方法論記事

ゼブラフィッシュのイメージングと心臓の発達のためのカスタム3Dプリント金型

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DOI：

10.3791/68768

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2025年8月15日

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1Department of Biology, University of Mississippi

この記事について

サマリー

ここでは、安価なステレオリソグラフィー3Dプリンターを使用して、イメージング研究用のゼブラフィッシュ胚の再現性のある取り付けを容易にする金型を作成する方法について説明します。この方法を使用して、ゼブラフィッシュ胚の心臓形態形成をイメージングするための金型を作成しました。

要約

胚の取り付けは、研究者がイメージング プロジェクトを実施する際に直面する技術的課題の 1 つです。胚は、イメージング期間全体にわたって目的の組織が顕微鏡の対物レンズにアクセスできるように、再現性のある方法で配向する必要があります。この課題を克服するために、研究者は胚を粘性媒体に埋め込んだり、イメージング中に胚を希望の向きに保持するための特殊な皿やギプスを作成したりできます。ここでは、安価な光造形(SLA)3Dプリンターを使用して、イメージングのために胚を取り付けることができるアガロースウェルを作成する再利用可能な金型を製造する方法について説明します。これらのアガロースウェルは、イメージングのために複数の胚を方向付けるための信頼できる手段を提供します。この方法には、さまざまな組織、生物、イメージングの課題に合わせて簡単にカスタマイズできる設計フレームワークが含まれています。この方法を使用して、正立顕微鏡と倒立顕微鏡の両方でゼブラフィッシュの心臓発達をイメージングするための金型を作成しました。この方法では、入手可能な材料や機器を利用することで、研究者は取り付けニーズに合わせた金型を簡単に作成できます。

概要

無傷の動物内の細胞動態を視覚化することは、先天性疾患の病状と発生と恒常性の基本的なプロセスを理解するために不可欠です。この視覚化には、生物全体、組織、細胞、細胞内レベルにわたる生理学的ダイナミクスを特定するための複数の空間スケールでのイメージングが含まれます。細胞動態の視覚化に使用されるイメージングモダリティは、固定検体の免疫蛍光研究から生きた検体のタイムラプスイメージングまで多岐にわたります。これらのイメージングモダリティでは、顕微鏡の対物レンズに関心領域にアクセスできるように、無傷の標本を特定の方向に保持する必要があります。

ゼブラフィッシュの胚は、その光学的透明性、遺伝的扱いやすさ、外部受精、脊椎動物の起源により、画像研究に理想的なモデル生物です。しかし、ゼブラフィッシュの胚を特定の向きに一貫した再現性のある方法でマウントすることは、継続的な課題となっています。心臓の形態形成は異なる平面で起こるため、ゼブラフィッシュ胚の心臓の発達の視覚化には、取り付けが特に困難です1。

イメージングのために胚を取り付ける際の課題に対処するために、複数のアプローチが開発されています。最も簡単な方法の 1 つは、ゼブラフィッシュの胚を 2 つのカバーガラスの間に取り付け、カバーガラスの間にテープを重ねて押しつぶしを防ぐことです。この方法により、倒立顕微鏡と正立顕微鏡の両方でイメージングが可能になります2。ゼブラフィッシュ胚は、メチルセルロースや0.1〜0.8%の低融点温度アガロースなどの高粘度培地またはゲルにマウントして、胚を特定の方向に保持することもできます2,3,4。これらの低スループットアプローチは、多くのイメージングプロジェクトでうまく機能します。ただし、胚の完全性を確保し、特定の向きを再現可能に取得することは面倒な場合があります。イメージングスループットを向上させ、取り付けを容易にするために、イメージング皿5,6,7,8中の固化アガロースから規則的な間隔のウェルを作成することができる。これらのアガロース井戸の作成を容易にするために、プラスチック型が作成されました9、10、11。これらのモールドは、標準的な背側-腹側-外側軸10,12に沿ったイメージングに適用できますが、多くの場合、96ウェルプレート13での使用や最初の心拍14の検出など、特定のイメージングの課題のために作られています。特殊なケースでは、イメージングディッシュ全体が作成されています5,15,16。例えば、PDMSで作られたマイクロ流体チャンバー(ZEBRAと名付けられた)は、胚のイメージングと化学物質への曝露の両方を容易にします17。これらの金型は、多くの場合、シリコンで作られているか、ルーサイト 10、18、19 から機械加工されています。しかし、比較的安価な3次元(3D)プリンターの出現により、アガロースイメージングウェルの作成に使用されるカスタマイズされた金型の作成が民主化されました。

