哺乳類の遺伝子発現を制御するための光誘導システムの迅速な最適化

誘導性遺伝子発現システムなどの合成生物学ツールは、生物学研究に多大な貢献をしてきました。遺伝子発現を調整可能、可逆的、かつ正確な方法で調節する能力は、タンパク質産生1,2,3,4,5,6、細胞形態^{7,8,9,10,11,12}、代謝経路13,14,15の制御を改善することができます^{、16、17、18}、およびバイオ製造および治療用途のその他のターゲット。化学的誘導性システムは、残留^19,20またはオフターゲット効果を持つ可能性があります。化学添加剤はまた、追加の下流精製プロセスのために非常に高価であり、工業的にスケールアップすることが困難である可能性があります21,22,23。光誘導性遺伝子発現システムは、バイオ製造の実践にスケーラブルで正確な方法を提供できます24,25,26,27。

多くの光誘導性遺伝子発現システムは、様々な用途において有用な合成生物学ツールとして開発されており、^{28、29、30、31、32、33、34、35、36}、青色^35、37、38、赤/遠赤^12、39、40、または緑色^の41ライト。CRISPRベースの光遺伝学的遺伝子調節の場合、送達される個々のガイドRNA(gRNA)の量を変更すると、内因性遺伝子⁴²のmRNA発現に影響を与える可能性があり、さまざまな細胞株に最適化する必要があります。VP64 37,42,43,44、^VP16 39,40,44,45,46、p65 44、またはそれらの融合⁴⁷などのトランス活性化タンパク質も使用でき、光遺伝学的システムのモジュール性を高める。複雑で絡み合った生物学的経路12,40,48,49,50,51,52,53を調査するために、これらの既知の成分のさまざまな組み合わせをテストできます。さらに、異なる細胞株は、同じシステム⁵²で誘導に違いを示すことができる。誘導レベルが異なると、遺伝子発現の正確な制御における遺伝子発現や感度が不十分になる可能性があり、新規またはより生物学的に関連性の高い細胞株で最適な光遺伝学的システムを見つけるには厳密なテストが必要です。光遺伝学的遺伝子調節のペースが速くなり、適用範囲が広がるにつれて、これらのさまざまなシステムを迅速に特徴付けることが不可欠です。

光遺伝学的ツールを特徴付ける現在の方法は、遺伝子の安定発現または一過性発現のいずれかを使用します^12,54。安定して発現する細胞株を生成し、最大限に発現するためにシステムダイナミクスを最適化することは、時間がかかり、したがってコストがかかる場合があります。一過性発現により、特に多成分光遺伝学システムをテストする場合に、迅速かつ貴重な洞察が得られます。ここでは、クリプトクロム2(CRY2)とクリプトクロム相互作用する塩基性ヘリックスループヘリックスN末端(CIBN)で構成される青色光活性化CRISPR-dCas9エフェクター(LACE)³⁷システムを使用しました。これは、HEK293T(ヒト胚性腎臓細胞)^37,38、CHO-DG44(チャイニーズハムスター卵巣細胞)⁵⁵、およびC2C12(マウス筋芽細胞)³⁸などの哺乳類細胞における遺伝子発現を制御するために使用されています。そのモジュール性は、過渡発現およびハイスループット法によるシステム性能の迅速な特性評価に最適です。たとえば、LACEのような多成分システムでは、誘導を改善するために質量比の最適化が必要になる場合がありますが、これは光遺伝学的システムの特性評価では通常採用されないステップです。

このプロトコルは、2つのプラスミドLACE(2pLACE)³⁸システムの迅速な最適化と特性評価を詳述しています。このセットアップでは、2pLACEは、HEK293T細胞における蛍光レポーターであるeGFP(増強された緑色蛍光タンパク質)の発現を制御します。活性化は、Lukasz Bugajらによって設計および構築された3DプリントされたLEDアレイであるOptoPlate-96を使用して、黒色のガラス底96ウェルプレートで実行されます56,57,58,59。このプロトコルは、2プラスミドシステムの異なる質量比で最大発現を特に最適化します。また、さまざまな光強度を制御して、システムの調整可能性とそのフルダイナミックレンジを調査するためのユーザーフレンドリーなコードも含まれています。フローサイトメトリーは、データの収集と分析に使用されます。LEDアレイ用のプラスミド構築物および3Dプリンティング材料を生成するためのプロトコルは、以前の出版物^54,56に記載されています。これらの方法は、光誘導性遺伝子発現システムを特徴付けるための迅速でハイスループットなパイプラインを強調しています。

