マウス採血のための顔面静脈静脈穿刺

サマリー

ここでは、ランセットを使用した顔面静脈静脈穿刺によるマウス被験者の最適化された採血技術のプロトコルを提示します。この手法をフローサイトメトリー評価と併用して、トランスジェニック株、先天性株、レポーター株の細胞表現型を特徴付けます。また、血清サイトカイン分析や糖尿病研究にも適しています。

要約

この論文では、ランセットを使用した顔面静脈静脈穿刺によるマウス採血の最適化されたプロトコルを提示し、尾静脈や眼窩後サンプリングなどの他の一般的な技術に代わる、迅速で低侵襲で費用対効果の高い代替手段を提供します。この技術は、マウス表現型解析、血清サイトカイン分析、糖尿病研究など、繰り返しサンプリングを必要とする研究に特に有利です。このプロトコルは効率的で、必要な特殊機器は最小限で済み、マウスのハイスループット細胞分析に適しています。私たちの主な用途は、フローサイトメトリーを使用したトランスジェニックマウス、先天性マウス、およびレポーターマウスの表現型解析であり、ここでは抗体染色とtdTomatoレポーターマウスで実証されています。この論文では、動物の調製からサンプル分析までの完全な手順の概要を説明しています。主なステップには、3 mmランセットによる採血、細胞溶解、染色、フローサイトメトリープロファイリングが含まれます。顔面静脈静脈穿刺は、倫理的な研究実践をサポートしながら、収集効率を高めます。この実用的で適応性のある方法は、マウスの採血や細胞分析を含む幅広い実験プロトコルに適しています。

概要

効率的で再現性があり、低侵襲の採血は、多くのマウス研究、特に繰り返しサンプリングを必要とする研究に不可欠です。このプロトコルは、顔面静脈静脈穿刺、その後の赤血球溶解、抗体染色、およびフローサイトメトリー分析を使用して少量の血液を採取するための合理化された方法を提供します。このワークフローは、技術的な複雑さを最小限に抑えながら、ハイスループットのアプリケーションに適しています。

眼窩後出血や尾静脈切開などの多くの採血方法では、熱、麻酔¹、長時間の取り扱いを含む処置が必要になる場合があり、動物に重大な苦痛を与える可能性があります²。対照的に、ランセットによる顔面静脈静脈穿刺は、倫理的で再現性のある実験計画をサポートするシンプルかつ迅速な代替手段を提供します。この方法は、マウスの少量の採血のための人道的な代替手段として以前の研究で検証されています³。

この方法は、TdTomatoレポーターマウスやMD4-IgHELマウスを含むトランスジェニックマウスおよびレポーターマウスの免疫細胞を表現型化することによって説明します。後者は、CD19およびIgMアロタイプであるIgMaに対する抗体で染色する必要があります。

このプロトコルは血液細胞プロファイリング用に開発されていますが、赤血球溶解ステップを省略することで、血清サイトカイン分析、特異的抗体検出、グルコース測定などの他の用途に簡単に適応できます。全体として、この技術は動物の苦痛を最小限に抑えながら、データの品質と実験効率を向上させ、さまざまな研究用途で広く役立ちます。

プロトコル

マウスは、AAALAC 認定機関であるダートマス ヒッチコック医科大学の特定の病原体のない環境に収容され、施設動物管理および利用委員会の下で承認されたプロトコルに従って使用されました。

1. 材料の収集

1. それぞれ1.5 mLの1x 赤血球(RBC)溶解バッファー(滅菌水で希釈した10X RBC溶解)を含む5 mLの培養チューブを調製します。マウス1本につき1本のチューブを使用します。
2. 3 mmランセットの箱(マウスごとに1つのランセット)を集めます。
3. ガーゼスポンジの箱(マウス1匹につきガーゼスポンジ1枚)を集めます。
4. トランスファーピペットと、0.5 mM EDTAを含む1x HBSSを含む50 mLコニカルチューブ(最大20匹のマウスに十分)を集めます。
   注:このバッファーは、溶解反応を停止するために使用されます。バッファーが表現型解析にのみ必要であり、それ以上の下流分析には必要ない場合は、HBSSの代わりにpH 7.2〜7.4のほとんどの中性バッファーを使用できます。
5. アイスバケツ、追加の1x RBC溶解バッファー、追加の5 mLチューブ、および移送ピペットを持参してください。

