。IACUCガイドラインに従って、CO2 窒息と頸部脱臼によって雌マウスを犠牲にします。
  4. 解剖ハサミを使用して腹腔を開きます。細い鉗子を使用して腸を変位させます。
  5. 膀胱から腎臓に向かって各子宮角をたどります。卵巣と卵管は、腎臓の近くの小さな脂肪パッドに関連付けられます。
  6. マイクロダイセクションハサミを使用して卵巣を取り出し、ミルリノンと一緒にガス化したM2培地に入れます。
  7. マイクロダイセクションハサミを使用して、卵巣からすべての脂肪と他の組織(滑液包を含む)を取り除きます。25Gの針を使用して胞状卵胞を破裂させます。
  8. トランスファーピペットを使用して、メディアが皿の側面に触れないように注意しながら、100 mmのシャーレにM2 +ミルリノンの卵子を薄い層に広げます(図2C)。
  9. 解剖顕微鏡(倍率25倍〜50倍)を使用して、GV卵子を視覚化します(図2F)。GV卵子は、卵丘-卵母細胞複合体(COC)の卵丘細胞と関連している可能性があります。ピペッティングを繰り返して卵丘細胞を除去します。
  10. 口操作式ガラスピペット(直径100〜150μm; 図2A)。軽質鉱物油で重ね合わせたM2 + ミルリノンの20 μL滴にGV卵子を移します(図2C)。1滴に30個以上の卵子を入れないでください。
  11. すべてのGV卵子を採取したら、軽質鉱物油を重ね合わせたM2 + ミルリノンの20μL滴を2〜3滴通過させて、体細胞を除去します。
  12. GV卵子を(できるだけ少ない培地で)30μLのKSOM滴に移します。卵子を5つのKSOM滴に通すことにより、ミルリノンを洗い流します(図2C)。
  13. すべてのGV卵子を、軽質鉱物油で重ねた20μLのKSOM滴に移します(KSOM滴あたり最大30個の卵子)(図2C)。卵子を細胞培養インキュベーター(37°C、5%CO2)に入れます。
  14. 卵子を約5時間インキュベートします。
    注:GVの崩壊(核膜の消失と減数分裂の再開のマーキング; 図2G)通常、培養で2時間後に発生しますが、卵子の成熟速度はマウスの系統やホルモン刺激によって異なる場合があります。私たちの経験では、培養で合計5時間すると、ほとんどのマウス系統でキアズマが広がるのに最適です。成熟が長すぎると、最初の減数分裂と極性体の押し出しが発生する可能性があります(図2H)。
  15. 5〜10個の卵子(KSOMをできるだけ少なく含む)を30μL滴の低張液(超高純度H2O中の0.9%クエン酸ナトリウム)に移します。卵母細胞を低張液中で5〜10分間インキュベートします。
  16. 調製したスライド(図2B)の正方形の1つに、酸性水(50 mLの超高純度H2Oに8滴の氷酢酸)を小滴(~1 μL)ピペットで移します。
  17. 直径100〜150μmの口操作式ガラスピペットを使用して、1つの卵子を酸性水滴にすばやく移します。卵母細胞にできるだけ低張溶液を移さないでください。同じピペットを使用して、卵母細胞がスライドにくっつくまで液体の一部を取り除きます。
    注:卵子の周りの液体の量は重要です。卵子が固定前に乾燥しない程度の液体が必要ですが、卵子がスライドに付着できないほどではありません。
  18. 直径150μmのガラス製ピペットチップに素早く交換できます。新鮮なCarnoyの固定液(絶対メタノール3部と氷酢酸1部)を卵母細胞に1滴加えます。固定剤をスライド上に分散させます。卵母細胞は、固定剤からの酸が透明帯を溶解し、細胞が破裂するにつれて、あまり明瞭でなくなり、溶けるように見えるはずです。
  19. 固定液の前面が収縮し始めたら、すぐにさらに2〜3滴の固定液を追加します。滑り台にやさしく息を吹きかけると、乾燥が速くなります。
  20. ステップ3.16〜3.19を、低張液から追加の卵子で繰り返します。
  21. すべての卵子が固定されるまで、手順3.15〜3.20を繰り返します。位相差顕微鏡を用いて染色体の広がりを確認します。
  22. スライドが完全に風乾したら、スライドを50 mLの4% Giemsa(v / v)含有ddH2O.Stain Slidesを入れたCoplin染色ジャーに入れます。
  23. スライドを室温でddH2O中で各3分間3回洗浄します。スライドを完全に乾かします。
  24. 60 mm x 24 mm の No. 1.5 ガラスカバースリップに Permount の薄層 (~60 μL) を塗布します。スライドをカバーガラスに反転させて取り付け、余分な液体を慎重に吸い取ります。スライドを一晩乾燥させてから、明視野で63倍でイメージングします。

