高悪性度漿液性卵巣癌モデリングのための卵管上皮細胞からのマウス由来オルガノイド株の開発

サマリー

このプロトコルは、 in vitro および in vivoでの高悪性度漿液性卵巣癌(HGSOC)マウスモデルの開発について詳しく説明しています。マウス卵管オルガノイドの誘導から,ヒトHGSOC遺伝学を再現するための遺伝子組み換え,および腫瘍の in vivo 発生のための同系マウスの卵巣滑液包への導入。

要約

現実的な環境における疾患の効果的なモデリングは、多様な病状の理解を深めるために非常に重要です。この点で、オルガノイドは、 in vitroでの古典的な2次元オルガノイドよりも忠実な環境を提供します。同様に、同系マウスモデルにより、研究者は免疫系など、より完全な腫瘍と宿主の相互作用をin vivoで調査することもできます。ここでは、マウスから高悪性度漿液性卵巣癌(HGSOC)の起源細胞である卵管上皮細胞を抽出し、それらを初代オルガノイド培養として誘導し、それらの in vitro 培養と維持に関する完全なプロトコルを提示します。次に、レンチウイルスやレトロウイルスの遺伝子過剰発現、CRISPR-Cas9遺伝子欠失などの遺伝子工学技術を使用して、これらの系統を改変し、前癌性腫瘍に形質転換する方法について説明します。また、遺伝物質の抽出や免疫蛍光染色による in vitro 検証への使用方法も報告しています。最後に、腫瘍発生のために、HGSOCの自生部位である卵巣滑液包にこれらの腫瘍様体を効果的に注入する方法を示します。

概要

高悪性度漿液性卵巣癌 (HGSOC) は、依然としてよく理解されておらず、致死率の高い疾患です。歴史的に、HGSOC の生物学と治療反応を表す忠実な in vitro および in vivo モデルの欠如が進歩の大きな障壁となってきました。たとえば、複数の(ほとんどではないにしても)研究では、HGSOCの主要なゲノム/遺伝的特徴を共有できない細胞株が使用されており、その発見の関連性に疑問が生じています1,2,3,4。たとえば、一般的なID8同系マウスモデルは卵巣表面上皮(OSE)に由来し、Trp53野生型⁵です。対照的に、すべてではないにしても、ほとんどのHGSOCは卵管上皮(FTE)⁶で発生し、HGSOCはほぼ普遍的にTP53変異体またはサイ^{レンシング7}です。それ以来、研究者らはTrp53変異を組み込むことでこの系統を修正しようと試みてきました^が5、Trp53変異はHGSOC病因の初期イベントであるため、この修飾はこの細胞株の形質転換に遅すぎる可能性があり、正常なHGSOC発生を表していない可能性があります。

過去10年間、HGSOCのより現実的なモデルを生成することで、この状況を是正する試みがなされてきました。たとえば、ミュラー管系統細胞に関連する変異を保有する遺伝子組み換えマウスモデル(GEMM)は、多くの場合、病因を制御するためのCreリコンビナーゼシステムの下で、研究者がin vivoで疾患をよりよく模倣することを可能にします^8,9,10。残念ながら、これらのモデルは生成が複雑であることが多く、Cre-leaking、Cre-effect、または「field-effect」^11、12、13などの他の問題がある可能性があります。この点で、同系オルガノイドモデルは、in vitroおよびin vivoの両方で疾患をよりよく模倣したい研究者にとって強力な妥協点であるように思われます14,15,16,17,18,19。実際、現在入手可能で使用されているHGSOCモデルのほとんどは2次元モデルですが、残念ながら、細胞生物学に影響を与える重要な要素である細胞外マトリックス(ECM)の複雑さを適切にシミュレートすることはできません。オルガノイドは自己組織化された3D組織であり、多くの場合、幹細胞から生成され、ペトリ皿²⁰中の臓器の初期の構造的および機能的複雑さを再現することができます。それらの生成は通常、多能性の単一細胞をマトリゲル²¹などの基底膜マトリックス(BMM)に懸濁することによって機能します。インビトロでは、これらのモデルは、2Dモデルよりも生体内条件の再現において比較的正確です。同様に、それらの同系的な性質により、これらのモデルは完全に機能する免疫系を持つマウスに移植することができ、病因と発生のより忠実な再構築を可能にします^14,15。これは、最も現実的な腫瘍遺伝学を持ちながら、免疫不全マウスモデルへの生着を必要とする患者由来の異種移植片に比べて明らかな利点です。

このプロトコルでは、同系HGSOCオルガノイドモデルの開発方法について説明します。マウスから抽出されたオリジナルの野生型FTEオルガノイド培養物の生成から、疾患に関する情報遺伝子型を生成するための遺伝子工学、そして最終的に卵巣滑液包への移植を戻して完全に発達した腫瘍を生成するまで。また、 in vitro オルガノイドの免疫蛍光(IF)染色や、注射などの細胞の大規模生産のための細胞株の2D変換など、一般的な実験に役立ついくつかの追加プロトコルも含めました。このプロトコルは、遺伝子構成を制御するHGSOCのオルガノイド同系モデルを開発したい研究者を対象としており、特に、より現実的な in vitro 条件でのHGSOC生物学と、in vivoでの腫瘍微小環境に存在する相互作用を研究することを意図しています。