1. 96ウェルフォーマットのHEK293T細胞のプレーティング

1. バイオセーフティキャビネットに、漂白剤廃棄物容器、血清ピペット、ピペットエイド、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)、10%ウシ胎児血清(FBS)を含むダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)、およびコンフルエントHEK293T細胞を含むT-75細胞培養フラスコを回収します。培地を37°Cに予熱します。
2. T-75フラスコで、倒立顕微鏡でコンフルエントが約80%〜100%コンフルエントであることを確認します。
3. バイオセーフティキャビネットで、血清学的ピペットを使用して、細胞培養フラスコから使用済み培地を吸引します。フラスコの表面やプラスチックに触れないようにしてください。使用済み培地と吸引器は廃棄物容器に廃棄してください。
4. 約10 mLのDPBSをフラスコの隅に吸引し、表面の周りを穏やかに旋回させることにより、細胞を優しく洗浄します。フラスコからDPBSを吸引し、洗浄液と吸引器を廃棄物容器に廃棄します。
5. 1.5 mLの0.05%トリプシン-EDTAを加えてフラスコの表面を覆い、室温で1分間インキュベートします。フラスコを軽くたたいて、表面から細胞をほぐします。
6. 8.5 mLの新鮮なDMEMをフラスコに加えます。上下に吸引してすべての凝集体が破壊されるまで、血清学的ピペットで細胞を再懸濁し、混合します。
7. 9 mLの細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに集めます。
   1. 9 mLの新鮮なDMEMをフラスコに加え、37°C、5%CO₂のインキュベーターに入れます
8. 血球計算盤を使用して、10 μLの懸濁細胞と10 μLのトリパンブルー色素を1:1の比率で混合し、細胞の濃度を計算します。この値を使用して、プレートに播種するのに十分な細胞を準備します。
9. 高性能#1.5黒色96ウェルガラス底板の各ウェルに~35,000細胞を100 μLに播種し、37°Cおよび5%CO₂ のインキュベーターに24時間置きます。

2. 2pLACEトランスフェクションの最適化

1. 1ウェルと10%の過剰分については、11 μLの温かい無血清DMEM(SFM)を1.5 mLの微量遠心チューブに分注します。
2. CRY2-eGFPを使用して:CIBN-gRNAプラスミド質量比を1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、および9:1に等しく、SFMのアリコートにトータルDNAのウェルごとに110 ngをアリコートします(表1)。
3. ポジティブコントロールとして、同じ質量のCMV-eGFPプラスミドをSFMの異なるアリコートにアリコートします。
4. 各ウェルについて、トランスフェクション試薬希釈のために11 μLのSFMをアリコートします。
5. DNAとトランスフェクション試薬の質量(μg)と体積(μL)の比率を1:3でトランスフェクション試薬を調製します。
6. 希釈したDNAに希釈したトランスフェクション試薬を加え、室温で12分間インキュベートしてトランスフェクション複合体を作成します。
7. ~20 μLのトランスフェクション複合体を各ウェルに加えます。井戸の壁に触れないように注意してください。
8. プレートをアルミホイルで包み、37°Cおよび5%CO₂ のインキュベーターに24時間置きます。

