ここでは、分子または組織病理学的分析のために切片化する前に、組織安定化ゲルを血管内腔に注入することにより、ヒトの動脈構造を維持するためのプロトコルを提示します。
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この記事について
サマリー
要約
小動脈や細動脈を含む抵抗動脈は、血圧と組織灌流の調節に重要な役割を果たします。これらの動脈の機能不全は、神経血管疾患だけでなく、高血圧、アテローム性動脈硬化症、心不全などのさまざまな心血管疾患を引き起こす可能性があります。ヒトの抵抗動脈の検査は、心血管疾患のメカニズムを理解し、標的を絞った治療戦略を開発するために非常に重要です。この研究は、組織安定化ゲルを内腔に注入し、その本来の構造と細胞の完全性を維持することにより、単離されたヒト抵抗動脈を調製する革新的な方法を提示します。腹部手術を受ける患者からヒト大網組織を採取し、慎重な顕微解剖によって小さな抵抗動脈(直径100〜300μm)を分離しました。次に、動脈をカニューレ挿入し、培養ミオグラフチャンバーで加圧し、10%中性緩衝ホルマリンで固定しました。組織安定化ゲルをカニューレ動脈の内腔に注入し、三次元構造を維持するために固化させました。動脈の保存を評価するために、組織学的、免疫組織化学的、および遺伝子発現分析が行われました。組織学的切片により、動脈の構造的完全性と自然な構造がよく保存され、明確に定義された内皮層と平滑筋層が維持されていることが明らかになりました。免疫組織化学染色では、CD31やα平滑筋アクチンなどのマーカーの明確な局在が示されました。 in situ ハイブリダイゼーションにより、特定の遺伝子発現パターンが明らかになり、分子メカニズムについての洞察が得られました。この高度な管腔内ゲル注入方法には大きな利点があり、健康な状態と病気の状態の両方における動脈構造、リモデリング、細胞相互作用の高度なイメージングと包括的な分析が可能になります。この方法は、血管疾患の臨床診断と治療戦略を改善する可能性を秘めており、それによって血管生物学研究を前進させるための貴重なツールを提供します。
概要
抵抗動脈は血流と圧力を調節し、高血圧、糖尿病、アテローム性動脈硬化症などの症状で大きな変化を起こします 1,2,3,4,5。ヒトの抵抗動脈を調べることは、心血管の病状を理解し、標的療法を開発するために不可欠です 6,7,8,9,10。血管を調査するための従来の方法は、アーティファクトや三次元完全性の喪失につながることがよくあります 10,11,12,13,14,15。これらの制限に対処するために、ゲルを内腔に注入することにより、分離されたヒト抵抗動脈を調製し、それによってそれらのおおよその ex vivo および/または in vivo 構造を維持する革新的な方法を提示します。
この管腔内ゲル注入技術は動脈の自然な構造を維持し、動脈の生理学的状態をより正確に表現できるようにします。この方法は、血管構造を安定させることにより、動脈のリモデリング、細胞構造、マイクロドメイン、ヘテロ細胞接合部、および異なる細胞層にわたる遺伝子/タンパク質発現の詳細な検査を容易にします。この技術は、健康な状態と病気の状態の両方で細胞型特異的成分を研究するのに特に有利です。
この技術は最近の研究16 でうまく適用され、ヒト抵抗動脈の構造的および分子的完全性を維持し、高度なイメージングと包括的な分析を促進する有効性を実証しました。このアプリケーションの成功により、他の人が使用できるようにこの詳細なプロトコルを文書化するようになりました。
この方法論文では、単離されたヒト抵抗動脈を調製し、生体適合性のある組織安定化ゲル(ティッシュガードゲル)を注入するためのプロトコルについて説明します。ここでは、実験方法について説明し、動脈構造の評価と、さまざまな細胞層における遺伝子およびタンパク質の発現パターンの調査への応用を示します。ヒト抵抗動脈の調製のための包括的で再現性のある技術を提供することで、心血管生物学の研究を進歩させ、結果の再現性を向上させ、心血管疾患の新しい診断および治療アプローチに貢献することを目指しています。