3Dプリンティングは、積層造形または層状製造とも呼ばれ、個々の層20,21の順次の追加および融合によって、デジタル設計から3Dオブジェクトを生成することを含みます。光造形(SLA)は、紫外線(UV)光を利用して、光に敏感な液体樹脂を連続した層22で硬化させます。SLAプリンタは、費用対効果が高く、高速で高精度であり、滑らかな表面を提供するものを含むさまざまな樹脂で使用できます16。このプロセスはコンピューター支援設計 (CAD) ソフトウェアから始まり、オブジェクトのデジタル モデルを de novo で設計したり、既存の設計から変更したりできます。次に、デジタルモデルは仮想的に印刷可能なレイヤーにスライスされます。これらのデジタルレイヤーを使用して、3Dプリンターはオブジェクトをレイヤーごとに構築します。ここでは、低コストの市販のSLA 3Dプリンターを使用して、イメージング金型のカスタム設計と作成のための方法とフレームワークを紹介します。さらに、このフレームワークを使用して、ゼブラフィッシュの心臓発達のさまざまな段階を倒立顕微鏡または正立顕微鏡でイメージングし、ゼブラフィッシュの胚を外側、背側、または腹側の軸に沿ってイメージングするための金型を作成します。

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プロトコル

ここで説明するプロトコル、実験、および調査結果は、動物福祉の規制とガイドライン、およびミシシッピ大学の施設動物管理および使用委員会(プロトコル#24-008)に従って実施されました。

胚をイメージング用に配向できるさまざまな形状のアガロースウェルを作成するために、ペグに取り付けられたベースを利用する設計を開発しました(図1A)。これらのペグの形状( 図1Aの紫色のペグを指す矢印を参照)は、さまざまな発達段階の胚の向きを調整し、さまざまな組織に焦点を当てるようにカスタマイズできます。以下に、これらのペグをカスタマイズし、このシステムを使用してアガロースウェルを作成するためのプロトコルについて説明します。

1. カスタム設計のイメージング金型の作成

  1. 標本または胚の予備スケッチを希望の方向に配置します。希望する胚の向きと、使用する顕微鏡に直立対物レンズまたは逆立対物レンズが含まれているかどうかを検討してください。皿のサイズ、取り付ける胚の数、およびそれらの間の間隔も考慮してください。
  2. 顕微鏡とFIJI23などのソフトウェアツールを組み合わせて、胚の寸法(長さ、幅、高さなど)を測定します。これらの寸法を使用して、胚がペグによって作成されたウェルに収まるようにします。
  3. 胚の形状に対応する形状を特定します。ステップ1.2の測定値をコンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェアと組み合わせて使用して、サンプルの形状とサイズに近似するペグを作成します。
    注: この形状は、事前に設計されたさまざまな形状を組み合わせて重ね合わせることによって、基本的な CAD ソフトウェア プログラムで作成することも、高度な CAD ソフトウェア プログラムを使用して de novo で形状を作成することもできます。さらに、事前に設計されたペグの1つを変更することもできます(補足ファイル1を参照)。 図1Aのようにペグを先細りにすると、胚の向きを変えて、目的の組織が目的に最も近いことを確認できます。
  4. ペグデザインとベースデザインを組み合わせます。
    1. CAD ソフトウェア プログラムで、カスタム設計のペグを事前に設計されたベースの 1 つ(補足ファイル 1)に追加します。次に、高度なCADプログラムのツールを使用して、ペグをベース全体に複製して均等に配置し、ハイスループットイメージングを実現します。すべてのペグがベースから離れた場所で同じ高さに達していることを再確認してください。
  5. 3D プリント用のデザインを準備します。
    1. カスタマイズされた金型設計または事前に設計された金型の 1 つ (補足ファイル 2) をスライサー ソフトウェアに転送すると、スライサー ソフトウェアが設計を 3D プリンターのコマンドに変換されます。
    2. スライサー ソフトウェア内で、ペグなどの重要なコンポーネントがプリンター ステージから離れた位置に配置されるように、デザインを回転させてください。FDM(Fused Deposition Modeling)プリンターで印刷されるカバーガラスホルダーの場合は、印刷物を水平に配置します。
      注: デザインを回転させることで、デリケートな部品を印刷ステージの近くに配置した場合に発生する可能性のある反りを防ぐことができます。
    3. スライサー ソフトウェア内にサポートを追加して、印刷中に金型のデリケートな部分が破損しないようにします。ソフトウェアの中程度の自動サポート配置機能と手動キュレーションにより、大きな隙間なくサポートが適切に広がります。100% インフィル戦略を使用して、ソリッド金型を作成します。
    4. すべての金型を含む単一のSTLファイルを使用するか、スライサーソフトウェアを使用して個々のSTLファイルをまとめて配置することで、複数の部品を同時に印刷します。
  6. 印刷
    注: SLA プリンターは、その実現可能性、精度、滑らかな表面の作成により、イメージング金型に推奨される 3D プリンター タイプです。FDM プリンターは、SLA プリンターよりも軽量で硬い印刷を作成するため、カバーガラス ホルダーの作成に使用されます。
    1. 次の印刷設定から始めて、そこから最適化します。0.05 mm のレイヤー高さ。5 最下層数;2.5秒の露光時間;35秒の底面露光時間;5mmのボトムリフトとリフティング距離。60 mm/minのボトムリフト速度。80 mm/minの持ち上げ速度;210mm/minの後退速度。
      メモ: 印刷設定は、樹脂の種類、室温、プリンターのモデルによって異なるため、ユーザーが最適化する必要がある可能性があります。
  7. 印刷後、型を水で洗浄し、サポートを取り外し、型を組織培養フードの UV 光下に置いて樹脂を確実に固化させます。
    注: 金型を徹底的に洗浄して硬化させることは、樹脂の剥がれを防ぎ、金型の変形を防ぐために重要です。
    未硬化の樹脂は皮膚を刺激する可能性があるため、未硬化の樹脂を取り扱ったり、金型を掃除したりするときは、手袋と白衣を着用する必要があります。SLA プリンターは、目や皮膚に有害な樹脂を硬化させるために UV 光を使用します。プリントチャンバーがしっかりと密閉されていることを確認し、UV 光源を直接見ないようにしてください。