3. 2pLACEの活性化

1. これらの設定を使用して、マイクロコントローラーの入力コードを変更して、目的のウェルを照らします(補足コーディングファイル1、147行目から158行目)。
   1. LEDの輝度:9.27 mW/cm² (補足コーディングファイル1、200行目〜215行目)。
   2. パルス長:1秒(補足コーディングファイル1、280行目〜290行目)。
   3. パルス周波数:0.067 Hz(15秒ごと)(補足コーディングファイル1、264行目〜278行目)。
      メモ: 波長の設定は、取り付けられている LED の種類によって決まります。
2. OptoPlateの3Dプリントされた蓋に70%エタノールをスプレーし、バイオセーフティキャビネットで乾燥させます。
3. 暗室の赤色光ランプを点灯し、96ウェルプレートをバイオセーフティキャビネットに入れ、乾燥させた3Dプリントされた蓋に蓋を交換します。
   注:オプションで、蛍光顕微鏡を使用してCMV-eGFP細胞を表示し、トランスフェクション効率を推定できます。
4. 96ウェルプレートを取り、LEDアレイに置き、LEDアレイ装置を構築します。プレートが所定の位置にカチッとはまりていることを確認します。
5. マイクロコントローラ、LED、およびファンポートを電源に接続します。
6. ワイヤーに70%エタノールを慎重にスプレーし、拭いて乾かします。
7. LEDアレイ装置を37°Cおよび5%CO₂ のインキュベーターに24時間入れます。インキュベーターが密閉されているときに、LEDが意図したとおりに点灯し、ワイヤーがピンと張っていないことを確認してください。

4. フローサイトメトリーの調製

1. 赤信号環境では、OptoPlateを取り出し、プレートをバイオセーフティキャビネットに入れます
   注:オプションで蛍光顕微鏡で細胞を観察して、光誘導を視覚的に確認することができます。
2. 各ウェルからすべての培地を慎重に吸引します。
3. 30 μLの0.05%トリプシン-EDTAを使用して細胞を分離し、室温で1分間インキュベートします。
4. 各ウェルを100 μLのコールドFACSバッファー(PBS中の1%FBS)と単細胞化するまで混合します。
5. 各サンプルをV底96ウェルプレートに移します。
6. V底96ウェルプレートを室温で164 x g で10分間遠心分離します。
7. ペレットを乱すことなく80 μLの上清を吸引します。
8. 200 μLのコールドFACSバッファーを加えてペレットを再懸濁します。
9. V底96ウェルプレートをアルミホイルで包み、軽く断熱します。
10. プレートを氷の入った発泡スチロールの箱に入れて輸送します。

5. フローサイトメトリーのゲーティングとデータ収集

1. 背面のスイッチを使用してフローサイトメーターの電源を入れ、コンピューターでそれぞれのフローサイトメトリーソフトウェアを開きます。
2. システム起動プログラムを実行し、サンプルローダーに2 mLのDI水をロードします(補足図1A)。
3. 付属のQCビーズを使用して品質管理(QC)を実行します(補足図1B)。
4. フローサイトメーターがプレートサンプリングモードになっていることを確認します(補足図1C)。
5. サンプルウェルをセットアップして指定します(補足図1D)。
6. 次の散布図と表を作成します(補足図2A)。
   1. サイドスキャッター(SSC-A)とフォワードスキャッター(FSC-A)。
   2. SSC-HとSSC-A。
   3. SSC-A と FITC-A。
   4. FITC-A 統計表 (補足図 2B)。
7. Vボトムプレートをサイトメーターのプレートローダーにはめ込みます。
8. トランスフェクションされていないウェルを選択し、[初期化]をクリックしてから、[実行]をクリックします。体積サンプルレートが10 μL / minであることを確認します(補足図2C)。
9. SSCおよびFITC電圧を調整して、SSC-A対FSC-Aプロットの中心に関心のある母集団を配置します(補足図2C)。
   1. 目的の健康な細胞集団をゲートするポリゴンを作成します(補足図2D)。
   2. SSC-HとSSC-Aのプロットでダブレット識別をゲートするポリゴンを作成します。
   3. FITC電圧を調整して、トランスフェクションされていない細胞をSSC-A対FITC-Aプロットの左側に配置します(補足図2D)。
10. 残りのトランスフェクトされていないウェルについて繰り返し、Mean FITC-Aデータを記録します。
11. CMV-eGFPトランスフェクトウェルを選択し、[実行]をクリックします。
12. FITC電圧を調整して、SSC-AとFITC-Aのプロットで自家蛍光細胞と蛍光細胞の両方をキャプチャします。
    1. トランスフェクトされていない細胞の初期ゲートを参照しながら、蛍光細胞を非蛍光細胞に対してゲートするポリゴンを作成します(補足図2E)。
13. 200秒に達するまで、および/またはイベントが10,000に達するまで、サンプルを60 μL/分で自動記録します(補足図2F)。
14. Mean FITCをCSVファイルとしてエクスポートし、データを分析します。
15. 毎日のクリーンオプションを使用してフローサイトメーターを洗浄します(補足図2G)。

