心筋梗塞のラットモデルにおける標的で信頼性の高い心筋内幹細胞送達のための心エコーガイド下注射

サマリー

この記事では、29 G x 88 mm の針を使用した心筋梗塞のラット モデルにおける心エコー検査ガイド下心筋内注射の最適化されたプロトコルについて詳しく説明します。この技術により、堅牢で正確かつ再現性のある治療薬が梗塞周囲ゾーンに直接送達されることが保証されます。

要約

心エコー検査ガイド下心筋内注射 (EGI) は、前臨床心筋梗塞 (MI) モデルで幹細胞療法を提供するための低侵襲技術です。従来の開胸アプローチと比較して、EGI は臨床的翻訳性が向上し、侵襲性が低減され、動物への生理学的影響が最小限に抑えられます。EGI はマウス モデルで十分に確立されていますが、解剖学的および技術的な課題により、ラットへの応用は依然として限られています。特に、梗塞領域および梗塞周囲領域の左心室前壁 (LVAW) が薄くなると、壁の厚さが一般的に使用される 27 G または 28 G 針の針のベベル サイズを下回る可能性があり、心室穿孔または分娩失敗のリスクが高まるため、安全で正確な心筋送達が複雑になります。この制限に対処するために、29 G スピノカン針を使用してラット MI モデルにおける EGI のプロトコルを最適化しました。より小さな直径で長い針により、LVAWの厚さに関係なく、薄い心筋組織を正確にターゲットにすることができ、損傷を最小限に抑え、注射精度を向上させます。この技術は、標準的な経胸壁心エコー検査プラットフォームと互換性があり、開胸術の必要性がなくなり、同じ動物での縦断的研究が可能になります。私たちの洗練された方法により、再生療法が最も効果的な梗塞ゾーンに隣接する生存可能な心筋への治療薬の堅牢で再現性のある送達が可能になります。このアプローチは、安全性と標的精度を向上させることにより、前臨床心臓研究のトランスレーショナル関連性を高め、研究室全体で標準化されたプロトコルの開発をサポートします。

概要

心血管疾患は依然として世界中で罹患率と死亡率の主な原因であり、心筋梗塞 (MI) は急性および慢性の両方の心疾患に大きく寄与しています¹。薬理学的および介入的管理の進歩にもかかわらず、成人の心臓の再生能力は限られており、多くの場合、有害なリモデリングや心不全への進行を引き起こします ^2,3。その結果、幹細胞ベースの治療は、損傷した心筋を修復し、心機能を維持し、臨床転帰を改善するための潜在的な戦略として注目を集めています⁴。

これらの治療法の安全性、有効性、および提供戦略を評価するには、堅牢な前臨床モデルが不可欠です。小動物モデルの中で、ラットは、管理可能な心臓サイズ、十分に特徴付けられた梗塞技術、翻訳的に関連する心臓リモデリング反応など、いくつかの利点^{を提供します5。}従来、ラット心筋梗塞モデルにおける幹細胞の心筋内投与は開胸術によって行われ、注射部位^を直接可視化することができた6。ただし、このアプローチは侵襲的であり、重大な処置上のリスクをもたらし、縦断的研究における繰り返しの介入を妨げます。さらに、カテーテルベースや経皮注射などの臨床送達法との整合性が欠けています⁷。

心エコー検査ガイド下心筋内注射 (EGI) は、リアルタイムの画像ガイダンス下で治療薬の標的送達を可能にする低侵襲の代替手段です。マウスモデルでは十分に確立されていますが、ラットモデルでのEGIの使用は限られています。EGI は、主にほとんどの心血管研究が歴史的に主要な前臨床モデルとしてマウスに焦点を当ててきたため、ラットよりもマウスでより広範囲に開発されています⁸。さらに、マウスのサイズと心臓の解剖学的構造が小さいため、超音波ガイド下手順の最適化が可能になりました⁹。対照的に、ラットは胸壁が厚く、呼吸運動が大きいため、処置中の安定した高解像度イメージングが複雑になります¹⁰。