2. 3Dプリントされた金型を使用してアガロース井戸を作成する手順

  1. アガロース井戸を作る
    1. 2%(g/mL)のアガロースをE3培地(1.578 mM NaCl、0.169 mM KCl、0.249 mM CaCl2*2H2O、0.161 mM MgSO4*7H2O)に溶解してアガロースウェルを作成します。カバーガラス底皿の中央に型を置き、矢印がウェルに向かって下を向くようにします( 図2A、Bを参照)。750 μLの2%溶融アガロース/ E3をイメージングモールドの周囲の半分に沿ってピペットで移動します( 図2Cを参照)。
      注:溶融アガロースは非粘性である必要がありますが、気泡を発生させずにピペットでピペットで移動できるほど冷却する必要があります。60mmの皿と30mmのカバーガラス底をよく使用しますが、正立顕微鏡用に設計された金型には、標準の60mmの皿を使用できます。スクリーニング金型には、わずかに異なるプロトコルが使用されます(以下を参照)。
    2. イメージングモールドの周囲の残りの半分に沿って、さらに750 μLの2%溶融アガロース/ E3をピペットで移動します( 図2Dを参照)。
    3. アガロースが固まるまで5〜7分待ち、透明な液体から不透明な青色のゲルへの移行を観察します( 図2Eを参照)。
    4. 固化した中央アガロースの周囲に溶融アガロースの薄層を追加します。
      注:厳密に必須ではありませんが、このステップは固化したアガロースを皿に固定し、培地誘発性剥離を防ぐのに役立ちます。
    5. 外輪(補足図S1B)をアガロースモールドアセンブリの上に置き、矢印をアガロースに向けてします( 図2Fを参照)。
    6. 外輪をそっと押さえながら、内型を慎重にまっすぐ引き上げてアガロースから取り外します( 図2Gを参照)。
      注意: アガロースウェルの破損や損傷を避けるため、外輪を強く押し下げたり、上に引っ張るときに内型をねじったりずらしたりしないでください。
    7. 外輪を取り外し、カバーガラスの底皿にアガロースウェルを露出させます(図2H)。
    8. アガロースウェルを顕微鏡で検査し、正しいサイズと生産量を確認します。
      注:倒立顕微鏡でイメージングするには、アガロースの薄膜をウェルの底から持ち上げる必要があることがよくあります。これは鉗子で行うことができます。
  2. スクリーニングモールドを使用するための修正プロトコル
    1. 溶融した2%アガロース/ E3をペトリ皿に約半分になるまで注ぎます。
    2. ペグを上に向けて金型を持ち、ペグが覆われるまで(~3 mL)、溶融した2%アガロース/ E3をペグにピペットします。
      注:ピペットに引き込まれた溶融アガロースの90%のみを放出して、気泡が発生しないようにしてください。
    3. 傾ける動作を使用して、一方の端を置き、次にペグ付きの型全体を下向きに溶融アガロースを含むペトリ皿に置きます(補足図S2)。
    4. アガロースを5〜7分間固化させます。
    5. ハンドルを使用して一方の端をこじ開け、次にもう一方の端をこじ開けて、金型を慎重に取り外します。