2. マウスとチューブのラベリング

1. 各ケージカードとマウスに、各チューブのラベルに対応する表現型識別子をラベル付けして、どの結果がどのマウスに関連しているかを区別するのに役立ちます。一般的に使用される識別子には、マウスの尻尾にあるさまざまな油性マーカーの色 (赤、青、緑、黒など) が含まれており、これらはチューブのマーキングに対応します。
   注:表現型解析のために常にコントロールマウスを同梱してください。レポーターマウスの場合、ネガティブレポーターコントロールがあることを確認してください。トランスジェニックマウスの場合、野生型マウスを対照として含めます。
2. ラベル付けされたチューブをラックに並べ、近くにアイスバケツを置き、採血直後にチューブを保管します。
3. 手順に必要なすべてのランセットを開きます。
4. 手順に必要なすべてのガーゼスポンジを開きます。

3. マウスの取り扱いとサンプル採取

1. 利き手でマウスの尻尾をつかみ、給電ラックまたは平らな面に置きます。
2. 利き手ではない人差し指と親指を使用して、尾から頸部に向かって操作してマウスを首筋にします。
3. 残りの指を使って尻尾を固定し、マウスの動きを最小限に抑えます。
4. 利き手を使って、開いた3mmランセットを取り出します。
5. 口のすぐ向こうにある小さな無毛スポットを見つけ、耳に向かって直線をなぞります。線が目の外側の角と交差するところで停止します(図1)。
6. 十分な血液供給を確保するために、この交差点にランセットを挿入します。
7. ランセットの平らな側縁を使用して、1滴の血液を採取します。
8. 血液サンプルを含むランセット全体を、赤血球溶解バッファーを含む標識チューブに沈着させます。
9. チューブを軽くかき混ぜて、サンプル全体がバッファーに混合されるようにします。混合が不完全な場合、凝固やデータ品質の低下を引き起こす可能性があります。
10. ガーゼスポンジを使用して、穿刺部位に5〜10秒間穏やかな圧力をかけます。
11. マウスをケージに戻します。
12. 血液と溶解の緩衝液比を1:10以上に維持します。
13. マウスを追加するたびに、このセクションの手順を繰り返します。

4. サンプルの溶解、調製、分析

1. 溶解開始後7〜10分間待って、約2 mLの1x HBSSを0.5 mM EDTA(または他の培地)で添加します。
2. チューブを400 g で5分間遠心分離します。この間、抗体カクテルを準備します。
3. 上清を捨てます。
4. 鉗子を使用してチューブからランセットを取り外します。
5. 目的の細胞集団を同定するように設計された抗体カクテルを30 μL加えます。
   注:MD4 IgHELマウスの表現型を決定するために、当社のカクテルは1 mLのHBSS、25 μLのIgMa PerCP cy-5.5、および25 μLのCD19 APCで構成されていました。
6. ボルテックスして細胞を2〜3秒間再懸濁し、4°Cで25〜30分間インキュベートします。
7. フローサイトメーターの電源を入れ、実験のニーズに合わせてフロープロットを設定します。
   注:目標が表現型検査である場合、染色後に細胞を回転させる必要はありません。
8. トランスファーピペットを使用して、150〜25 μLのHBSSまたはその他の培地を各サンプルに加えます。必要に応じて、DAPIを最終濃度1.μg/mLで添加できます(10μLのDAPI含有培地を使用)。
9. 取得直前に各サンプルを2〜3秒間ボルテックスします。
10. 8,000-10,000イベント/秒のデータを取得し、溶解が有効であれば100,000細胞を目指します。
11. 図2と図3に示すように、取得したデータを解析します。

結果

フローサイトメトリーを用いて、 図2 は、上記のプロトコルを用いて調製した野生型(WT)およびPF4-Cre TdTomatoレポーターマウスからの溶解血液を示す。フロープロットの最初のセットは、セルの粒度を反映する側方散乱(SSC)と、セルサイズを示す前方散乱(FSC)を示しています。細胞破片と血小板は軸の起点付近で観察されますが、リンパ球はより粒状の好中球に比べて小さく見えます。破片と生細胞がはっきりと分離されていることは、効果的な赤血球溶解と良好なサンプルの完全性を示しています。レポーターマウスは、前方散乱(FSC)に対する蛍光強度(レポーターチャネルから)をプロットすることによって評価できます。 図2で予想されるように、PF4-Creマウスは、WTマウスとは対照的に、細胞破片内にTdTomato⁺血小板を示します。