プロトコル

すべての動物組織の収集と手順は、アレクサンドリア生命科学センターの施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)およびニューヨーク州ニューヨークのニューヨーク大学ランゴンヘルスのパールマッターがんセンターの承認の下で倫理的に実施されました。

1. 資料の準備

1. マウスオルガノイド培地(MOM)調製
   1. 表1の項目を組み合わせて基礎培地を調製します。
      注:培地は4°Cで最大1か月間安定です。
2. 2Dメディアの準備
   1. 組換えマウスEGF 50 ng / mL、インスリン-トランスフェリン-セレン(最終濃度10 mg / Lインスリン、5.5 mg / Lトランスフェリン、6.7 μg / L)、3%熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、およびペニシリン-ストレプトマイシン(100 U / mL)をDMEM(ピルビン酸および高グルコースを含む)で組み合わせます。
3. 消化ミックスの調製
   1. コラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼ(3000 U/mLコラゲナーゼ、1000 U/mLヒアルロニダーゼ)とDMEM(ピルビン酸および高グルコースを含む)を1:10の比率で組み合わせます。1.5mLマイクロチューブに1mLアリコートを調製します。アリコートを-20°Cで保存し、氷上で解凍します。
   2. DNAse I(10,000 U/mL)およびディスパーゼ(5 U/mL)の使い捨てアリコートを調製します。
   3. DMEM中のコラゲナーゼ/ヒアルロニダーゼのアリコートが解凍されたら、DNAseI(10 μL、100単位)およびディスパーゼ(25 μL、0.1単位)を加えます。
      注:この消化液は、最大0.5gの腫瘍の消化にも有用です。
4. BMMの取り扱い
   1. BMMは-80°Cで長期保存してください。凍結融解BMMを避けるために、1.5 mLチューブに1 mLのアリコートを調製します。アリコートを氷の上に2時間置くか、4°Cで一晩解凍します。
      注:BMMは室温(RT)で固化します。したがって、BMMのチューブは常に氷の上またはコールドチューブラックに保管することをお勧めします。-20°Cの冷凍庫で少なくとも2時間予冷したピペットチップを使用してください。

2. マウスFTEからの細胞の単離

1. BMMのアリコート、予熱したTrypLE Express Enzyme、および24ウェルプレートを37°Cで解凍します(最良の結果を得るには、プレートをインキュベーターに24時間保存します)。次に、解剖顕微鏡で組織を解剖および洗浄するためのツール、冷たいPBS + P / Sを入れたプレート、および温かい消化混合物の操作領域を準備します。
2. 雌C57BL/6Jマウスを二酸化炭素窒息による安楽死させるIACUCの要求に応じて二次安楽死法(子宮頸部脱臼)を実施します。
3. 卵巣と卵管を解剖して除去し、DMEM + PSを含む滅菌ペトリ皿に4°Cで移します。 解剖顕微鏡を使用して、鉗子とはさみの細かいセットで卵巣から残留脂肪を除去し、卵管(漏斗と遠位膨大部の一部)を卵巣と子宮から分離します。
   注意: 微生物汚染を防ぐため、ツールでマウスの皮膚や髪の毛に触れないように注意してください。
4. 組織を完全な消化混合物が入ったチューブに移し、細いはさみを使用して卵管を細かく刻みます(<0.5 mm)。37°Cで40〜50分間インキュベートします。
5. 解離後、細胞を350 x g で5分間遠心分離し、上清を廃棄します。予熱したTrypLE Expressを500 μL加えます。37°Cで15分間インキュベートします。
6. DMEM(2D培地)中で500 μLの3%FBSでトリプシン処理をクエンチします。混合物を70μmのセルストレーナーを通して新しいマイクロチューブに濾します。350 g で5分間回転させ、上清を捨てます。
7. 細胞ペレット(使用するFTの数によってはほとんど見えません)を12.5 μLのオルガノイドマウス培地に再懸濁し、氷上で短時間インキュベートします。37.5 μLの氷冷BMMと混合し、全容量(50 μL)を予熱した24ウェルプレートのウェルの底にシードします。
8. プレートを37°Cで少なくとも20分間、48時間以内に置き、BMMを設定します。プレートをインキュベーターに移すときは、ドームを乱さないように注意してください。
9. 培地をウェルの側面にそっとピペッティングして、500 μLの予熱したMOMを各ウェルに加えます。損傷や剥がれを引き起こす可能性があるため、ドームに直接メディアを追加しないでください。蓋を培養プレートに置き、37°Cおよび5%CO₂でインキュベートします。