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プロトコル
以下の実験を行う前に、人体組織の使用と以下の手順が治験審査委員会(IRB)によって承認されていることを確認してください。国立衛生研究所 (NIH) 臨床センターで臨床的に必要な腹部手術を受けている患者からの大網組織の収集は、NIH 治験審査委員会 (NCT01915225) の承認を得て実施されました。すべての参加者は書面によるインフォームドコンセントを提供しました。
1. 材料と設備
- このプロトコルに必要なすべての試薬と材料に関する情報については、 材料表 を参照してください。詳細については、必要に応じて各ベンダーに関連するマニュアルや Web サイトを参照してください。
2.ヒト大網組織の収集
- 手術チームからヒト大網組織を収集します。
- 氷上に、冷たいクレブスヘンセライト(KH)バッファー(組成:118 mM NaCl、4.7 mM KCl、1.2 mM MgSO4、1.2 mM KH2PO4、25 mM NaHCO3、10 mM HEPES、2.0 mM CaCl2、および11.1 mMグルコース)を含む事前に冷却された検体容器に組織をすぐに入れます。
- 組織がバッファーに完全に浸っていることを確認し、蓋をしっかりと閉めます。
- 組織の生存率を確保するために、氷上の密閉容器内の組織を収集後 30 分以内に実験室に輸送します。
注:緩衝液の調製中は、NaOHを使用してpHを7.4に調整してください。
3. ヒトの小抵抗動脈の顕微解剖
- 検査室に到着したら、大網組織を冷たいKHバッファーですすぎ、余分な血液を取り除きます。
- 氷上のシャーレ内のコールドバッファーで解剖する組織のより血管新生した領域の一部を選択します。
- 解剖顕微鏡下で、小さな抵抗動脈(直径100〜300μm)を、その位置と分岐パターンに基づいて識別します。
- 特定された動脈を周囲の脂肪組織や結合組織から慎重に分離します。細い鉗子とマイクロハサミを使用して、動脈を損傷することなく周囲の組織を切断して除去します。
- 分離された動脈は、生存率を維持し、酵素による分解を防ぐために、解剖手順全体を通して冷たい緩衝液に保管してください。
注意: 解剖する前に、解剖領域がきれいであることを確認してください。顕微鏡の対物レンズスケールやカメラソフトウェアが適切に校正され、さまざまな倍率で直径を正確に測定できることを確認します。通常、静脈ははっきりと見え、動脈は静脈のすぐ隣または周囲にあります。動脈の壁は静脈の壁よりも厚いです。動脈は周囲の組織から分離されると、無傷の血管チューブとしての構造を維持します。対照的に、静脈は壁が薄く、内腔内の血液のために明るく見えることが多く、組織から分離するとより壊れやすくなる傾向があります。
4.培養ミオグラフチャンバーの準備
- 解離された動脈のカニューレ挿入と加圧のために、2つのガラスカニューレを備えた培養ミオグラフチャンバーを準備します。
- 清潔な毛細管チューブを備えた5 mLシリンジを準備し、新鮮なKHバッファーで充填します。チューブをカニューレの一端に接続し、気泡を残さないようにKHを充填します。
- チャンバーに低温バッファーを入れ、氷の上に置いて低温を維持します。
注:筋グラフチャンバーを模倣するように設計された2つのカニューレを備えたカスタムメイドの小さな皿を使用できます。
5.動脈のカニューレ挿入と加圧
- 細い鉗子または動脈の直径よりも大きい移送ピペットを使用して、解剖された動脈を筋グラフ室に慎重に移します。
- ナイロン縫合糸で4つの開いた結び目(11/0縫合糸、7層)を準備し、動脈をカニューレ挿入する前に、そのうちの2つを各カニューレに装着します。
- 細い鉗子を使用して動脈の近位端をガラスカニューレにスライドさせてカニューレを挿入し、2本のナイロン縫合糸で固定します。
- シリンジ内のKHバッファーを使用して、カニューレ動脈を優しく洗い流し、残っている血液を除去します。
- 動脈の遠位端にカニューレを挿入し、同様に固定します。
