Method Article

Rを用いたMiRNA-Seqデータ処理とバイオインフォマティクス解析の検証済みワークフロー

DOI:

10.3791/68760

⸱

October 24th, 2025

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, 905th Hospital of PLA Navy, Naval Medical University, 2Department of Nephrology, Naval Medical Center of PLA, Naval Medical University, 3Department of Nephrology, Gongli Hospital of Shanghai Pudong New Area, 4Department of Nephrology, Shanghai Changzheng Hospital, Second Affiliated Hospital of Naval Medical University (Second Military Medical University), 5Department of Cellular Biology and Anatomy, Medical College of Georgia at Augusta University

In This Article

Summary

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ここでは、Rを用いてmiRNA-Seqデータを解析するプロトコルを提示します。このワークフローにより、研究者はmiRNA制御ネットワークと、さまざまな生物学的および臨床的問題におけるその重要性を探ることができます。この研究は、miRNAバイオインフォマティクスの分野の初心者と経験豊富な研究者の両方にとって実践的なガイドとして機能することを目的としています。

Abstract

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マイクロRNA(miRNA)は、幅広い生理学的および病理学的プロセスに影響を与える重要な転写後調節因子です。ハイスループットシーケンシング技術の進歩に伴い、miRNA-Seq は miRNA 発現パターンをプロファイリングするための強力なツールとして登場しました。ただし、このようなデータを確実に解釈するには、標準化された再現性のある分析パイプラインが必要です。ここでは、Rを用いたmiRNA-Seqデータ処理とバイオインフォマティクス解析の検証済みワークフローを紹介します。このプロトコルには、生データの前処理、品質管理、アライメント、定量化、正規化、差次発現分析、標的予測、機能強化、調節ネットワーク構築など、すべての重要なステップが含まれています。柔軟性と透明性を考慮して設計されたこのワークフローは、広く採用されている R パッケージを統合し、種固有の注釈とモジュール式のカスタマイズをサポートします。さらに、ユーザーは、キュレーションされたデータベースや Cytoscape などの視覚化ツールを活用して、下流の生物学的解釈を行うようにガイドされます。このプロトコルは、堅牢な統計分析をサポートするだけでなく、miRNA-mRNA 相互作用と疾患メカニズムにおけるそれらの役割についての有意義な洞察を可能にします。これは、miRNAバイオマーカーの発見、疾患モデリング、または統合的なマルチオミクス研究を行う初心者と経験豊富な研究者の両方に特に適しています。

Introduction

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マイクロRNA(miRNA)は、転写後のステージ1で作用することにより、遺伝子発現に大きな影響を与える短いノンコーディングRNA分子です。これらは通常、標的メッセンジャーRNA(mRNA)の3'非翻訳領域(UTR)の相補配列に結合することによって機能し、mRNAの分解または翻訳抑制を引き起こします1。過去20年間で、miRNAは、細胞増殖、分化、アポトーシス、免疫応答、臓器発生など、さまざまな生物学的プロセスの中心的な調節因子としてますます認識されています2。さらに、miRNA発現の調節不全は、がん、心血管疾患、神経疾患、腎臓病などの多くの疾患の病因に関与しています3。これらの発見は、miRNA が治療標的としてだけでなく、臨床診断における低侵襲バイオマーカーとしてもの可能性を浮き彫りにしています。

次世代シーケンシング (NGS) 技術の出現により、miRNA の研究は新しい時代に突入しました。既知のmiRNAに限定されるマイクロアレイベースの方法とは異なり、miRNAシーケンシング(miRNA-Seq)は、さまざまなサンプルタイプと条件にわたって、既知のmiRNAと新規のmiRNAの両方を包括的でハイスループットかつ....

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Protocol

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メモ: ソフトウェアリンクのある材料は、 材料表にリストされています。

1. RNAサンプルと配列ライブラリーを調製する

注:この計算ワークフローの外部でRNA抽出とシーケンスを実行します。miRNAシーケンシングデータを解析する方法は複数あります。このセクションでは、1つの実用的なコンテキストを提供します。

  1. トータルRNAの抽出:低分子RNA単離用に最適化されたキット(miRNA単離キットなど)を使用して、生体サンプルからトータルRNAを抽出します。製造元のプロトコルに注意深く従ってください。分解を最小限に抑えるために、必ずRNaseフリーの消耗品を使用し、サンプルを氷上に保管してください。
  2. RNAの完全性と量を評価する:抽出したRNAを1〜2 μLをバイオアナライザーまたは同等のデバイスで実行します。RNA完全性番号(RIN)をチェックし、信頼性の高いシーケンシングのために7.0≥であることを確認してください。分光光度計または蛍光光度計を使用して濃度を記録します。
  3. 低分子RNAライブラリーの構築:市販の低分子RNA-seqライブラリー調製キットを使用して、1μgのトータルRNAからシーケンシングライブラリーを調製します。....

