方法論記事

哺乳類の遺伝子発現を制御するための光誘導システムの迅速な最適化

DOI：

10.3791/68779

⸱

2025年11月4日

 ,  ,  , 
1Department of Chemical Engineering, University of California, Davis, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, University of California, Davis

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究では、3DプリントされたLEDアレイを用いたハイスループット実験を行い、HEK293T細胞における光誘導性遺伝子発現を最適化する方法を紹介します。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

誘導性遺伝子発現ツールは、人間の健康やバイオテクノロジーに新たな応用をもたらす可能性がありますが、現在の選択肢は高価で元に戻すのが難しく、望ましくないオフターゲット効果をもたらすことがよくあります。光遺伝学的システムは、光応答性タンパク質を使用して調節因子の活性を制御し、「スイッチを切り替える」だけで発現を制御します。この研究は、哺乳類の遺伝子発現の調整可能、可逆的、正確な制御を提供する、簡素化された光活性化CRISPRエフェクター(2pLACE)システムを最適化します。OptoPlate-96は、フローサイトメトリー による ハイスループットスクリーニングを可能にし、シングルセル解析と2pLACEの迅速な最適化を実現します。この研究では、HEK293T細胞でOptoPlate-96と2pLACEシステムを使用して、ダイナミックレンジを最大化するための最適な成分比を特定し、青色光強度応答曲線を見つける方法を示します。同様のワークフローは、他の哺乳類細胞や他の光遺伝学的システムや光の波長についても開発できます。これらの進歩により、バイオ製造用途向けの光遺伝学ツールの精度、拡張性、適応性が向上します。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

誘導性遺伝子発現システムなどの合成生物学ツールは、生物学研究に多大な貢献をしてきました。遺伝子発現を調整可能、可逆的、かつ正確な方法で調節する能力は、タンパク質産生1,2,3,4,5,6、細胞形態7,8,9,10,11,12、代謝経路13,14,15の制御を改善することができます、16、17、18、およびバイオ製造および治療用途のその他のターゲット。化学的誘導性システムは、残留19,20またはオフターゲット効果を持つ可能性があります。化学添加剤はまた、追加の下流精製プロセスのために非常に高価であり、工業的にスケールアップすることが困難である可能性があります21,22,23。光誘導性遺伝子発現システムは、バイオ製造の実践にスケーラブルで正確な方法を提供できます24,25,26,27。

多くの光誘導性遺伝子発現システムは、様々な用途において有用な合成生物学ツールとして開発されており、28、29、30、31、32、33、34、35、36、青色35、37、38、赤/遠赤12、39、40、または緑色の41ライト。CRISPRベースの光遺伝学的遺伝子調節の場合、送達される個々のガイドRNA(gRNA)の量を変更すると、内因性遺伝子42のmRNA発現に影響を与える可能性があり、さまざまな細胞株に最適化する必要があります。VP64 37,42,43,44、VP16 39,40,44,45,46、p65 44、またはそれらの融合47などのトランス活性化タンパク質も使用でき、光遺伝学的システムのモジュール性を高める。複雑で絡み合った生物学的経路12,40,48,49,50,51,52,53を調査するために、これらの既知の成分のさまざまな組み合わせをテストできます。さらに、異なる細胞株は、同じシステム52で誘導に違いを示すことができる。誘導レベルが異なると、遺伝子発現の正確な制御における遺伝子発現や感度が不十分になる可能性があり、新規またはより生物学的に関連性の高い細胞株で最適な光遺伝学的システムを見つけるには厳密なテストが必要です。光遺伝学的遺伝子調節のペースが速くなり、適用範囲が広がるにつれて、これらのさまざまなシステムを迅速に特徴付けることが不可欠です。