- 圧力および温度コントローラーに接続されているミオグラフユニットにチャンバーを置きます。
- 温度を37°Cに設定します。
- 初期管腔内圧を10mmHgに設定します。
- 60 mmHg に達するまで、10 分ごとに管腔内圧を 10 mmHg ずつ上げます。培養ミオグラフシステムに接続された圧力調整器を使用して、圧力が一貫して維持されていることを確認してください。
- マイクロポジショナーを使用して、必要に応じて加圧された動脈を縦方向にまっすぐにし、長さを生理学的レベルに近づけます。
- コンピューターモニターでMyoVIEWまたはその他の適切なソフトウェアを実行し、デジタルノギスで動脈の内径と外径を追跡します。
- 動脈を 45 分間平衡させて安定した直径にし、生理学的寸法と緊張を確実に維持します。
- 血管収縮剤 (60 mM KCl やフェニレフリンなど) または血管拡張剤 (アセチルコリンなど) を使用して動脈の生存率をテストし、動脈径の変化を記録します。
注: 注射器で過度の圧力を加えると動脈が損傷する可能性があるため、動脈を洗い流すときは注意が必要です。最小限のバッファーを使用し、穏やかに進めてください。あるいは、動脈を加圧しながら灌流バッファーを使用して動脈血を洗い流すことができます。動脈は80mmHgで加圧でき、平衡化時間は最大1時間です。
6.動脈固定
- 平衡化後、動脈を10%中性緩衝ホルマリンで一晩内管腔内および管腔外に固定します。固定プロセスで動脈壁と細胞成分の構造的完全性が維持されるように、60 mmHg の一定の圧力を維持します。
- 固定後、動脈を管腔内および管内側に PBS ですすぎ、動脈とチャンバーから残留固定液を除去します。
注:研究の目的と分析の対象領域に応じて、取り付けられた血管は、血管拡張剤や血管収縮剤などの薬理学的薬剤の存在下で固定することができます。この段階で、動脈は PBS で 4 °C で最大 48 時間保存できます。4% パラホルムアルデヒドを使用して動脈を固定することもできます。
7. 組織安定化ゲルの調製
- 使用前にチューブ内の組織安定化ゲルを60〜5°Cに加熱して液化±します。
- チューブを室温(RT)に3〜5分間置いて液体ゲルを温度を下げ、次に40°Cの加熱ブロックに置いて液体ゲルを10〜15分間維持します。
- 長さ10〜15インチのキャピラリーチューブに接続された3mL滅菌シリンジを使用して、液体ゲルを採取します。すぐに以下の注入手順に進みます。
注:ゲルはさまざまな方法で液化できます。製造元の指示に従うことが重要です。
8. 管腔内ゲル注入と包埋
- 固定動脈を37°CのPBSでチャンバー内にカニューレ留めたままにします。
- 液体ゲルで満たされた毛細管チューブの遠位端を近位カニューレに接続します。
- ジェルを注入する際に気泡が内腔を通過するのを避けるために、最初のカニューレから動脈の近位端を外して気泡を排出し、ゲルがカニューレを満たすようにします。
- 動脈をカニューレに取り付け直し、遠位カニューレから出るまでゲルを動脈内腔にそっと注入します。
- チャンバー内のPBSを同量の液体ゲルとすぐに交換して、チャンバーを最上位まで満たします。
- ユニットを温度コントローラーから約10分間外し、ゲルがチャンバー内の内腔内および内腔の外側で固化するようにして、動脈のあるチャンバーをRTで休ませます。これにより、動脈がゲルに完全に埋め込まれ、その三次元構造が維持されます。
- 細い鉗子を使用して、ナイロン縫合糸を緩め、カニューレをチャンバーからそっと引き出します。
- 動脈を含む固化ゲル全体をチャンバーから70%エタノールで満たされた容器に移します。エタノールは、さらなる処理までサンプルを保存するための保持溶液として機能します。
注:三方弁は、ゲルを注入する前に気泡を簡単に除去できます。ゲルの固化は、清潔なピペットチップを使用してチャンバー内のゲルにそっと触れることで確認できます。
9.病理組織学
- ゲルの中にいるまま動脈を横方向に切断し、これらのサンプルを組織処理機に入れて、製造元の指示に従って処理します。