6. LEDの輝度の最適化

1. マイクロコントローラースクリプトを編集して、目的のLED強度をテストします(補足コーディングファイル1、200-215行目)。
   メモ: マイクロコントローラスクリプトの値に対する同等の LED 強度は、他の場所で報告されています³⁸.異なるLEDを使用する場合、自己校正が必要になる場合があります。
2. スクリプトに表 2 の設計どおりに次の値が含まれていることを確認し、スクリプト (補足コーディング ファイル 1、200 行目から 215 行目) に次の値が含まれていることを確認し、コードをマイクロコントローラーにアップロードします。
3. 手順 1 から 5 を繰り返します。

以前の文献37、38、55のワークフロー要素を採用し、OptoPlate-96からのハイスループット同時照明を追加し、哺乳類細胞における光誘導性遺伝子発現システムを迅速に最適化するパイプラインを実証しました(図1)。

誘導性遺伝子発現システムの場合、絶対的なオン/オフ(リーキー)発現に加えて、高いダイナミックレンジが重要な性能マーカーです。トランスフェクト細胞の蛍光イメージングでは、光活性化細胞と暗所に保管された細胞の間のeGFP発現の違いを定性的に観察できます(図2)。1:9の比率は、5:5の比率と比較して、最大eGFP発現が目に見えて少なくなります。また、5:5の比率で漏れが増加していることも観察できます。構成的に発現するeGFP(CMV-eGFP)トランスフェクト細胞とトランスフェクトされていない細胞の蛍光イメージングは、トランスフェクション効率とシステムの誘導発現とリーキー発現をそれぞれコンテキスト化するための貴重なポジティブコントロールとネガティブコントロールです。蛍光イメージングを使用すると、ユーザーはブルーライトによる遺伝子発現のトランスフェクションと活性化の成功を迅速に確認および検証できるため、フローサイトメトリーの前に貴重なチェックポイントとなります。次に、フローサイトメトリーを使用して、平均蛍光強度(MFI)とダイナミックレンジを定量化できます。

細胞を光活性化した後、FACSバッファーで調製し、フローサイトメトリーで分析します。HEK293T細胞は約11〜15μmであり、その結果、FSCゲインは500、SSCゲインは125(補足図2C)になり、健康な細胞集団を中心に配置します。電圧が高いほど、健康な細胞集団ではなく破片の分析が行われます。私たちの実行は、最初の母集団ゲート(P1)で一貫して~60%以上のイベントを持っています(図3A-D)。健康な細胞集団がSSC-A対FSC-Aプロットのイベントの大部分を占めたら、イベントの密度をチェックして集団の大部分を特定することもできます(補足図3A)。次に、信頼性が高く再現性のある結果60,61にとって重要なSSC-H対SSC-Aプロットを通じてダブレット識別を実行できます。このシステムでは、一般に、P1でゲートされたイベントの95%以上が一重項であることがわかりました(図3A-D)。SSC-A対FITC-Aプロットでは、トランスフェクションされていない細胞は一般にプロットの中心の左側にあり、集団<0.1%)を持つようにゲートされます(図3A)。次に、eGFP陽性細胞がトランスフェクトされていないサンプルで空だったゲートに移住し、MFIの単一細胞分析測定を行います(図3B)。ネガティブコントロールとポジティブコントロールを収集して適切なゲートと電圧を設定すると、2pLACEを含むサンプルを同じゲートを使用して分析し、自家蛍光セルを確実に除外できます(図3C、D)。ここで、eGFP陽性細胞の集団の割合は、CMV-eGFPで~99%、2pLACEトランスフェクト細胞で~57%でした。PE-Aチャネルで最終ゲートを使用して、蛍光性の高い細胞を確実に捕捉することもできます(補足図3B)。