3. マウスFTE由来オルガノイドの維持

1. メディアの変更
   1. ろ過されていない滅菌10 μLチップを使用して、プレートを45°の傾斜に保たれた状態でウェルの底から培地を吸引します。ドームがプレートから外れた場合は、切り離されたドームが下にある間に、ウェルの上部からメディアを慎重に吸引します。
   2. 37°Cで予熱した750 μLのMOMをゆっくりと加え、先端をウェルの側壁に押し付けます。
   3. メディアは2〜3日ごと、またはメディアの色がピンクから黄色に変わるまで交換してください。培地を交換してから24時間以内に黄色に変わった場合、オルガノイドは継代の準備が整います。
2. オルガノイドの継代
   1. 培地を取り出し、各ウェルを500 μLの低温(4°C)PBSで洗浄します。PBSを吸引し、500 μLの冷たい(4°C)細胞回収溶液をBMMドームに直接加えて溶解します。BMMが完全に溶解するまでピペッティングを続け、1.5 mLチューブに移します。
   2. チューブを氷の上に30分間置き、プレートをインキュベーターに戻して温かく保ちます。新しいプレートを使用する場合は、37°Cで24時間予熱してください。
      注:以下に概説する拡張中など、2x 50 μLドームを超える継代の場合、最良の結果を得るには、氷上でのインキュベーションを30分以上延長する必要がある場合があります。
   3. 350 g で4°Cで5分間遠心分離します。 ペレットを吸引せずに上清を慎重に除去し、500 μLの冷たいPBSで洗浄します。この手順を 3 回繰り返します。
      注意: コールド遠心分離機が利用できない場合は、チューブを氷またはコールドラックの上に置いて、洗浄の合間にチューブを冷まします。
   4. 最後の洗浄後、350 g で5分間遠心分離し、上清を取り除き、500 μLの予熱(37°C)TrypLE Express Enzymeを加えます。ピペッティングによる細胞の損失を避けるために、チューブを組織培養フードの通気口グリルに当ててドラッグして、細胞を均質化します。
   5. チューブを37°Cで30〜60分間インキュベートします。
      注:時間は、オルガノイドの遺伝子型と継代時間に応じて調整される場合がありますが、単一細胞懸濁液を生成するためにより長いトリプシン処理を必要とする場合もあります。
   6. 500 μLのDMEM + 3%HI FBSを添加して細胞解離プロセスを停止し、溶液が均質化されるまでピペッティングして上下に混合します。
   7. 350 × g で 5 分間遠心分離し、~20 μL の体積が残るまで上清を吸引します。このステップではペレットを吸引するのが一般的であるため、真空吸引器ではなくP20ピペットを使用して残りの上清を手動で除去します。
   8. 細胞を100 μLの低温(4°C)MOMに再懸濁し、細胞濃度を測定します。必要に応じて細胞希釈液を調製し、氷上に保管します。次に、-20°C前に保存したピペットチップを使用して、氷冷したBMMと混合します。
      注:MOMとBMMの比率が1:4である2×10⁵ 細胞/mLで2つの50 μLドームを調製することをお勧めします。したがって、あなたは持つべきです。8 × 10⁵ 細胞/mL の MOM 中の 25 μL の細胞、および合計 100 μL の 75 μL の BMM を 2 つのドームに分割します。このように、ドームごとに 1 × 10 個の⁴ 個のセルを効果的に播種します。
   9. 予熱した24ウェルプレートのウェルの中央に各50 μLドームを播種します。プレートを37°Cおよび5%CO₂ のインキュベーターに少なくとも30分間置き、BMMを固化させます。前述のステップ3.1.2で示したように、500 μLのMOMを37°Cで添加し、プレートをインキュベーターに戻します。
3. 拡張
   1. オルガノイド細胞培養を(予熱した)6ウェルプレートに増殖させるには、50μLドームを8×10⁵ 細胞/mLで調製します。細胞を合計62.5 μLのMOMに再懸濁し、187.5 μLの氷冷BMMと混合し、同じウェルに5つのドームを播種します。
   2. プレートをインキュベーターに30分間移動して、BMMを固化させます。ステップ3.1.2で示したように、37°Cで2 mLのMOMを加え、プレートをインキュベーターに戻します。細胞がコンフルエントになるまで、必要に応じて培地を変更します。
      注:継代のために細胞を収集するには、500 μLの代わりに1 mLの細胞回収溶液を使用し、30分ではなく氷上で45分間インキュベートします。
4. 凍結保存
   1. オルガノイドの長期保存については、ステップ3.2.1〜3.2.7で説明されているように継代します。次に、250 μLのオルガノイド凍結培地(80%MOM、10%FBS、および10%ジメチルスルホキシド(DMSO))に再懸濁し、クライオチューブに移します。クライオバイアルあたり1×10⁵ 細胞を凍結します。
   2. チューブを極低温バイアル凍結容器(例:Mr. Frosty)に保管し、-80°Cの冷凍庫で冷却します。長期保存の場合は、セルを液体窒素貯蔵庫または-150°Cの冷凍庫に保管してください。