高周波超音波技術の進歩により、ラットでの EGI が実現可能になり、その使用の臨床的関連性が高まりました。しかし、梗塞領域の左心室前壁 (LVAW) の薄化は、げっ歯類の EGI にとって依然として大きな課題です。ラットでは、壁の厚さはしばしば1 mm未満に減少しますが、標準の27 Gまたは28 G針のベベル長は1.25〜1.5 mmであり、心室穿孔または方向不良の細胞送達のリスクが高まります。この制限に対処するために、29 G x 88 mmのスピノカン針を利用して、ラットのEGI技術を改良しました。これらの針は 1 mm のベベル長を特徴としており、梗塞および梗塞周囲領域の薄くなった心筋に細胞を正確で非外傷的に送達できます。この手順は高解像度の経胸壁心エコー検査を使用して実行され、解剖学的ランドマークと針の軌跡の両方をリアルタイムで視覚化できます。

この洗練されたEGIプロトコルは、LVAWの厚さとは無関係に、急性および慢性心筋梗塞の両方のラットモデルにおいて、梗塞周囲心筋に治療薬を標的に送達するための低侵襲で再現性のある方法を提供します。これは、開胸アプローチと比較して手術の負担と回復時間を大幅に短縮しながら、治療効果を達成するための重要な部位である実行可能な境界ゾーンへの注射を容易にします。さらに、繰り返し注射とフォローアップイメージングを含む縦断的研究をサポートし、それによって3R(Replacement、Reduction、Refinement)原則¹¹に従って動物の数を減らします。このプロトコルは、薬理学的薬剤、遺伝子治療、生体材料、およびさまざまな種類の幹細胞の送達に適応できます。このアプローチは、ラットモデルにおけるEGIを標準化し、臨床送達モダリティと連携させることで、検査室全体の再現性を高め、前臨床心臓研究のトランスレーショナル関連性を強化します。

プロトコル

すべての動物実験は、UHasselt の地方倫理委員会 (動物実験倫理委員会、UHasselt、Diepenbeek、ベルギー、ID202308 および ID202497) によって承認され、EU 指令 2010/63/EU に従って実施されました。

1. 機器のセットアップ

1. 超音波イメージングプラットフォーム、統合加温プラットフォーム、生理学モニタリングユニット、およびゲルウォーマーの電源を入れます。
   注:EGI処置中に左心室前壁を明確かつ十分に詳細に視覚化できるようにするには、約75μmの軸方向分解能を提供する≥15MHzリニアアレイトランスデューサーを備えた高周波超音波システムが推奨されます。
2. 胸毛除去中にラットの体温を維持するために、温熱パッドをオンにします。
3. 適切なトランスデューサを選択し、3Dモーターを初期化して、トランスデューサの全可動域を確保します。
   注:動物のプラットフォーム手すりシステムのマイクロマニピュレーターを使用することに加えて、3Dモーターは高精度のトランスデューサー調整を可能にし、必要に応じて注射針との位置合わせを容易にすることができます。必要に応じて、3Dモーターなしで手順を実行することもできます。
4. イメージングする前に、システムが適切に位置合わせされていることを確認してください。動物のプラットフォームを制御するネジのマイクロマニピュレーターをニュートラル位置(つまり、可動域全体の中央)に設定します。動物プラットフォーム自体を手すりの中央に配置します。トランスデューサが動物プラットフォームの中心の真上に揃うように、トランスデューサ取り付けシステムを配置します。