テストに選択された別の比率は 3:7 でした。検証ステップとして、フローサイトメトリーの前に蛍光顕微鏡画像を撮影し、CMV-eGFPよりも少ないと予想される2pLACEによるeGFP発現の誘導のためのトランスフェクションの成功を観察しました(図4A)。2pLACEのフローサイトメトリーデータを収集した後、青色光活性化遺伝子発現をリーキー遺伝子発現と比較できます(図4B)。ステップ3.1にリストされている設定を使用すると、顕微鏡で定性的に見られる蛍光シグナルの増加と一致して、ブルーライトの活性化後の発現の~3倍の増加を観察することができました。さらに、トランスフェクション効率は、健康な単一細胞の~60%で%eGFP陽性集団、または親パーセントを測定することによって間接的に確認できます(図4C)。

このプロトコル全体を実装することで、最大ダイナミックレンジと調整可能な発現を実現するための最適な質量比(図5A)と光強度(図5B)を特定できます。質量比が6:4未満ではダイナミックレンジが大きくなり(3.5〜4.5)、質量比が6:4を超えると、バックグラウンドの増加と最大eGFP発現の減少によりダイナミックレンジの減少が示されました。最大の表現と高いダイナミックレンジの両方のために、3:7の比率が好ましい。3:7未満の比率は同様の倍数誘導を示しましたが、全体的な最大発現は低かったです。以前に校正された光強度値38 (表2)を使用して、さまざまな光強度に関する遺伝子発現レベルを特徴付けることができます。光強度はeGFPの発現レベルも制御し、MFIは~3 mW / cm2で飽和します。これを超える光強度は、~9および11 mW / cm2で見られるように、一部のサンプルの光退色が原因で、MFI値が変化する可能性があります。

図1:光遺伝学的システムをテストするハイスループット実験の一般的なパイプライン。 細胞を黒色の96ウェルプレートに24時間播種します。次に、DNAとトランスフェクション試薬の12分間のインキュベーション期間で細胞をトランスフェクトします。トランスフェクションの24時間後、プレートをOptoPlate-96上に置いてブルーライトを活性化します。青色光活性化の所望の持続時間の後、細胞はフローサイトメトリーのために赤色光環境で調製されます。フローサイトメトリーデータは、暗闇またはブルーライトで処理されたeGFP陽性細胞の平均蛍光強度グラフとして表されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:HEK293T細胞におけるオンおよびオフ状態の2pLACEの代表的な蛍光顕微鏡画像。 CRY2-eGFP:CIBN-gRNAの異なる質量比をeGFP発現レベルについてテストしました。細胞をブルーライト(ON)にさらすか、暗闇に24時間保持(OFF)しました。スケールバーは100μmを表します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:トランスフェクトされていない(UT)、CMV-eGFP、および2pLACE HEK293T細胞の代表的なフローサイトメトリー散布図。 フローサイトメトリーは、プレートローダー機能を使用して実行されました。(A)HEK293T細胞は、前方散乱(FSC-A)および側面散乱(SSC-A)に基づいてゲートされました。SSC-AとFSC-Aプロットのイベントの集中は、等高線プロット(補足図3A)を使用して視覚化でき、健康な集団のゲーティングを支援します。ダブレット識別は、線形ゲートを使用してSSC-H対SSC-Aプロットで実行されました。最終的なプロットは、トランスフェクションされていないサンプルを参照することにより、ゲート蛍光細胞をプロットしました。(B)細胞は(A)のようにゲートされ、蛍光集団と蛍光強度が統計表に示されました(補足図2B)。(C,D)2pLACEトランスフェクト細胞をP3ゲートを介して別々にゲート化しました。マゼンタ集団は、すべてのeGFP陽性細胞を表します(補足図3B)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:HEK293T細胞における光誘発性eGFP発現の定性的および定量的分析。 (A)2pLACEまたはCMV-eGFPプラスミドのいずれかでトランスフェクトされたHEK293T細胞の蛍光顕微鏡画像。(B)青色光または暗い条件下で維持された細胞におけるeGFPの平均蛍光強度(MFI)の定量化。(C)フローサイトメトリーゲーティング分析によって測定されたeGFP陽性細胞の割合。ゲーティングの結果、トランスフェクトされていない細胞の<0.1%がeGFP陽性閾値内に収まりました。フローサイトメトリーデータは平均値を表し、エラーバーは4つの技術的反復からの標準偏差を示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図5:2pLACEの代表的な質量比と青色光強度のフローサイトメトリー。 (A)CRY2-eGFP:CIBN-gRNAのさまざまな質量比をHEK293T細胞にトランスフェクトし、プロトコルのステップ3で報告したのと同じ設定を使用して、青色光にさらすか、暗所に保管しました。各条件は、3つの生物学的反復の平均です。(B)青色光強度の関数としての遺伝子発現の代表的な傾向。各条件は、6つの技術的反復の平均です。平均蛍光強度は、eGFPを発現する細胞のフローサイトメーターゲーティングによって定量化されます。すべての誤差バーは標準偏差を表します。プラスミド比については、プラスミド比の明暗を比較する一元配置 t 検定 を使用して MFI 統計的有意性を計算しました。光強度については、暗い (OFF) 状態と比較して、一元配置分散分析と Tamhane の T2 事後検定を使用して統計的有意性が計算されました。*p < 0.05、**p < 0.01、***p < 0.001、****p <0.0001、*****p < 0.00001 および ns は有意ではありません。この図は、Garimella et al.38から適応されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