3. 低融点アガロースの有無にかかわらず、アガロースウェルに胚をマウントする

  1. マウントする前に、200 μg/mLのトリカイン溶液で胚を脱毛膜化し、麻酔します。
    注:心臓の鼓動を止めるには、~400 μg/mLのトリカイン溶液が必要です。
    1. 低融点アガロースを使用せずに:イメージングディッシュに1x E3およびトリカイン(200 μg/mL)を満たし、脱絨毛膜麻酔胚をイメージングディッシュに加え、鉗子を使用して胚をアガロースウェルに配置して配向し、次に画像化します( 図2I、Jを参照)。
      注:鉗子は胚に損傷を与えやすいため、直径0.41 mmの釣り糸を毛細管またはピペットチップに挿入し、瞬間接着剤で固定する胚ポーカーを代わりに使用できます24。
    2. 低融点アガロースの使用:
      注:型は胚を特定の向きに配置するように設計されていますが、低融点アガロースを使用して胚を所定の位置に保持すると、イメージング中または取り付けられた胚を装着したイメージング皿を顕微鏡に輸送するときに胚がドリフトしないようにすることができます。以下の手順は、以前のプロトコル6 から派生したものです。
      1. 0.1〜0.8%の低融点アガロースを5mLのE3培地に溶解し、ウォーターバスで65〜70°Cに加熱することにより、低融点アガロースのチューブを作成します。時々、低融点のアガロースが溶解するまでチューブを反転させます。低融点のアガロース溶液をマイクロフュージチューブに分注し、42°Cに設定したヒートブロックに置きます。 溶液を少なくとも1時間42°Cに平衡化させます。
        注: 一般に、作りたての低融点アガロース溶液を使用することをお勧めします。
      2. 広口径ガラスパスツールピペットを使用して、単一の胚を低融点のアガロース溶液を含むチューブに移します。低融点アガロース溶液に余分な液体を加えないようにするには、胚とそのすぐ周囲の液体のみを移します。現在低融点アガロースにある胚をすぐにアガロースウェルの1つに移します。再利用のために低融点アガロース溶液をヒートブロックに戻します。
      3. 鉗子または胚ポーカー(ステップ3.1.1を参照)を使用して、イメージングのために胚をウェルに配置します。
      4. 他のウェルについて、手順3.1.2.2〜3.1.2.3を繰り返します。前のウェルが乾燥し始めたら、p200ピペットを使用して、ウェルの上に少量のE3(~50-100 μL)を追加します。
  2. 胚がすべてのウェルに取り付けられ、低融点のアガロースが固まったら、ピペットを使用してトリカイン/ E3溶液をイメージングディッシュにゆっくりと加えます。
  3. イメージング後、鉗子を使用してウェルから胚を慎重に抽出し、イメージングが発生障害を引き起こさないように、胚をさらに発育させます。
    注:アガロースウェルはイメージングディッシュから取り出して、すすぎ、再利用できます。市販のガラスクリーナーですすぎ、次にddH2Oで複数回すすぎは、カバーガラス上の塩分堆積物を除去するのに役立ちます。微量のガラスクリーナーによる毒性は経験していませんが、研究者は独自の実験室条件を使用してこれらの結果を確認することをお勧めします。