4. マウスFTE由来オルガノイドの遺伝子組み換えによる新規細胞株の開発

1. スピニオキュレーションによる形質導入(レンチウイルスまたはレトロウイルス)
   1. 25 μLのMOMと75 μLのBMMの混合物を調製し、コールド(4°C、BMMがウェルを完全に「濡らす」ことができます)48ウェルプレートの1つのウェルに加えます。細胞を播種する前にBMMを固化させるために、37°Cで30〜60分間インキュベートします。
   2. オルガノイド由来の単一細胞(ステップ3.2.5)を取得し、BMMの上に約2×10⁴ を播種します。200 μLの温かい(37°C)MOMを加え、37°Cおよび5%CO₂ で48時間インキュベートします。
   3. ウイルスを希望の濃度で添加します。MOIを実験的に決定します。おおよその MOI は 30% 未満が推奨されます。
      注:オルガノイドは、2D細胞株と比較して感染が特に難しく、高いウイルス力価でも低いMOIが予想されます。細胞を600× g で32°Cで60分間遠心分離します。 スピオキュレーションが終わったら、プレートをインキュベーターに戻します。
   4. 8時間後、培地を取り除き、細胞の上に25 μLのMOMと75 μLのBMMの混合物を加えてBMMに「挟み込み」、オルガノイドを3次元で自然に増殖させます。プレートをインキュベーターに30〜60分間入れて、BMMを固化させます。次に、250 μLの温かい(37°C)MOMを加えます。
   5. 細胞がコンフルエントになったら、ステップ3.2で詳述したように細胞の継代に進み、細胞の全体積を24ウェルプレート内の2つのドームに拡大します。
      注:抗生物質の選択を使用する場合は、最初の脊髄眼科の48時間後から、48ウェルで直接選択を実行することをお勧めします。蛍光活性化細胞選別(FACS)を実行する場合は、十分な細胞を取得するために、上記のように6ウェルプレートでさらに増殖することをお勧めします。また、サンプルをフローのためにろ過する前に、単一細胞を確保するために、より長い(1時間)トリプシン処理時間も推奨されます。
2. エレクトロポレーションに基づくCRISPR-Cas9による形質転換
   注:リボ核タンパク質(RNP)複合体の濃度と調製については、IDT相同性指向性修復ガイド(pp.9-11)²²を参照してください。ただし、相同組換えを必要とするゲノム編集にのみ推奨されるため、ノックアウト用のHDR Enhancer V2は省略してください。
   1. オルガノイド由来の単一細胞懸濁液を調製します(ステップ3.2.7)。PBSで洗浄し、細胞濃度を測定します。10⁴ 桁以内の量(1 × 10⁴ 〜9 ×^{10 4} 細胞)を含む細胞懸濁液を1.5 mLチューブに移します。
   2. 350 × g で 5 分間遠心分離します。上清を除去し、10 μLのゲノム編集バッファーに再懸濁します。エレクトロポレーションに>1×10⁴ 細胞が必要な場合は、連続エレクトロポレーションに十分な容量を準備し、各10 μLに1×10⁴ 〜9×10⁴ 細胞が含まれるようにします。
   3. エレクトロポレーションピペットシステムを使用して、10 μLの細胞懸濁液を収集し、気泡が導入されないようにします。エレクトロポレートは、1200 V電圧、20 msのパルス持続時間、合計4パルスです。細胞を冷たいMOMでチューブに入れます。
   4. 細胞をエレクトロポレーションした後、懸濁液全体を350 × g で5分間遠心分離します。ペレットを氷冷のMOMとBMM(1:4の比率)に再懸濁し、エレクトロポレーションのラウンドごとに1つのドームを播種するのに十分な量を準備します(1 10⁴ 細胞あたり1ドーム)。
   5. プレートを37°Cおよび5%CO₂ のインキュベーターに少なくとも30分間置き、BMMを固化させます。前述のステップ3.1.2で示したように、500 μLのMOMを37°Cで添加し、プレートをインキュベーターに戻します。
3. 単一クローンの選択
   1. 単一細胞に由来するクローンを得るには、上記のように細胞を継代するが、ドームあたり50〜100個の細胞を播種する(BMMと混合する前に、細胞懸濁液中に4×¹⁰ 〜8〜8×103^細胞/ mL)。
   2. MOM は 3 日ごとに変更します。オルガノイドが適切に成長していることを確認し、どのオルガノイドが他のオルガノイドから十分に分離されているかに注意してください。
   3. オルガノイドが識別可能なサイズ(約500μm)に成長したら、光学顕微鏡を使用して、十分に分離された4〜5個の大きなオルガノイドを識別します。
      注:それらは肉眼で見えるはずですが、オルガノイドがあるプレートの領域の周りに円を描いて、先端の細いマーカーでプレートの底をマークすると役立ちます。
   4. 滅菌フード内の20μLピペットを使用して、チップをBMMにそっと挿入し、単一のオルガノイドを吸引します(約12.5μLの容量を吸引します)。オルガノイドを500 μLのMOMを入れた1.5 mLの収集チューブに入れます。
   5. 350 × g で 5 分間遠心分離します。上清を除去し、500 μLのTrypLE Express酵素に再懸濁します。37°Cで30分間インキュベートします。
   6. DMEM(2D培地)中で500 μLの3%FBSで細胞解離反応をクエンチし、350 × g で5分間遠心分離します。上清を非常に慎重に除去し、12.5 μLの冷たいMOMに再懸濁し、37.5 μLの氷冷BMMと混合し、上記のように、懸濁液全体を単一の50 μLドームとして24ウェルプレートに播種します。
   7. プレートを37°Cおよび5%CO₂ のインキュベーターに少なくとも30分間置き、BMMを固化させます。前述のステップ3.1.2で示したように、500 μLのMOMを37°Cで添加し、プレートをインキュベーターに戻します。
   8. 3〜4日ごとにメディアを交換し、ドームが合流したら通過します。