2.動物の準備と麻酔

1. ラットの体重を量り、鎮痛に必要な量のブプレノルフィン(0.04 mg / kg)を計算します。
2. ラットを麻酔器に接続された誘導チャンバーに入れます。酸素を添加した2.5%イソフルランを2 L /分の流速で麻酔を誘発します。
3. 麻酔が誘発されたら、ラットを加熱パッドに移して体温を37 0.5°Cに維持します。 ラットの鼻を麻酔システムに接続された鼻錐に配置し、適切な鎮静を確保するために必要に応じて調整された1〜3%イソフルランを1〜1.5 L / minの酸素で補充して一定の流量を供給することにより、適切な麻酔を維持します。
4. ラットの胸を剃り、脱毛クリームで残った毛を取り除きます。脱毛後、適切な外科用スクラブ剤(ポビドンヨードなど)と70%エタノールを交互に使用し、3回繰り返して注射部位を消毒します。乾燥を防ぐために両目に点眼用ジェルを塗布してください。
5. EGI に関連する不快感を最小限に抑えるために、事前に計算された用量のブプレノルフィンを後脚に筋肉内投与します。
6. ラットを加熱パッドから超音波画像システムの動物プラットフォームに移します。プラットフォームに内蔵されたノーズコーンを介して一貫した麻酔供給を確保し、1-1.5 L/minの酸素で1-3%イソフルランの安定した流れを維持します。ラットの足をプラットフォーム電極に固定し、少量の電極ゲルを塗布して最適な信号品質を確保します。直腸温度プローブを挿入して、継続的な体温モニタリングを行います。
   注: 生理学的パラメーターの継続的なモニタリングは、イメージングおよび注射手順全体を通じて不可欠です。ラットの心拍数 (HR)、呼吸数 (RR)、および体温は、麻酔関連の合併症を回避するために許容範囲内にとどまらなければなりません。一般的なガイドとして、HR は 250-400 bpm の範囲である必要がありますが、RR は少なくとも毎分 30 回の呼吸である必要があります。HRまたはRRがこれらの閾値を下回った場合は、直ちにイソフルラン濃度を下げ(例えば、2〜3%から1〜2%に下げ)、動物が適切な位置を維持し、低体温状態にならないことを確認します。パラメータが目標レベルに戻るまで注意深く監視しながら、徐々に調整を行う必要があります。
7. この段階で、必要なベースラインまたは注入前の画像を取得します。一般に、B モードと M モードの両方の胸骨傍長軸 (PSLAX) 画像と短軸 (SAX) 画像、および 4 チャンバー画像が、ベースラインの機能的および解剖学的評価に推奨されます。
   メモ:一般的なイメージングは、 図1Aに示すようにシステムをセットアップして実行できます。注射手順では、動物プラットフォームを再配置し、それに応じてトランスデューサーを調整する必要があります。PSLAX B モード イメージングは注射中のガイダンスに使用されますが、正確な針の位置合わせが必要なため、これらの画像は事後機能分析には最適ではない可能性があります。

3. 心エコー検査ガイド下心筋内注射手順

注:この時点から、注入を正常に実行するには2人のオペレーターが必要です。オペレーター A は動物プラットフォームを操作し、ライブ心エコー画像を監視する責任があり、オペレーター B は注射マウントの後ろに身を置き、針とトランスデューサーを正確に位置合わせする必要があります。