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結果

上記のプロトコルは、心臓固定、心管形成、心臓ループ、心室形成など、ゼブラフィッシュの心臓発達のさまざまな段階をイメージングするための金型を設計するために使用されました。心臓の発達は胚の解剖学的主要な軸に沿って起こらないため、胚を適切に配置するために、ペグの形状はさまざまな発達段階に合わせてカスタマイズされました。たとえば、球形卵黄に対する受精後48時間(hpf)のゼブラフィッシュ心臓の前方内側の配置には、傾斜した胚の向きが必要であり、これは型V2に先細りのエッジを持つペグを作成することによって促進されました(図1A、B)。カビV2を利用して、倒立共焦点顕微鏡でイメージングするためのアガロースウェルを作成し、Tg(myl7:egfp)導入遺伝子25を使用して、野生型胚と48 hpfで噴門二分を示す重度のpdgfrask16 / sk16変異胚26の間の心臓形態を比較しました(

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ディスカッション

このプロトコルでは、画像研究のための胚または組織の取り付けを容易にすることができるアガロースウェルを作成する3Dプリント型を設計する方法を概説します。これらのモールドは、正立顕微鏡または倒立顕微鏡でイメージングするために作成でき、これらのカスタムモールドを使用して作成されたアガロースウェルは、固定胚の免疫蛍光研究から生きた胚のタイムラプスイメージングまで、さまざまなイメージングアプリケーションに使用できます。

この方法は、ペグが取り付けられた内側のプランジャー状のベースモールドと外輪の 2 つの部分を含む基礎を利用します。これらの金型には、いくつかの重要な設計機能を組み込んでいます。これらの特徴の中で最も重要なのは、内型の底にあるペグです。これらのペグの形状はカスタマイズして、さまざまな形状のアガロースウェルを作成することができ、イメージングのために再現可能な方法で胚の向きを決めるのに役立ちます。その他の設計上の特徴には、アガロースウェルの一端に金型名の印象があり、各ウェルを一意に識別できる非対称性を作成します。ペ...

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開示事項

著者には宣言すべき利益相反はありません。

謝辞

Bloomekatz研究所のメンバー、特にSasmitha SinghとAllison Holmes、GlyCOREイメージングコア(P20GM130460の支援)、ミシシッピ大学IDEAラボ、Yiwei Han博士とHan研究室、ミシシッピ大学糖鎖科学および発生生物学コミュニティのメンバーに感謝したいと思います。この研究は、NIH (R15HD108782、P20GM130460) からの資金提供によって支援されています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
SLA 3D プリンターElegooMARS 2 PRO
アガロース アペックス・バイオリサーチ;ジェネシーサイエンティフィック 20-102QD任意のブランドを
Autodesk Fusion 360Autodesk Inc.https://www.autodesk.com/products/fusion-360/ コンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェア - より高度な
Axio-Zoom 正立顕微鏡ZeissAxio Zoom.V16
ChituboxCBD-Techhttps://www.chitubox.com/スライサーソフトウェア
カバースリップボトムディッシュ(60 mmディッシュ、30 mmボトムウェル付き)CellvisD60-30-1.5N
F59 ミオシン重鎖(すべて高速アイソフォーム)DHSBF591:50希釈FDM
フィラメントBambuPLAフィラメント
FDM プリンターBambuBambu X1 カーボン FDM0.4mm 押出機ノズル
子ッシャー16-100-121他のブランドも適している可能性があります
ギアンチマウス Alexa 488サーモフィッシャー#A281751:300 希釈
イマリスアンドール10.2ソフトウェア
立共焦点顕微鏡ライカライカSP8 X
低融点温度アガローステクノロジーカタログ番号:A-204-25他のブランドも適している可能性があります
ピペットポンプBel-ArtF37898
SLAプリンター用樹脂Elegoo ElegooP05BB028水洗い可能なフォトポリマー樹脂 V2.0
Ricinus communis 凝集素 (RCA-120)Vector labs#RLK-2200 (レクチンキット)1:300希釈
TinkerCADオートデスク株式会社 https://www.tinkercad.com/コンピュータ支援設計(CAD)ソフトウェア - 基本的な
トリカインS ウェスタンケミカル株式会社 ANADA #200-226
小麦胚芽凝集素 (WGA)ベクターラボ#RLK-2200 (レクチンキット)1:300 希釈
ワイドボアガラスパスツールピペット デュラン・ウィートン・キンブル(DWK)63A53WT
で置き換えることができます。もの 鉗 フィ ヤ 倒ゴールドバイオ

参考文献

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