- 続いて、組織を埋め込んでパラフィンブロックを作ります。断面がブロック上で下を向くように、サンプルが「端」に埋め込まれていることを確認します。
- ミクロトームを使用して、厚さ5μmの軸切片を切断します。切断した部分を粘着スライドに移します。
- 切片を60°Cで1時間焼き、キシレンで脱ワックスし、続いて段階的なアルコール洗浄で再水和します。
- 日常的な組織病理学のために切片をヘマトキシリンとエオシン(HE)で染色し、1%酸性アルコールで分化します。適切な顕微鏡を使用して光学顕微鏡下で切片を検査し、互換性のあるカメラを使用して写真を取得します。
10.免疫組織化学
- メーカーのプロトコルに従って、ポリマー微粒子検出システムを備えた自動システムを使用して染色を実現します。
- 組織切片を脱ろう液で72°Cで30秒間脱ワックスし、段階的なアルコール洗浄液と洗浄液で切片を再水和します。
- エピトープ回収溶液1中で切片を100°Cに20分間加熱することにより、熱誘起エピトープ回収を行い、過酸化物ブロックを5分間塗布して内因性ペルオキシダーゼ活性を消光します。
- 一次抗体(抗CD31または抗平滑筋アクチンなど)をバックグラウンド還元抗体希釈液で希釈した適切な濃度で適用します。切片を西洋わさびペルオキシダーゼポリマーと8分間インキュベートし、切片を発色剤溶液で10分間着色します。スライドをヘマトキシリンで5分間対比染色します。
11. RNAScope 発色 in situ ハイブリダイゼーション
- メーカーのプロトコルに従って、適切なキットとポリマー精製赤色検出キットを備えた自動システムを使用して染色を実行します。
- 切片を60°Cで30分間焼き、72°Cに加熱した脱ろう溶液で30秒間切片を脱ろうします。
- 無水エタノール洗浄液と洗浄液で組織を再水和します。
- 切片をエピトープ回収溶液2で95°Cで15分間処理し、切片を酵素溶液で40°Cで15分間インキュベートします。
- サンプルを標的遺伝子に適したRNAScopeプローブとハイブリダイズします。
- 培地発現ハウスキーピング遺伝子プローブ(ペプチジルプロリルイソメラーゼBなど)を使用して、適切なRNA存在量と完全性を確認します。
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結果
ヒト大網組織は、臨床的に必要な腹部手術を受ける患者から採取されました。小さな抵抗動脈(直径100〜300μm)を解剖顕微鏡下で周囲の脂肪および結合組織から細心の注意を払って分離しました(図1A-C)。単離された動脈を洗浄し、カニューレ挿入に成功し、加圧のために培養ミオグラフチャンバー内のガラスカニューレに取り付けました(図1D-F)。動脈は 60-80 mmHg に加圧されても生理学的寸法と緊張を維持し、カニューレ挿入が成功したことを示しています。60〜80 mmHgの一定圧力で10%中性緩衝ホルマリンで動脈を固定すると、動脈壁と細胞成分の構造的完全性が維持されました。動脈は自然な構造を保持しており、内皮層と平滑筋層が明確に定義されています。生存率試験実験では、60 mM KClにさらされると動脈が収縮し、洗浄後に直径がベースラインに戻ることが示されました(
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ディスカッション
医療画像、手術技術、研究方法論の進歩により、3D 血管構造に対する理解が深まり、診断、手術計画、研究に革命が起こりました 17,18,19,20。これらの革新にもかかわらず、孤立したヒト抵抗動脈の 3D 構造を維持することは、その繊細で複雑な性質により依然として困難であり、分離とイメージングが複雑になり、解剖学的および生理学的特徴の包括的な研究が制限されます。これに対処するために、私たちは、孤立したヒト抵抗動脈の天然構造と細胞の完全性を効果的に維持する管腔内ゲル注入の高度な方法を開発しました。
この技術は、天然動脈の生理学的寸法と構造的特性を保持します。明確に定義された内皮層と平滑筋層、および血管壁の三次元組織を保持し、詳細な組織病理学的検査と高度な画像分析を容...