表1:サンプル濃度を使用したウェルあたりのCRY2-eGFPおよびCIBN-gRNAプラスミドの量。 体積量はウェルごとであり、実験でのサンプルまたは反復の数に基づいて変更できます。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

表2:ブルーライト強度の推奨値。コードは 、補足コーディングファイル1 (215-228行目)にあります。等価強度値は、光パワーメーターを使用して以前に報告された校正データを使用して計算されます。各強度レベルには 6 つのテクニカル レプリケートがあります。行GおよびHは、CMV-eGFPおよびトランスフェクトされていないコントロールウェル用です。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図1:プロトコルのステップ5.1〜5.5。 (A) システム起動プログラムの実行(B)蛍光色素ビーズを用いた品質管理の標準化。(C)チューブサンプリングからプレートローダーモードへの切り替え。(D)サンプルウェルとしてラベル付けするウェルの選択。この例では、35 のウェルが選択されました。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図2:プロトコルのステップ5.6〜5.14。 (A)光散乱プロットの設定:健康な細胞集団ゲーティングのためのFSC-A対SSC-A、ダブレット識別のためのSSC-A対SSC-H、自家蛍光およびeGFP陽性細胞のゲーティングのためのSSC-A対FITC-A。(B) 平均蛍光強度を測定するための FITC-A データを取得するための統計テーブルを設定します。(C) [表示するイベント] タブで停止ルールを強調表示します。サンプルの流速を遅くし、プレートを排出してロードし、フローサイトメータープローブを初期化し、取り込み電圧を調整します。(D)図のように、各人口をゲートするポリゴンを作成します。(E)適切な数の井戸を追加します。(F) 設定とゲートが完了したら、 自動録画 をクリックします。(G) すべてのサンプルが収集され、統計がエクスポートされたら、 毎日の清掃 をクリックします。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足図3:P4(マゼンタ)の緑色のイベントで視覚化された、キャプチャされたゲート内のすべての細胞の検証。 (A) eGFP 陽性集団ゲート内の健康な集団の等高線プロット (P3)。細胞は主に赤いゾーンに集中し、外側に減少します。(B)P4をゲーティングするためのSSC-A対PE-Aプロットは、すべての蛍光イベントがFITC-Aプロットで説明されていることを確認するための追加のチェックを提供します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足コーディングファイル1:上記のプロトコルで説明されているすべてのプロパティを実装するArduinoコードの例。このファイルは、 表2の推奨LED強度値を使用して、すべてのLED位置をアクティブにします。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

著者らは、競合する利益はないと宣言している。