5. オルガノイドからの2次元細胞株誘導

1. 移行細胞培養
   1. オルガノイドを継代した後のように、単一細胞懸濁液から開始します。
   2. 6ウェルプレートの播種(ステップ3.3)と同様に進めますが、代わりに予冷(4°Cで24時間)を使用します。4°Cで一晩保存した6ウェルプレートにドームを播種し、プレートを滅菌フード内で5〜10分間休ませてからインキュベーターに導入します。
      注:このステップにより、細胞はBMMのECMコンポーネントにアクセスしながら、2D増殖条件に対応するためにプレートの底に穏やかに沈殿することができます。
   3. プレートを37°Cおよび5%CO₂ で30分間インキュベートし、37°Cで2mLのMOMを加えます。 必要に応じてメディアを変更します。
   4. オルガノイドがコンフルントに達すると、ステップ3.2.1〜3.2.7で説明されているように継代します。ウェルの最後のPBS洗浄で残りのBMMを除去した後、予熱した2D培地を2 mLをウェルに加えます。
      注:BMMの除去はウェルに付着した細胞を除去せず、これらは2D条件/培地に適応しながらウェルの残りの部分に自由に侵入できるようになりました。
   5. BMMに残った細胞で単一細胞懸濁液に達したら、ステップ5.1.2を繰り返して、細胞の体積の半分をシードします。元のウェルの残りの半分を追加して、より多くのセルをシードできるようにし、コンフルンシーをスピードアップします。
   6. 24時間後に2D培地を交換して、付着していない細胞を除去します。
      注:BMMで増殖した細胞はプラスチック基質に慣れておらず、容易に付着しないため、多くの非付着細胞が存在するはずです。
   7. 手順 5.1.4 を繰り返します。次に、細胞の全量を4 mLの2D培地に再懸濁し、以前に使用した各ウェルに2 mLをシードします。2Dメディアは3〜4日ごとに交換してください。
2. 増殖のための2D細胞培養
   1. 細胞が約80%のコンフルエンシーに達したら、最初の継代に進みます。
   2. 継代するには、培地を吸引し、1 mLのPBSで1回洗浄し、1 mLの0.25%トリプシンを加えます。細胞を37°Cで5〜10分間インキュベートします。
      注:細胞株が異なれば接着特性も異なる場合があり、トリプシン処理の持続時間は異なります。次のステップに進む前に、細胞が剥がれていないか顕微鏡で確認してください。細胞培養プレートを手で軽くたたくと、細胞を剥がすのに役立ちます。
   3. すべての細胞が剥離したら、DMEM + 10%FBSで解離をクエンチし、350 × g で5分間遠心分離します。
   4. 最初の拡張(80〜100%コンフルエントの場合)では、1:1の分割比率で再播種します。手順5.1.6を繰り返し、2〜3日ごとに2Dメディアを交換します。
   5. 2回目の増殖(80〜100%コンフルエント)で、37°Cの10 mLの2D培地に細胞を再懸濁することにより、すべての細胞を100 mmディッシュに播種します。 手順5.1.6を繰り返し、2〜3日ごとにメディアを交換します。
      注: このプロセスには時間がかかり、最大で丸 1 か月かかる場合があります。タンパク質の過剰発現のためにウイルス組込み遺伝子を持つ細胞株を扱う場合は、増殖培地全体に抗生物質を存在させておくことをお勧めします。マーカーが蛍光タンパク質の場合は、できるだけ早く蛍光活性化細胞選別を実行します(つまり、100 mmディッシュ拡張の終わり)。
3. 凍結保存
   1. これらの細胞を保管するには、ステップ5.2.1〜5.2.3で説明されているように継代します。次に、80%の2D培地、10%FBS、および10%DMSOで構成される1 mLの2D凍結培地に~1×10⁶ 細胞を再懸濁し、クライオチューブに移します。ステップ 3.5.2 に従ってセルを格納します。