このサンプルでは抗体は必要なかったため、一貫した血液の取り扱いと処理によって達成できる透明度と分解能がさらに強調されました。

図3は、WTおよびMD4 IgHELトランスジェニックマウスからの血液サンプルを示しています。まず、サンプルをSSC対FSCとしてプロットして生細胞をゲートし、続いてCD19対IgMa染色を行いました。CD19 は B 細胞をマークし、MD4 IgHEL B 細胞は IgMa⁺ ですが、WT B 細胞はそうではありません。最小限の塗抹標本と明確に定義された細胞クラスターは、効率的な溶解と抗体染色を反映しており、下流の免疫表現型検査のためのプロトコルの再現性と有用性を実証しています。

図1:マウスにおけるランセット挿入部位の同定。 マウスをかきぶし、画像に示すように静脈の交点を見つけます。ランセットを90°の角度で挿入します。大きな血滴が現れ、1×溶解バッファーを含む培養チューブに移すことができます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:TdTomatoレポーターマウスの表現型解析。 トッププロット、野生型対照、TdTomato陰性マウス。下部プロット、 Pf4^cre はRosa^LSLtdTom マウスと交配しました。左のプロットは、側方散乱と前方散乱を伴う溶解血球を示しています。中心細胞:小さな細胞はリンパ球です。より大きな細胞は、好中球と好酸球(このプロットでは容易に見えません)、破片、および下隅の血小板です。右のプロットは、tdTomatoレポートセルと前方側散布です。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:MD4 IgHELマウスの表現型解析。 トッププロット、野生型対照マウス。下部プロット、MD4IgHELマウス。左フロープロットは、側方散乱と前方散乱による溶解血球を示しています。小さな細胞はリンパ球です。より大きな細胞は好中球と好酸球です(このプロットでは容易に見えません)。右のプロットは、ゲート付き生細胞、CD19 対同種型 IgMa を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

この最適化された顔面静脈採血プロトコルは、尾静脈や眼窩後出血など、他の一般的に使用される方法に代わる効率的かつシンプルな代替手段を提供します。プロトコルはシンプルで簡単ですが、いくつかの重要な手順に注意深く従う必要があります。適切に実行するための最も重要なステップは、穿刺部位の正しい配置です⁴.頬の適切な位置をターゲットにすることで、マウスへの苦痛を最小限に抑えながら十分な血流が確保されます。血液サンプルを事前に冷却された溶解バッファーにすぐに沈着させることも、凝固を防ぎ、細胞の完全性を維持するため不可欠です。溶解したサンプルを400 x g で5分間遠心分離することは、分析用の生細胞を適切に分離および回収するために重要です。

長年の使用を通じて、データの品質と再現性を向上させるためにいくつかの改良が導入されてきました。手順全体を通してすべての培地とサンプルを氷上に置いておくと、細胞の保存が大幅に強化され、フローサイトメトリー分析中の塗抹標本が減少します⁵。タイミングも重要です。溶解が7分以内に停止すると、赤血球が完全に溶解しない可能性があります。一方、溶解が10分を超えると、過剰な細胞死を引き起こす可能性があります。抗体染色プロトコルでは、使用する特定の抗原または蛍光色素に応じてわずかな調整が必要になる場合もあります。これらの変数にもかかわらず、中核となる採血と準備のステップは、さまざまな実験ニーズにわたって一貫しています。表現型検査を定期的に行う場合は、抗体カクテルを事前に調製できますが、数週間以上保管しないでください。

眼窩後サンプリングの大きな欠点の 1 つは、麻酔の使用です⁶。マウスを麻酔下に置くと、回復を監視する必要があり、これにより、顔面静脈出血には必要ない複雑さと時間の要求がさらに増します⁷.顔面静脈サンプリングに必要な材料と技術トレーニングは少なくて済みます。麻酔薬を使わずに迅速に行うことができ、迅速な結果が得られるため、大量のマウス表現型解析に最適です。尾静脈のサンプリングは一般的ではありますが、時間がかかる場合があります。顔面静脈法は反復サンプリングに適しており、サイトカインモニタリング、糖尿病研究、系統追跡や骨髄キメラマウスモデルにおける免疫表現型分析などの縦断的研究に特に役立ちます。