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結果

パキテン様細胞におけるシナプス欠損の評価
この実験では、パキテン卵子のシナプス欠損を評価し、前期Iの進行をモニターします(図3A)。SYCP3(軸方向/外側SC要素)、SYCP1(中央SC要素)、およびHORMAD1(非シナプス/非シナプス染色体軸)の免疫染色により、病期分類とシナプス評価が可能になります。HORMAD1、ザイゴネマおよびディプロネーマ中(シナプス前および脱シナプス後)にSYCP3と共局在する37,38。これらの段階を区別することは、卵子では困難な場合があります。ザイゴネマは、二股に分かれた非シナプス領域を持つ長くて細い軸を特徴とし、ディプロネマは脱シナプスを伴う短くて厚いSCを示し、相同軸間に特徴的な丸みを帯びた気泡を引き起こします(

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ディスカッション

哺乳類の卵子は、精母細胞に比べて特にエラーが発生しやすいです。卵子の効率の悪い紡錘体アセンブリチェックポイント(SAC)がこの脆弱性の一因となっています14,52,53、ハッセルドとハントは、複数のヒットが異数性を引き起こし、組換えの欠陥が主要な要因であると提案しています54。人間の研究では、異数性を不十分なクロスオーバー保証と最適でないクロスオーバーポジショニングに関連付けています55,56。主要なモデルは、交叉成熟が卵母細胞では特に非効率的であり、その結果、交叉欠落と異数性誘発パターンの両方が生じることを示唆している57。したがって、卵子の減数分裂組換えの詳細な調査は、卵...

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開示事項

著者には開示すべき対立はありません。

謝辞

このプロジェクトの資金は、ユーニス・ケネディ・シュライバー国立小児保健発達研究所(HD112986からTH)からのK99賞によって提供されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
0.45 & mu;mシリンジフィルターミリポール・シグマSLHAR33SB口で操作するピペットの製造用
0.5 M EDTA、pH 8.0コーニング46-034-CI HEBのために
1 mL 滅菌注射器、25ゲージ、16mm針フィッシャー・サイエンティフィック14-817-125 卵巣破裂のために
100 x 15 mmペトリ皿VWR25384-302 
14.6 cm使い捨てホウケイ酸ガラス パスツール ピペットフィッシャー・サイエンティフィック13-678-20B 口で操作するピペットの製造用
35×10mmペトリ皿コーニング351008
40 mm x 0.45 mm #3 昆虫学用ステンレス製ピンアマゾンB0CSSPW5S7解剖用の胎児マウスのピン
酢酸、氷河期フィッシャー・サイエンティフィックA38-212カルノイ固定剤について
校正済みマイクロキャピラリーピペット用の吸引管アセンブリミリポール・シグマA5177-5EA口で操作するピペットの製造用
B.P.I.ウォッチグラスNDSテクノロジーズ 1580-00または、直径30mm×深さ12mmの胚皿(Electron Microscopy Sciences SKU: 70543-30)を使用する方法もあります。
ホウ酸フィッシャー・サイエンティフィックBP168-1HEBのpH調整のためにPFAを
牛血清アルブミンミリポール・シグマA7906-100GADBのために
CO2タンクインキュベーターのために
コーニング顕微鏡スライドミリポール・シグマCLS294875X25L×W、75mm x 25mm、片側にフロス加工
コーニング顕微鏡スライド、片面と片端にフロス加工VWR294875X25
ガラスの長方形カバー。60 x 24 mm、#1.5VWR48393-251
解剖皿電子顕微鏡科学70540
解剖顕微鏡任意の標準モデル
解剖用ハサミ、鋭い先端、4.5インチVWR82027-578
超細かくて鋭い先端の鉗子VWR76548-836
ギエムサ・ステインミリポール・シグマGS500-500キアズマ広げの染色用
ImmEdge 疎水性バリアPAPペンベクター研究所H-4000
インキュベーターCO2およびウォータージャケット技術を搭載した標準モデル
体外受精ワークステーションK-システムズ加熱されたベンチトップ付きのモデルならどんなモデルでも
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ストリッパーチップ - 100クーパー・サージカルMXL3-100口で操作するピペット用
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抗体
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')?断片ヤギ抗マウスIgG、Fc断片特異的ジャクソン免疫研究所株式会社115-546-071使用済み1:1,000希釈
Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')?断片ヤギ抗ウサギIgG、Fc断片特異的ジャクソン免疫研究所株式会社111-546-046使用済み1:1,000希釈
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マウス抗MLH1抗体抗体BDバイオサイエンス550838使用した1:100希釈
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ラビット抗RAD51 pBミリポールPC130使用時1:500希釈
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ローダミン レッドX(RRX)AffiniPure F(ab')?断片ヤギ抗マウスIgG、Fc断片特異的ジャクソン免疫研究所株式会社115-296-071使用済み1:1,000希釈
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