光遺伝学的ツールを特徴付ける現在の方法は、遺伝子の安定発現または一過性発現のいずれかを使用します12,54。安定して発現する細胞株を生成し、最大限に発現するためにシステムダイナミクスを最適化することは、時間がかかり、したがってコストがかかる場合があります。一過性発現により、特に多成分光遺伝学システムをテストする場合に、迅速かつ貴重な洞察が得られます。ここでは、クリプトクロム2(CRY2)とクリプトクロム相互作用する塩基性ヘリックスループヘリックスN末端(CIBN)で構成される青色光活性化CRISPR-dCas9エフェクター(LACE)37システムを使用しました。これは、HEK293T(ヒト胚性腎臓細胞)37,38、CHO-DG44(チャイニーズハムスター卵巣細胞)55、およびC2C12(マウス筋芽細胞)38などの哺乳類細胞における遺伝子発現を制御するために使用されています。そのモジュール性は、過渡発現およびハイスループット法によるシステム性能の迅速な特性評価に最適です。たとえば、LACEのような多成分システムでは、誘導を改善するために質量比の最適化が必要になる場合がありますが、これは光遺伝学的システムの特性評価では通常採用されないステップです。

このプロトコルは、2つのプラスミドLACE(2pLACE)38システムの迅速な最適化と特性評価を詳述しています。このセットアップでは、2pLACEは、HEK293T細胞における蛍光レポーターであるeGFP(増強された緑色蛍光タンパク質)の発現を制御します。活性化は、Lukasz Bugajらによって設計および構築された3DプリントされたLEDアレイであるOptoPlate-96を使用して、黒色のガラス底96ウェルプレートで実行されます56,57,58,59。このプロトコルは、2プラスミドシステムの異なる質量比で最大発現を特に最適化します。また、さまざまな光強度を制御して、システムの調整可能性とそのフルダイナミックレンジを調査するためのユーザーフレンドリーなコードも含まれています。フローサイトメトリーは、データの収集と分析に使用されます。LEDアレイ用のプラスミド構築物および3Dプリンティング材料を生成するためのプロトコルは、以前の出版物54,56に記載されています。これらの方法は、光誘導性遺伝子発現システムを特徴付けるための迅速でハイスループットなパイプラインを強調しています。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 96ウェルフォーマットのHEK293T細胞のプレーティング

  1. バイオセーフティキャビネットに、漂白剤廃棄物容器、血清ピペット、ピペットエイド、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)、10%ウシ胎児血清(FBS)を含むダルベッコ修飾イーグル培地(DMEM)、およびコンフルエントHEK293T細胞を含むT-75細胞培養フラスコを回収します。培地を37°Cに予熱します。
  2. T-75フラスコで、倒立顕微鏡でコンフルエントが約80%〜100%コンフルエントであることを確認します。
  3. バイオセーフティキャビネットで、血清学的ピペットを使用して、細胞培養フラスコから使用済み培地を吸引します。フラスコの表面やプラスチックに触れないようにしてください。使用済み培地と吸引器は廃棄物容器に廃棄してください。
  4. 約10 mLのDPBSをフラスコの隅に吸引し、表面の周りを穏やかに旋回させることにより、細胞を優しく洗浄します。フラスコからDPBSを吸引し、洗浄液と吸引器を廃棄物容器に廃棄します。
  5. 1.5 mLの0.05%トリプシン-EDTAを加えてフラスコの表面を覆い、室温で1分間インキュベートします。フラスコを軽くたたいて、表面から細胞をほぐします。
  6. 8.5 mLの新鮮なDMEMをフラスコに加えます。上下に吸引してすべての凝集体が破壊されるまで、血清学的ピペットで細胞を再懸濁し、混合します。
  7. 9 mLの細胞懸濁液を15 mLのコニカルチューブに集めます。
    1. 9 mLの新鮮なDMEMをフラスコに加え、37°C、5%CO2のインキュベーターに入れます
  8. 血球計算盤を使用して、10 μLの懸濁細胞と10 μLのトリパンブルー色素を1:1の比率で混合し、細胞の濃度を計算します。この値を使用して、プレートに播種するのに十分な細胞を準備します。
  9. 高性能#1.5黒色96ウェルガラス底板の各ウェルに~35,000細胞を100 μLに播種し、37°Cおよび5%CO2 のインキュベーターに24時間置きます。