顔面静脈出血の限界は、過剰採取の可能性と組織外傷の可能性にあります。過剰採取は確かに懸念事項ですが、適切な止血によって過剰採取の可能性を最小限に抑えることができます。^週に1回、総循環血液量の7.5%を摂取することは許容されます8。成体マウスの場合、許容循環血液量はマウス体重の72 mL / ^{kg-1です8。}雌の成体C57BL / 6マウスの体重は平均18〜22gです。これらの数値に基づくと、成体C57BL / 6雌マウスから除去する許容血液量は97μL〜118μLです。私たちの経験に基づくと、顔面静脈出血から得られる血液の平均滴は約30〜50μLであり、他の人はさらに低い平均量を記録し^{ています9。}マウス1匹あたり約1滴の血液が採取されるため、ガーゼへの過剰な出血を考慮しても、循環血液量の7.5%以上を採取する限界を超える可能性は低いです。

組織の外傷や動物の苦痛に関して言えば、顔面静脈静脈穿刺はマウスにある程度の苦痛や不快感を引き起こすと考えられています。この方法は多少の苦痛を引き起こす可能性がありますが、静脈穿刺後に出血が制御されている場合、致命的になる可能性は非常に低いです¹⁰。さらに、採血に顔面静脈を使用する場合、身体的および持続的な外傷は最小限であり、24 時間後の病変と苦痛は最小限に抑えられます^{8、9、10、11}。最後に、ストレスはホルモンレベルの変動やその他の血液構成の変化を引き起こす可能性がありますが、これらの影響はストレッサーが発生してから少なくとも3分後まで起こりません¹² 。上記のプロトコルは、マウスの取り扱いを約30〜60秒間のみ必要とするため、これがこの方法を用いて生成されたデータに影響を与える可能性は低い。

全体として、このプロトコルは倫理的な研究方法を促進し、採血慣行を改良して、収集に費やす時間と動物が拘束される時間を短縮します⁸。低コスト、柔軟性、フローサイトメトリーとの互換性により、免疫学から薬理学に至るまでの分野に幅広く適用できます。少量の血液から高品質の細胞データを生成できるため、このプロトコルは動物実験で実験の精度と迅速な結果の両方を求める研究者にとって貴重なリソースとなります。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
APC抗マウスCD19抗体	バイオレジェンド	152410	CD19 装甲兵員輸送車
遠心分離機5810 R、ローターなし、120 V、50/60 Hz	エッペンドルフ	22625501	遠心分離機
デルマシアガーゼスポンジ 8層 2インチ×2インチ	コロビディエン	441211	グゼ・ポンジ
使い捨て目盛り転送ピペット	フィッシャーブランド	13-711-91am(午前13-711-91)	トランスファーピペット
ErgoOne シングルチャネルピペット(200 & micro;L)	USAサイエンティフィック	7100-2200	ピペット
エチレンジアミネテトラアセチン酸(0.5 M溶液/pH 8.0)	フィッシャーブランド	BP2482-100	EDTA 5 M
FACSymphony A3細胞アナライザー	BDバイオサイエンス	660937	フローサイトメーター
フィッシャーブランド アナログボルテックスミキサー	フィッシャーブランド	02-215-414	渦
Goldenrod Animal Lancet 3mm 無菌トレイ 200本入り	ゴールデンロッド	GR 3MM	ランセット3mm
グレーフェ鉗子	ファインサイエンスツール	11051-10	鉗子
ハンク」バランスソルト溶液、カルシウムとマグネシウムなしの1倍	コーニング	21-021-CVR	HBSS
PerCP/Cyanine5.5 アンチマウス IgMa 抗体	バイオレジェンド	408612	IgMa PerCP cy-5.5
赤血球溶解バッファー(10回)	バイオレジェンド	420301	赤血球溶解バッファー
キャップなしの丸底ポリスチレン試験管	フィッシャーブランド	FB1496110	培養チューブ
シャーピーの永久マーカー、ノミの先端	シャーピー	38254ページ	シャーピー
USPの無菌水の検査も実施しました。	コーニング	25-055-CI	細胞培養グレードの水
TipOneピペットチップリフィル(200 & micro;L ナチュラル・ベベルド)	USAサイエンティフィック	1111-1730	ピペットの先端