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開示事項
NIAID GenAI を使用して原稿の最初のアウトラインとドラフトを作成し、正確性と一貫性を確保するために人間の著者によって徹底的に執筆、レビュー、編集されました。
謝辞
この研究は、HCA のプロジェクト番号 AI001150 である国立アレルギー感染症研究所の学内研究部門から資金提供を受けました。元研究室メンバーのスティーブン・ブルックス博士と、現在の研究室メンバーであるマラリア機能ゲノミクス部門のモハメド・イブラヒム氏、メアリー・ジャクソン氏、ジアン・ウー氏に、プロセス中の画像撮影にご協力いただき、感謝いたします。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 1%フォーカス酸アルコール | 統計研究所 | SL89-1 | |
| 10% NBS | ライカ・バイオシステムズ | 3800598 | |
| 4K顕微鏡HDMIカメラ | ハイテック・インストゥルメンツ社 | HT-XP4K8MA | |
| 抗体希釈剤 - 背景還元法 | ダコ | S3022 | |
| 自動組織処理機など; | ライカ・バイオシステムズ | ヒストコア PEGASUS/Cat# 14048858005 | |
| ボンドデワックス溶液 | ライカ・バイオシステムズ | AR9222 | |
| 結合エピトープ回収溶液1 | ライカ・バイオシステムズ | AR9961 | |
| 結合エピトープ回収解2 | ライカ・バイオシステムズ | AR9640 | |
| 結合ポリマー精製検出 | ライカ・バイオシステムズ | DS9800 | |
| ボンドポリマー精錬赤検出 | ライカ・バイオシステムズ | DS9390 | |
| ボンドウォッシュ溶液(10倍) | ライカ・バイオシステムズ | AR9590 | |
| カニューレパック(ガラス)、80–100 & mu;m | DMT | 製品コード:300407 | |
| CD31 | アブカム | AB28364 | |
| 解剖皿、大型(パイレックスガラス)、93mm | リビングシステム計測 | SKU:DD-90 | |
| 解剖皿、小型 | リビングシステム計測 | SKU:DD-50 | |
| 解剖顕微鏡 | ハイテック・インストゥルメンツ社 | ツァイス・ステレオ・ディスカバリー.V8 | |
| デュモン #5 鉗子 | ファインサイエンスツール | 品番11295-10 | |
| デュモン・#5SF・ピンセット | ファインサイエンスツール | 品番11252-00 | |
| エコマウント | バイオケア・メディカル | EM897L | |
| エオシン | IHCワールド | IW-3100B | |
| ヘマトキシリン | バイオケア・メディカル | キャテム・ミム | |
| カメラを動かす | オリュンプス | DP28 | |
| イメージング顕微鏡 | オリュンプス | BX51 | |
| クレブス・ヘンゼライト緩衝剤(2 mM塩化カルシウム使用) | ボストン・バイオプロダクツ社 | SKU:C-10625N-200mL | |
| クレブス・ヘンセライト緩衝法(カルシウムなし) | ボストン・バイオプロダクツ社 | SKU:C-9906W-200mL | |
| マウンティングメディア | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | 4111 | |
| マイオグラフチャンバーとユニット | DMT | 202/204CM | |
| PBS(リン酸緩衝生理食塩水) | サーモフィッシャー・サイエンティフィック | 10010023 | |
| PPIB | ACDBio | 313908 | |
| RNAscope 2.5 LS試薬キット-RED | ACDBio | 322150 | |
| ステイナー | ライカ | ライカボンドRX自動システム | |
| ステンレス鋼の解剖ピン | リビングシステム計測 | SKU:ピン-0.1MM |ピン 0.2MM |ピン#3 |ピン-VP-1 | |
| サージパス・パラプラスト | ライカ・バイオシステムズ | 39601006 | |
| ティッシュガードジェル | 統計研究所 | ティッシュガード/SKU:TG12 | |
| ヴァンナズスプリングシザーズ - 2mmカッティングエッジ | ファインサイエンスツール | 品番15000-03 | |
| Vannasスプリングシザー - 2.5mmカッティングエッジ | ファインサイエンスツール | 品番15000-08 | |
| Vannasスプリングシザーズ - 3mmカッティングエッジ | ファインサイエンスツール | 品番15000-00 | |
| α-SMA | アブカム | AB5694 |
参考文献
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