6. オルガノイド系統の検証

1. オルガノイドからの遺伝物質の単離
   1. 単一細胞懸濁液から始めて、通常の細胞密度の2倍(1×10⁶ 細胞/mL)で2つのドームを播種します。3日目にMOMを変更します。
   2. 5日目に培地を取り出し、PBSで1回洗浄し、350 μLの好ましい溶解バッファーをドームに直接加えます。RTで5分間インキュベートした後、またはBMMが溶解するまで、ライセートを1.5mLチューブに移します。
   3. 長期間使用する場合は、ライセートを-80°Cで保管してください。 それ以外の場合は、好ましい抽出技術または市販のキットを使用して、DNAおよび/またはRNA抽出のプロトコルを続行します。
2. 免疫蛍光(IF)染色
   1. 細胞を調製するには、手順3.2.1〜3.2.5で説明されているように継代します。37.5 μLのMOMと112.5 μLの氷冷BMMの混合物に再懸濁します(生物学的複製として機能する3つの50 μLドームに十分)。手順 3.2.6 に従い、3 日目と 5 日目にメディアを変更します。
   2. 7日目に、MOMを吸引し、500 μLのPBSで細胞を洗浄します。500 μLの予熱(37°C)4%パラホルムアルデヒド(PFA)溶液をドームに直接加えて、各ドームを個別に固定します。BMMが溶解するまで、37°Cで60分間インキュベートします。
   3. 広口径のP1000ピペットチップを使用して(利用できない場合は、通常のP1000チップを細い端から約0.5 cmカットするだけです)、オルガノイドを4%PFAで収集し、容量を1.5mLチューブに移します。
      注:標準のピペットチップを使用すると、オルガノイドが破損します。
   4. オルガノイドがチューブの底に沈むまで2〜3分待ちます。4%PFAを吸引し(オルガノイドを吸引しないように安全な量を残しながら)、500 μLのPBSを加えてオルガノイドを洗浄します。この手順をさらに2回繰り返し、合計3回洗浄します。
      注:オルガノイドの形状を維持するには、遠心分離よりもオルガノイドが底に沈むのを待つことが望ましい。
   5. 長期保存(4〜6週間)の場合は、オルガノイドをPBS中で4°Cに保管します。 染色を続行するには、PBS + 1%Triton-XでRTで30分間透過処理します。PBSで一度洗浄します。
   6. PBS + 0.2%Triton-X + 4%FBS + 1%マウス血清でRTで60分間ブロックします。PBSで1回洗浄し、チューブ内に100 μLの容量を残します。
   7. 抗体染色用の作業バッファーを調製します:PBS + 0.2%Triton-X、0.4%FBS、0.1%ラット血清。このバッファーは、一次抗体と二次抗体の両方に機能します。
   8. 一次抗体染色を調製するには、実際に必要な希釈量の2倍の濃度になるように希釈液を計算します。各チューブに残っている100 μLのPBSに100 μLの抗体を加えるのに十分な溶液を調製します。たとえば、元の希釈液が 1:1000 の場合、100 μL の 1:500 溶液を調製します。
   9. 4°Cで一晩インキュベートします。 その後、500 μLのPBSで3回洗浄します。
   10. 手順6.2.8で説明したように、二次抗体染色を調製します。RTで1時間インキュベートします。
       注:このステップ以降は、蛍光抗体の光退色を避けるために、作業領域をアルミホイル/推奨ダークボックスで覆うようにしてください。
   11. 二次染色が終わったら、500 μLのPBSで3回洗浄します。最後の洗浄後、チューブからできるだけ多くの液体を取り除き、サンプルを取り付ける準備をします。オルガノイドの吸引を避けるために、20 μLのピペットを使用します。
   12. ワイドボアまたはカットピペットチップを使用して、選択した封入剤を20 μL添加し、気泡を避けながら溶液をよく均質化します。
   13. オルガノイドを取り付け液に一滴置き、長方形のカバースリップに置きます。鉗子を使用して、気泡を避けながら滴の上に円形のカバーガラスを置き、RTで暗所で一晩乾燥させます。スライドごとに複数のサンプルを配置する場合は、同じスライドでこの手順を繰り返します。
   14. さらに20 μLの封入剤を円形のカバースリップの上に直接追加します。次に、長方形のカバーガラスを180°反転させ、顕微鏡スライドの上に置いて、取り付け「サンドイッチ」を作成します。RTで暗所で少なくとも8時間乾燥させます。
       注:スライドは、下から上への順序で行う必要があります:顕微鏡スライド、円形カバースリップ、オルガノイド、長方形カバースライド。これにより、最適なイメージング条件が作成されます。