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Results

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GSE133530からマイクロRNA発現マトリックスをダウンロードし、直接差次発現解析を行いました。 補足ファイル 1 のデータセットの分析 R スクリプトの例を提供しました。データセットは、4つのPKD1多発性嚢胞腎から、異なるサイズの16の腎嚢胞(最小嚢胞:1〜5 mL未満、n = 10、中程度の嚢胞:10〜25 mL、n = 4、大きな嚢胞:50 mL以上、n = 4)および最小嚢胞組織(MCT、n = 7、1複製を含む)でグローバルmiRNAプロファイリングを実行しました。さらに、単離性腎細胞癌と診断された 3 つの腎摘出検体から悪性腫瘍のない腎皮質組織が得られ、正常対照として機能しました (n = 4)。最も明らかに変化したmiRNAを見つけるために、小、中、大の嚢胞のサンプルと正常な対照組織を比較しました。 図1A が示すように、ADPKDサンプルからのmiRNA発現パターンは、対照サンプルのmiRNA発現パターンとは明らかに異なります。その後、バイオアナライザーツー.......

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Discussion

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miRNA-Seqデータの分析には、リードのサイズが小さく冗長であるため、明確な課題があり、厳格な品質管理と前処理が重要になります。ワークフローで最も重要なステップの 1 つは、アダプターのトリミングです。miRNAの長さは約22ヌクレオチドであるため、適切に除去しないと、アダプター配列がリードを支配しやすくなります。正確なトリミングを実行しないと、誤検知リードの位置ずれや膨張が発生する可能性があります。同様に、マッピングの精度を損なう可能性のある低品質のベースを排除するために、アライメントの前に品質フィルタリングを実装する必要があります。マッピングと定量化は、もう一つの重要な段階です。リードがエクソンにまたがることが多い標準的なmRNA-Seqデータとは異なり、miRNAリードはコンパクトであり、既知のmiRNA遺伝子座と完全に一致する必要があります。厳密なパラメータでBowtieを使用すると、特にmiRBaseなどのデータベースから成熟したmiRNA配列にマッピングする場合に、正確なアライメントが保証されます。ゲノムへのアライメントとmiRBaseインデックスのどち.......

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Disclosures

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著者らは、競合する利益はないと宣言している。

Acknowledgements

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私たちは、このプロジェクトを支援している資金提供機関と協力者に感謝します。上海科学技術革新行動計画 (22Y11905500、24142201800)、人民解放軍海軍第 905 病院の制度プロジェクト (2024Q021)、長寧区衛生委員会の青少年研究プロジェクト (2024QN29)、海軍軍医大学の研究プロジェクト (2024QN040)。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Agilent-021827 ヒトmiRNAマイクロアレイアジレント/ヒトサンプルのマイクロRNAプロファイリングのための市販アレイ
ボウタイジョンズ・ホプキンス大学http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtmlシーケンシングリードを長いリファレンス配列にアライメントするためのソフトウェアツール
clusterProfiler (R パッケージ)生体伝導体https://bioconductor.org/packages/clusterProfiler/機能濃縮解析とハイスループット生物学的データの可視化用に設計されたRパッケージ。
カットアダプトオープンソースhttps://cutadapt.readthedocs.ioハイスループットシーケンシングリードからアダプター配列、プライマー、ポリAテール、その他の不要なフラグメントを削除するコマンドラインツール。
サイトスケープサイトスケープコンソーシアムhttps://cytoscape.org/複雑な生物学的ネットワークの視覚化と分析のために設計されたオープンソースのソフトウェアプラットフォーム。
DESeq2 (R パッケージ)生体伝導体https://bioconductor.org/packages/DESeq2/カウントデータの遺伝子発現差解析用に設計されたRパッケージ
EnhancedVolcano(Rパッケージ)生体伝導体https://bioconductor.org/packages/EnhancedVolcano/ 出版品質の火山プロットを作成するために設計された R パッケージ。
ファストQCバブラハムバイオインフォマティクスhttps://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ハイスループットシーケンシングデータ用のオープンソース品質管理ツール。
featureCounts (機能カウント)サブリード / SourceForgehttp://subread.sourceforge.net/ゲノム特徴にマッピングされたリードをカウントするために使用されるプログラム
HTSeqカウントPython パッケージhttps://htseq.readthedocs.io遺伝子やエクソンなどのゲノム特徴と重複するアライメントされたハイスループットシーケンシングリードの数をカウントするコマンドラインツール。私
イルミナヒトv2マイクロRNA発現ビーズチップイルミナ /ヒトサンプルのマイクロRNAプロファイリングのための市販アレイ
multiMiR(Rパッケージ)生体伝導体https://bioconductor.org/packages/multiMiR/予測および実験的に検証されたマイクロRNA&ndashの最大の統合コレクションを提供するRパッケージ。相互作用を、病気や薬物との関連とともに標的にします。
組織。Hs.eg.db (R パッケージ)生体伝導体https://bioconductor.org/packages/org.Hs.eg.db/ヒト(ホモ・サピエンス)ゲノミクス研究用に設計されたアノテーションパッケージ
R ソフトウェアRプロジェクトhttps://www.r-project.org/統計コンピューティングのためのオープンソースプロジェクト
Rstudio スタジオポジットPBC/統合開発環境は、R と Python の生産性を高めるのに役立ちます
SAMツールオープンソースhttp://www.htslib.org/次世代シーケンシング(NGS)データを操作するためのソフトウェアパッケージ。

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hsu, P. W., et al. miRNAMap: genomic maps of microRNA genes and their target genes in mammalian genomes. Nucleic Acids Res. 34 (Database issue), D135-D139 (2006).
  2. Fragiadaki, M. Lessons from....

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MiRNA SeqMiRNA ExpressionData ProcessingBioinformatics AnalysisDifferential ExpressionTarget PredictionFunctional EnrichmentRegulatory NetworkR PackagesCytoscape Visualization

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