1. 22 Gガイド針を1 mLシリンジに取り付けて、注入システムを準備します。ガイドニードル付きのシリンジをインジェクションマウントに置き、インジェクションクランプを固定します。
   注:29 G x 88 mmの針は柔軟性がありすぎて、皮膚や筋肉層に直接穴を開けることができません。注射を容易にするためにガイド針が必要です。
2. トランスデューサーをインジェクションマウントに合わせて、針を視覚化できるようにします。トランスデューサーマウントと保持クランプを使用してトランスデューサーの位置を調整し、必要に応じてインジェクションマウントをレールに沿って回転させて適切な位置合わせを実現します。
3. ラットを動かさずに、トランスデューサーのノッチがラットの右肩を向くように動物プラットフォームを回転させます(図1B-D)。このセットアップにより、左心室の鮮明なPSLAX Bモード画像を取得できます。ガイド針がトランスデューサの可動領域内にとどまっていることを確認します。位置がずれている場合は、インジェクションマウントを変更するのではなく、3Dモーターシステムを介してトランスデューサーの位置を調整してください。
4. 針とトランスデューサーの正しい位置合わせが達成されたら、動物プラットフォームレールのマイクロマニピュレーターネジを使用してイメージングを微調整します。針との位置合わせを維持するために、トランスデューサーの位置を維持します。画質を最適化するために、動物プラットフォームの追加の回転または移動が必要になる場合があります。
5. 梗塞領域を視覚化します。PSLAX B モードと M モードの両方のイメージングを使用して、梗塞の程度、局所的な壁の動き、および壁の薄化を評価し、注射部位の実現可能性を評価します。16セグメントの壁運動スコアリングアプローチを適用して、梗塞コアを表す無動性または重度の低運動性領域を特定します。
6. 梗塞周囲ゾーンを特定し、ターゲット注入部位を選択します。拡張末期壁厚が1 mmを超える梗塞コアに隣接する運動低下領域を選択し、29 G針ベベルを浅い角度で完全に挿入できます。
7. レールシステムを使用して、インジェクションマウントを動物プラットフォームに向かって前進させます。インジェクションマウントのマイクロマニピュレーターネジを使用して、針をトランスデューサーの正確な中央に微調整します。
   注:正確な位置合わせが重要です。針がトランスデューサーの中心にない場合、注射中に針は見えません。
8. 皮膚に穴が開くまで、注射マウントのインジェクションマイクロマニピュレーターネジを使用してガイドニードルを前進させます。超音波画像に針先が見えることを確認します。針が見えない場合は、「注入」マイクロマニピュレーターネジを使用して針を慎重に引っ込め、手順3.7を繰り返して再調整します。
9. 超音波ソフトウェアの針ガイド機能を有効にして、針の軌道を確認します。ガイド針を所定のターゲット領域に向かって進め、針のベベルを左心室前壁(LVAW)から約1〜2 mm位置に配置します(図2A)。
   注:過度の出血や心臓損傷を防ぐために、ガイド針で心筋に穴を開けないでください。
10. 針が配置されたら、オペレーター A にガイド針の根元をしっかりと安定させ、超音波画面上で針が常に視覚化されるようにします。同時に、オペレーターBにシリンジを固定しているクランプを緩め、シリンジを取り外し、注射注射器を準備するように依頼します。オペレーターAにガイド針を静止させておくように指示します。
11. 注射液が入っているシリンジ(オペレーターB)に29 G x 88 mmの針を取り付け、シリンジを注射マウントに固定します。29 G x 88 mmの針を固定ガイド針に手動でガイドし、必要に応じてx軸面(プローブの左側または右側)のマイクロマニピュレーターネジで微調整を行います。超音波で胸腔内に針の斜角が見えるようになるまで、手動で進めます。
    注:29 G針は柔軟性があるため、胸腔への挿入中に曲がる可能性があります。これを最小限に抑えるために、オペレーター A は針軸の外側部分を安定させ、オペレーター B は針を胸腔内に進めることができます。
12. 29 G x 88 mmの針がガイド針を通過し、超音波で見えるようになったら、マイクロマニピュレータースクリューを使用してLVAWの心筋に進め、精度と安全性を高めます。針の斜面が完全に心筋内にあることを確認します(図2B)。
    注:29 G針は心筋壁の厚さに比べて比較的長いベベルであるため、ベベル全体が心筋内に埋め込まれていることを確認することが重要です。必要に応じて、「画像のフリーズ」機能を使用して配置を確認します。超音波深さの校正は精度に役立つ可能性がありますが、このプロトコルでは、拡張末期の壁厚>1 mmの注射部位を選択し、針先が心内膜境界に近づいているが、破っていないことを目視で確認することにより、深さを検証しました(図2B)。
13. 注射液を心筋にゆっくりと注入します(オペレーターB)。心筋内注射の成功は、注射部位の明るい/密なエコー源性スポットによって視覚的に確認され、LVAWと同期して移動する必要があります(図2C)。注射液の逆流を最小限に抑えるために、注射完了後約10秒待ってから針を引っ込めます。
14. まず、針刺しによる怪我のリスクを最小限に抑えるために、針付きの注射器を注射マウントから取り外します。次に、ラットを動物のプラットフォームから慎重に取り出し、加熱パッドの上で回復させます。麻酔から完全に回復するまで、バイタルパラメータを継続的に監視します。