7. マウスにおける腫瘍モデルの開発

1. 細胞の準備
   1. 選択した2D細胞のバイアルを1バイアルで2D培地で解凍します。これらの細胞を成長させ、150mmプレートに増殖させます。細胞に抗生物質選択マーカーがある場合は、注射前に細胞を選択して、目的の細胞の純粋な集団を確保します。
   2. マウスに5回注射する場合は、細胞を2枚の150mmプレートに増殖させます。プレートが80%コンフルエントになったら、手順5.2.2〜5.2.3に従って細胞を回収します。1 mLのOpti-MEM I 還元血清培地に細胞を再懸濁し、細胞濃度を測定します。
      注:各注射には、4×10⁶細胞が含まれています。ただし、シリンジの死量を考慮して追加の注射の準備をすることをお勧めします。この場合、20 × 10⁶ セルではなく、24 × 10⁶ セルを準備します。
   3. すべての注射の細胞体積全体を1.5mLチューブに入れます。注射ごとに合計44 μLを調製し、補充されていないOpti-MEM Iの細胞1部と氷冷BMMの1部で構成されています。たとえば、24 × 10⁶ 細胞 (6 回の注射) の場合、132 μL の Opti-MEM I と 132 μL の BMM に再懸濁します。
   4. 細胞を完全に混合し、注射を行うまで氷の上に置いてください。
2. 手順の準備
   1. 冷たいPBSでシリンジ(U-100インスリン28G)の死容量から気泡を排出します。
   2. 1.5mLチューブ内の細胞を使用して、針内のせん断力による細胞の溶解を避けるために、シリンジをゆっくりとロードして5回の40μL注射を準備します。マウスが鎮静されるまで氷の上に置きます。
   3. 注射の準備がすべて整ったら、注射器を加熱ランプの横に置いて、BMMが温まって粘性になり、注射と生着が容易になるようにします。過固化したBMMはシリンジを適切に通過しないため、加熱ランプの真下に置かないでください。一般に、このようなことが起こらないように迅速に作業してください。
3. 卵巣への滑液包内注射(IBI)
   1. ケタミン(100 mg / mL)を使用してC57BL / 6Jマウスを麻酔します。体重10gあたり0.1mLを腹腔内注射で投与する。
      注:若い雌マウスはしばしば0.2 mLの注射しか必要としませんが、年長の場合はさらに多くの注射が必要になる場合があります。これにより、20〜40分間麻酔が行われますが、鎮痛は提供されません。
   2. 加熱ランプで温めたケージにマウスを置きます。
      注:マウスを加熱ランプの真下に置かないでください、これは尾の壊死や高体温を引き起こし、致命的になる可能性があるためです。
   3. 最初のマウスが完全に麻酔されたら、無菌技術を使用して、腹部領域および太ももの上でC57BL / 6Jマウスの脇腹に沿って<1cmの切開を切ります。滑液包領域に到達する前に、必ず表皮と皮下組織を通過してください。
   4. 卵巣を慎重に引き抜きます(卵巣に取り付けられた脂肪パッドで簡単に見つけられます)。準備された注射器の1つを取り、卵巣のすぐ後ろの脂肪パッドから卵巣自体を通って卵管袋に細胞をゆっくりと注入します。
      注: 注射が成功すると、卵管袋バルーンが BMM で形成されます。混合物は脂肪パッド全体に漏れる可能性もありますが、これは正常です。
   5. 卵巣を慎重に滑液包に戻し、外科用ステープルを使用するか縫製して切開部を閉じます。
   6. マウスをケージに戻します。温熱ランプを使用して、マウスが術後に半意識状態になるまで回復する間(>15分)、マウスを暖かく保ちます。翌日、マウスをチェックして、一晩で敗血症が発生していないことを確認します。

結果

HGSOC卵巣がんの生成と検証のワークフローを要約した概略図を 図1に示します。このプロセスは、雌のC57BL / 6J野生型マウスから卵管組織を抽出することから始まります(図2A)。適切に収集するために、たっぷりのティッシュから始めることをお勧めします。解剖顕微鏡を使用すると、脂肪や卵巣などの周囲の組織を除去しながら、遠位卵管を正確に分離できます。 図2Bに示すように、卵巣は最初は脂肪で覆われていますが、デブリードマン後、その黄色と楕円形がよりはっきりします。次に、卵管を慎重に解きほぐし、トリミングして遠位部分を分離し、その後消化のために準備します(図2B)。

マウスFTEから単一細胞懸濁液が開発されるとすぐに、それらをBMMで培養してオルガノイドを形成できるようにします。抽出...