2. 2pLACEトランスフェクションの最適化

  1. 1ウェルと10%の過剰分については、11 μLの温かい無血清DMEM(SFM)を1.5 mLの微量遠心チューブに分注します。
  2. CRY2-eGFPを使用して:CIBN-gRNAプラスミド質量比を1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、および9:1に等しく、SFMのアリコートにトータルDNAのウェルごとに110 ngをアリコートします(表1)。
  3. ポジティブコントロールとして、同じ質量のCMV-eGFPプラスミドをSFMの異なるアリコートにアリコートします。
  4. 各ウェルについて、トランスフェクション試薬希釈のために11 μLのSFMをアリコートします。
  5. DNAとトランスフェクション試薬の質量(μg)と体積(μL)の比率を1:3でトランスフェクション試薬を調製します。
  6. 希釈したDNAに希釈したトランスフェクション試薬を加え、室温で12分間インキュベートしてトランスフェクション複合体を作成します。
  7. ~20 μLのトランスフェクション複合体を各ウェルに加えます。井戸の壁に触れないように注意してください。
  8. プレートをアルミホイルで包み、37°Cおよび5%CO2 のインキュベーターに24時間置きます。

3. 2pLACEの活性化

  1. これらの設定を使用して、マイクロコントローラーの入力コードを変更して、目的のウェルを照らします(補足コーディングファイル1、147行目から158行目)。
    1. LEDの輝度:9.27 mW/cm2 (補足コーディングファイル1、200行目〜215行目)。
    2. パルス長:1秒(補足コーディングファイル1、280行目〜290行目)。
    3. パルス周波数:0.067 Hz(15秒ごと)(補足コーディングファイル1、264行目〜278行目)。
      メモ: 波長の設定は、取り付けられている LED の種類によって決まります。
  2. OptoPlateの3Dプリントされた蓋に70%エタノールをスプレーし、バイオセーフティキャビネットで乾燥させます。
  3. 暗室の赤色光ランプを点灯し、96ウェルプレートをバイオセーフティキャビネットに入れ、乾燥させた3Dプリントされた蓋に蓋を交換します。
    注:オプションで、蛍光顕微鏡を使用してCMV-eGFP細胞を表示し、トランスフェクション効率を推定できます。
  4. 96ウェルプレートを取り、LEDアレイに置き、LEDアレイ装置を構築します。プレートが所定の位置にカチッとはまりていることを確認します。
  5. マイクロコントローラ、LED、およびファンポートを電源に接続します。
  6. ワイヤーに70%エタノールを慎重にスプレーし、拭いて乾かします。
  7. LEDアレイ装置を37°Cおよび5%CO2 のインキュベーターに24時間入れます。インキュベーターが密閉されているときに、LEDが意図したとおりに点灯し、ワイヤーがピンと張っていないことを確認してください。

4. フローサイトメトリーの調製

  1. 赤信号環境では、OptoPlateを取り出し、プレートをバイオセーフティキャビネットに入れます
    注:オプションで蛍光顕微鏡で細胞を観察して、光誘導を視覚的に確認することができます。
  2. 各ウェルからすべての培地を慎重に吸引します。
  3. 30 μLの0.05%トリプシン-EDTAを使用して細胞を分離し、室温で1分間インキュベートします。
  4. 各ウェルを100 μLのコールドFACSバッファー(PBS中の1%FBS)と単細胞化するまで混合します。
  5. 各サンプルをV底96ウェルプレートに移します。
  6. V底96ウェルプレートを室温で164 x g で10分間遠心分離します。
  7. ペレットを乱すことなく80 μLの上清を吸引します。
  8. 200 μLのコールドFACSバッファーを加えてペレットを再懸濁します。
  9. V底96ウェルプレートをアルミホイルで包み、軽く断熱します。
  10. プレートを氷の入った発泡スチロールの箱に入れて輸送します。