結果

in-vivoおよびex vivo生物発光イメージング(BLI)による注入精度の検証
EGIの成功と効率を評価するために、まず幹細胞をレンチウイルスベクターを介してホタルルシフェラーゼ(Fluc)を発現するように形質導入し、生物発光イメージング(BLI)による in vivo 追跡を可能にしました。BLI は、症例の 86% (n = 14) で正確な心筋内送達を確認しました。 図3A は、隣接する胸腔内の拡散発光によって証明される、過度に急速な針の引き抜きに起因する部分的な漏れを示しています。対照的に、心筋内注射が完全に成功した後、左心室中央頂点レベルで強力な局所的なFluc信号が検出されました(図3B)。心筋送達をさらに確...

ディスカッション

心筋梗塞後の心臓を回復させる再生療法に着目した前臨床研究が進む中、最適な治療薬の送達に関するハードルは依然として残っています¹²。低侵襲 EGI 技術は、臨床経皮的送達をよりよく模倣し、動物福祉を改善し、縦断的研究で反復投与を可能にするため、開胸アプローチよりもますます好まれています ^8,13。しかし、ラットモデルのための詳細で標準化されたプロトコルは不足しており、慢性梗塞周囲ゾーンの左心室前壁(LVAW)の顕著な薄化により手順が複雑になります¹⁴。ここでは、慎重な手順の改良により、ラット心筋におけるEGIの安全性、精度、再現性を大幅に向上させました。

一般的な注意事項と重要な手順
ラットにおける心筋内EGI処置の成功には、麻酔の慎重な管理と生理学的パラメーターの継...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
21?MHz MX250トランスデューサ	富士フイルムビジュアルソニックス株式会社	/	Vevo 3100システムに対応した高周波超音波トランスデューサ
3Mトランスポアサージカルテープ	3メートル	1527	動物の足を動物のプラットフォームに固定するには
アクアソニック 100超音波透過ゲル	パーカーラボラトリーズBV	01-08	トランスデューサーと動物の皮膚の間の適切な音響結合を確保し、最適な画質を実現します。
Bupaq 0.3 mg/mL 犬および猫用注射液	リヒターファーマAG	57446/4008	疼痛管理のために投与されるオピオイド鎮痛薬(ブプレノルフィン)
イソフルテック 1000	アリビラ	/	イソフルランベースの吸入麻酔薬
マルチボトルジェルウォーマー 230 V	パーカーラボラトリーズBV	83-03-20 CE(LCD)	超音波ジェルを体温まで温め、動物の不快感による低体温症を防ぎます
シグナゲル電極ゲル	パーカーラボラトリーズBV	15-25	ECG電極に適用され、生理学的モニタリングのための信号伝導を改善します
スピノカン 29 G X 88 MM	ブブラウン	4501900	精密な心筋内注射のためのファインゲージ針
テルモ 3 部式注射器、皮下注射針があらかじめ接続されています	テルモ・ヨーロッパN.V.	MDSS01S2516E	心筋への制御された送達のために、22 Gガイド針と29 G注射針を取り付けて固定するために使用されます。
THM150 生理モニタリングユニット	富士フイルムビジュアルソニックス株式会社	/	処置中の動物の心拍数、呼吸数、体温などのバイタルサインを監視します。
ヴィートミニマピュア	レキットベンキーザー	/	脱毛クリーム
ヴェボ3100	富士フイルムビジュアルソニックス株式会社	/	高解像度超音波システム
Vidicic カルボメラム 980 2mg/g 点眼用ゲル	バウシュ+ロンブ	/	角膜の乾燥を防ぐために麻酔動物の目に適用します