ディスカッション

腫瘍学研究の大幅な進歩にもかかわらず、HGSOC は依然として最も悪性度の高いタイプの婦人科悪性腫瘍であり、すべての卵巣がんの中で主要な死亡原因です^23,24。婦人科腫瘍学研究が進化するにつれて、そこで使用されるモデルも進化する必要があります。実際、多くの歴史的な卵巣がんモデル細胞株は、ゲノムの関連性、起源細胞の不一致、または in vivo 条件の模倣に関する制限など、いくつかの理由から、この疾患を研究するには最適ではないことが発見されています²。この点で、オルガノイドは、in vitroシステムとしての組織発生、および細胞-マトリックス相互作用をより正確に表し、古典的な二次元細胞培養技術よりも優れていることが示されています14,15,25。^<...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
カルシウム、マグネシウム、炭酸ナトリウムなしのHBSSには0.25%のトリプシン、0.1%のEDTAが含まれています	コーニング	25053CI
A83-01	トクリス・バイオサイエンス	2939
高度なDMEM/F12	ギブコ	12-634-028
年齢:C57BL/6J(女性)	ジャクソン研究所	000664
AllPrep DNA/RNA Miniキット	奇アゲン	80204	DNA/RNA抽出のために
Alt-R S.p. Cas9-GFP V3	統合DNA技術	10008100
抗Ki67抗体	アブカム	AB15580
オートクリップシステム	ファインサイエンスツール	12020-00	IBI後の創傷閉鎖について
B-27サプリメント(50倍)、血清不使用	ギブコ	17-504-001
ブラストシジンHCl(10 mg/mL)50 mg	インビボジェン	アント-BL-05
牛血清アルブミン	シグマ・オルドリッチ	A9647
バッファーRLTプラス	奇アゲン	1053393	DNA/RNA抽出前の細胞を溶除するために
セルリカバリーソリューション	コーニング	354253
コラーゲン酵素/ヒアルロンダーゼ	STEMCELL テクノロジーズ	07912
CoraLite 594-ファロイディン(赤)	プロテインテック	PF00003
カバーガラス 15CIR-1	フィッシャーブランド	12-545-83
ガラスのカバーは24mmで鋭く、40mm-1	フィッシャーブランド	12-544-12
CTS(細胞療法システム)N-2サプリメント	ギブコ	A1370701
ダピ	ロッシュ	10236276001
牛の膵臓由来のデオキシリボヌクレアーゼI(DNAse I)	シグマ・オルドリッチ	D5025
ディフコ・スキムミルク	ベクトン・ディキンソン	232100
散らす	STEMCELL テクノロジーズ	07913
DMEMはL-グルタミン、4.5 g/L グルコース、ピルビン酸ナトリウムを含みます	コーニング	10013CV
DNase I組換え、RNaseフリー	ロッシュ	04716728001
ダルベッコのリン酸緩衝溶液	シグマ・オルドリッチ	D8537
デュモン #5 - セラミック被覆鉗子	ファインサイエンスツール	11252-50	卵管郭清のための
胎児用牛血清	コーニング	35-010-CV	56度で熱不活性化;60分間C。
ファインシザーズ - ToughCut	ファインサイエンスツール	14058-09	卵管採取およびIBI切開のために
ジェネティシン選択抗生物質(G418硫酸塩)(50 mg/mL)	ギブコ	10131027
グルタMAXサプリメント(100倍)	ギブコ	35-050-061
ヤギ抗ウサギIgG(H+L)交差吸着二次抗体、シアニン3	インビトロジェン	A10520
グレーフェ鉗子	ファインサイエンスツール	11053-10	組織取り扱いのために
HEPESバッファ	コーニング	25060CI
ヒトR-スポンジン1組換えタンパク質	ペプロテック	120-38
インスリン注射器、U-100 0.5 mL 0.36 mm(28 G)×12.7 mm(1/2インチ)	BD	BD329461
インスリン・トランスフェリン・セレン(ITS -G)(100倍)	ギブコ	41-400-045
L-グルタミン 200 mM(100倍)	ギブコ	25-030-081
マトリジェルGFR基底膜マトリックス	コーニング	356231	BMM
マウスEGF組換えタンパク質	ペプロテック	315-09
マウスFGF塩基組換えタンパク質	ペプロテック	450-33
マウス・ノギン組換えタンパク質	ペプロテック	250-38
マウスWnt-3a組換えタンパク質	ペプロテック	315-20
N2補足	ギブコ	17502048
N-アセチルシステインアミド	シグマ・オルドリッチ	A0737
ネオンNxT電気孔孔システム	インビトロジェン	ネオン1	CRISPR-Cas9電気穿孔
ネオンNxT電気孔径システム10-μ1チャンネル真空管のLキット	インビトロジェン	N1025	電気穿孔用の消耗品、ゲノム編集バッファーを含む
ニコチナミド	シグマ・オルドリッチ	N3376
ノーマルマウス血清	インビトロジェン	10410
普通のラット血清	STEMCELL テクノロジーズ	13551
Opti-MEM I 還元血清培地	ギブコ	31985070
PAX8ポリクローナル抗体	プロテインテック	10336-1-AP
ペニシリン・ストレプトマイシン(10,000 U/mL)	ギブコ	15-140-122
プロマイシン	シグマ・オルドリッチ	P8833
セレクトフロースト 25 mm & 急性;75mmで急性;1.0mm	フィッシャーブランド	12-550-003
トライトン X-100	フィッシャー・バイオリエージェント	BP151
TrypLEエクスプレス酵素(1x)、フェノールレッドなし	ギブコ	12-604-013
Vannasスプリングハサミ - 4mmカッティングエッジ	ファインサイエンスツール	15019-10	卵管郭清のための
Y27632	STEMCELL テクノロジーズ	72304	ローキナーゼ(ROCK)阻害剤