5. フローサイトメトリーのゲーティングとデータ収集

  1. 背面のスイッチを使用してフローサイトメーターの電源を入れ、コンピューターでそれぞれのフローサイトメトリーソフトウェアを開きます。
  2. システム起動プログラムを実行し、サンプルローダーに2 mLのDI水をロードします(補足図1A)。
  3. 付属のQCビーズを使用して品質管理(QC)を実行します(補足図1B)。
  4. フローサイトメーターがプレートサンプリングモードになっていることを確認します(補足図1C)。
  5. サンプルウェルをセットアップして指定します(補足図1D)。
  6. 次の散布図と表を作成します(補足図2A)。
    1. サイドスキャッター(SSC-A)とフォワードスキャッター(FSC-A)。
    2. SSC-HとSSC-A。
    3. SSC-A と FITC-A。
    4. FITC-A 統計表 (補足図 2B)。
  7. Vボトムプレートをサイトメーターのプレートローダーにはめ込みます。
  8. トランスフェクションされていないウェルを選択し、[初期化]をクリックしてから、[実行]をクリックします。体積サンプルレートが10 μL / minであることを確認します(補足図2C)。
  9. SSCおよびFITC電圧を調整して、SSC-A対FSC-Aプロットの中心に関心のある母集団を配置します(補足図2C)。
    1. 目的の健康な細胞集団をゲートするポリゴンを作成します(補足図2D)。
    2. SSC-HとSSC-Aのプロットでダブレット識別をゲートするポリゴンを作成します。
    3. FITC電圧を調整して、トランスフェクションされていない細胞をSSC-A対FITC-Aプロットの左側に配置します(補足図2D)。
  10. 残りのトランスフェクトされていないウェルについて繰り返し、Mean FITC-Aデータを記録します。
  11. CMV-eGFPトランスフェクトウェルを選択し、[実行]をクリックします。
  12. FITC電圧を調整して、SSC-AとFITC-Aのプロットで自家蛍光細胞と蛍光細胞の両方をキャプチャします。
    1. トランスフェクトされていない細胞の初期ゲートを参照しながら、蛍光細胞を非蛍光細胞に対してゲートするポリゴンを作成します(補足図2E)。
  13. 200秒に達するまで、および/またはイベントが10,000に達するまで、サンプルを60 μL/分で自動記録します(補足図2F)。
  14. Mean FITCをCSVファイルとしてエクスポートし、データを分析します。
  15. 毎日のクリーンオプションを使用してフローサイトメーターを洗浄します(補足図2G)。

6. LEDの輝度の最適化

  1. マイクロコントローラースクリプトを編集して、目的のLED強度をテストします(補足コーディングファイル1、200-215行目)。
    メモ: マイクロコントローラスクリプトの値に対する同等の LED 強度は、他の場所で報告されています38.異なるLEDを使用する場合、自己校正が必要になる場合があります。
  2. スクリプトに表 2 の設計どおりに次の値が含まれていることを確認し、スクリプト (補足コーディング ファイル 1、200 行目から 215 行目) に次の値が含まれていることを確認し、コードをマイクロコントローラーにアップロードします。
  3. 手順 1 から 5 を繰り返します。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

以前の文献37、38、55のワークフロー要素を採用し、OptoPlate-96からのハイスループット同時照明を追加し、哺乳類細胞における光誘導性遺伝子発現システムを迅速に最適化するパイプラインを実証しました(図1)。

誘導性遺伝子発現システムの場合、絶対的なオン/オフ(リーキー)発現に加えて、高いダイナミックレンジが重要な性能マーカーです。トランスフェクト細胞の蛍光イメージングでは、光活性化細胞と暗所に保管された細胞の間のeGFP発現の違いを定性的に観察できます(図2)。1:9の比率は、5:5の比率と比較して、最大eGFP発現が目に見えて少なくなります。また、5:5の比率で漏れが増加していることも観察できます。構...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このプロトコルは、哺乳類細胞における多成分一過性遺伝子発現の光遺伝学的制御を実証し、他の研究者が蛍光レポーターを使用してモジュール式光遺伝学的システムを迅速かつ同時に特徴付けることを可能にします。

この場合、2プラスミド光誘導系は、HEK293T細胞におけるeGFPの発現に最適化されました。コトランスフェクションを成功させるには、最高のトランスフェクション効率を得るためにシーディング密度と質量比を最適化することが不可欠です。これは、コンフルエンスが分化を誘発する可能性があり62、63、64、細胞培養が均一でない場合、データ分析に不整合をもたらす幹細胞培養でこれを実装する場合に特に重要です。細胞の幹性が維持されている場合は、培地組成物も細胞65、

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは、競合する利益はないと宣言している。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この研究は、NASA協力協定NNX16AO69Aを通じてトランスレーショナルリサーチインスティテュートとグッドフーズインスティテュートによって支援されています。このプロジェクトは、カリフォルニア大学デービス校フローサイトメトリー共有リソース研究所の支援を受け、ブリジット・マクラフリン、ジョナサン・ヴァン・ダイク、アシュリー・カラジェの技術支援を受け、NCI P30 CA093373 (総合がんセンター) および S10OD018223 (ベックマン コールター "サイトフレックス" サイトメーター) からの資金提供を受けました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
1.5 mLマイクロ遠心分離機チューブVWR10025-724
10 mL試薬貯蔵庫VWR77395-252
10 mL 血清学ピペットVWR75816-100
1000 & mu;Lフィルターの先端VWR76322-154
15 mL  高性能遠心分離機チューブ、フラットキャップVWR89039-664
1931-C光パワーメーターニューポート1931-C
2 mL 血清学ピペットVWR75816-104
20 & mu;Lフィルターの先端VWR76322-134
200 & mu;Lフィルターの先端VWR76322-150
50 mL 高性能遠心分離機チューブ、フラットキャップVWR89039-656
96ウェルVボトムプレートブランドプレート781661
A21、LED赤い電球ブルーックス電球該当なし赤色光源
Arduino IDEソフトウェアArduino該当なし
バイオセーフティキャビネット、クラスIIヌアイレ該当なし
ブライトライン血球計ハウサー・サイエンティフィック3110
細胞計数スライドバイオラッド1450016
細胞培養プレート 96ウェル、#1.5H ガラス底板セルヴィスP96-1.5H-N
CytExpertソフトウェアベックマン・カウルター該当なし
CytoFLEX レディトゥユース デイリーQC蛍光球ベックマン・カウルターC657194 & deg;C
CytoFLEX-S フローサイトメーター(バイオレット4、ブルー2、イエローグリーン4、レッド3チャンネル)ベックマン・カウルターC09766
ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水粉末、カリカムもマグネシウムもなしフィッシャー・サイエンティフィック21600069室温
エッペンドルフ遠心分離機5804エッペンドルフ 022622501V字底板遠心分離機ステップ
エッペンドルフ遠心分離機 5810Rエッペンドルフ22625501
エッペンドルフ・リサーチプラス、8チャンネル、可変音量、30 - 300 & mu;Lエッペンドルフ3125000052
エッペンドルフ・リサーチプラス、シングルチャンネル、可変音量、100 - 1000 & mu;Lエッペンドルフ3123000063
エッペンドルフ・リサーチプラス、シングルチャンネル、可変ボリューム、2 - 20 & mu;Lエッペンドルフ3123000039
エッペンドルフ・リサーチプラス、シングルチャンネル、可変ボリューム、20 - 200 & mu;Lエッペンドルフ3123000055
汎用ラボラベリングテープVWR89097-920
Gibco DMEM、粉末、高グルコースフィッシャー・サイエンティフィック121000614 & deg;C
Gibco Trypan Blue Solution、0.4%フィッシャー・サイエンティフィック15-250-061室温
Gibco Value Heat Inactivated FBSフィッシャー・サイエンティフィックA5256901-20 & deg;C
Gibco、トリプシン-EDTA(0.05%)、動物由来のEDTA、1X、フェノールレッド、500mLギブコ25300062-20 & deg;C
HEK293T 細胞ATCCCRL-11268-80 & deg;C、液体窒素
ラボマーカー、ミクロノヴァVWR89205-944
金属製デスクランプシンプルなデザイン該当なし赤い光用のランプ
オプトプレート-96LABメーカー該当なし
ピペットエイドXPドラモンド4-000-101
プラスミド:CIBN-gRNA該当なし該当なし-20 & deg;C
プラスミド:CMV-eGFP該当なし該当なし-20 & deg;C
プラスミド:CRY2-eGFP該当なし該当なし-20 & deg;C
PolyJet DNA in vitro トランスフェクション試薬フィッシャー・サイエンティフィックNC15361174 & deg;C
T-75細胞培養フラスコVWR10062-860
ウォータージャケット式CO2インキュベーターVWR10810-884

参考文献

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